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北京地区流行性腮腺炎野病毒与疫苗病毒基因特征比较
目的 比较北京地区流行性腮腺炎病毒流行株和疫苗株的基因特征,初步分析疫苗效果不佳的原因.方法 通过病例免疫史分析、病毒分离鉴定、SH基因序列分析,与其他基因型参考株进行同源性比较及血凝素-神经氨酸酶(HN)基因氨基酸关键位点变异分析.结果 病毒分离阳性病例共38例,其中IgM阴性7例.在2007和2008年,病毒分离率、RT-PCR阳性率、IgM抗体阳性率都有明显下降,同时有免疫史的病例增多.实验证明无免疫史的病例病毒分离和IgM抗体阳性率更高.38株病毒均属于F基因型,疫苗株属于A基因型.SH基因流行株之间核苷酸大差异为5.6%,与疫苗株的差异为16.0%～18.1%.部分北京株SH蛋白中保守的疏水性氨基酸发生变化,如第8位:6株L→F.各流行株之间FIN蛋白氨基酸序列大差异为2.3%,与疫苗株差异为4.2%～5.3%.在HN上决定交叉中和能力的氨基酸位点,北京株与疫苗株存在差异,如在354位和356位,所有北京株与疫苗株都不同.北京株在HN上的N-糖基化位点也和疫苗株存在差异,如在464～466位置上为NCS,疫苗株为NCR.另有18个未知功能的氨基酸位点,所有北京株与疫苗株不同.结论 近年北京地区流行的腮腺炎病毒优势株为F基因型,未发现基因型间变异,已存在较大型内差异.北京株和疫苗株在SH和HN蛋白上都存在较大差异.
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S79株流行性腮腺炎病毒不同代次的序列研究
目的 观察流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)S79株各代病毒的蛋白基因在传代过程中是否发生变化,对比S79株主代病毒(S79-1-3)、蚀斑纯化病毒(S79-1-P7-3③)及ME(Enders株)病毒的基因差异.方法 S79株主代病毒及蚀斑纯化病毒在原代鸡胚细胞(CEC)上连续传递12代,观察每代病毒培养特性及高变区SH基因序列,又选择其中的CEC5、6、10、15代,以及在鸡胚尿囊腔中传代的ME株病毒,测定各个主要基因序列(N、NS1/P、M、F及HN基因),对核苷酸序列和它相应的氨基酸序列以及基因差异进行计算机分析.结果 S79株主代病毒及其蚀斑纯化病毒在CEC上连续传递12代,其培养特性、致细胞病变(CPE)及病毒滴度基本稳定.S79株主代病毒及其蚀斑纯化病毒与ME株病毒同属A基因型.S79株疫苗各个代次之间高变区SH基因未见突变.S79株的5、6、10、15代病毒在各个主要基因区域有散在基因的有意义突变比例极低.S79-1-3中不同亚株之间的比例可能会随传代而发生变化,比较认为经过蚀斑纯化的S791-1P7-3③株在传代中较S79-1-3株更为稳定.结论 S79株病毒与文献报道的JL2株十分相似,经连续传代总体的核苷酸差异＜0.5%.S79-1-3主代病毒在药典规定代次范围内甚为稳定.经纯化的各代S79病毒则更为稳定,从分子水平上提示其在CEC15代内都可作为工作代毒种使用.
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浙江省宁波市2016年流行性腮腺炎病毒基因型特征分析
目的 了解宁波市2016年流行性腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV)基因型特征.方法 采用Vero/SLAM细胞分离MuV,对MuV毒株小疏水蛋白(Small hydrophobic protein,SH)基因进行逆转录-聚合酶链反应扩增和序列测定,与GenBank中参考株序列进行比较.结果 宁波市2016年共分离到5株MuV,均为F基因型,核苷酸及氨基酸之间同源性分别为95.07％和94.74％;与F基因型参考株Z77161同源性分别为96.42％-97.09％和94.74％-96.49％;与中国疫苗株S79同源性分别为80.66％-81.52％和73.68％-75.44％;与中国其他地区F基因型之间同源性分别为95.05％-97.42％和91.23％-96.49％.结论 2016年宁波地区MuV流行株均为F基因型,未发现SH基因变异.
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吉林省首次分离的流行性腮腺炎野病毒及基因型鉴定
目的 对吉林省2008年一起流行性腮腺炎(腮腺炎)爆发疫情进行病原学监测,观察是否出现典型的致细胞病变效应(cytopathic Effect,CPE),并进行病毒核酸和基因型鉴定.方法 采集病人的咽拭液,接种于生长良好的Vero/SLAM细胞(淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞),观察是否出现CPE,对三代病毒分离液采用逆转录-聚合酶链反应进行核酸鉴定,采用序列分析进行基因型鉴定.结果 在采集到的15份标本中,有3份标本在Vero/SLAM细胞上可见到三种不同的典型CPE,6份标本核酸扩增为阳性,序列分析结果显示均为F基因型.结论 在同一起爆发中,由同一株腮腺炎病毒引起的不同腮腺炎病例,虽然核苷酸序列完全一致,但所分离出的病毒在Vero/SLAM细胞上可表现为非常明显的不同类型的CPE.
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SYBR Green荧光逆转录-聚合酶链反应检测流行性腮腺炎病毒基因
目的 建立SYBR Green荧光逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transeription-Polymerase Chain Reation,RT-PCR)方法,用于检测流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(Mumps Virus,MuV)基因.方法 针对MuV小疏水蛋白(SmallHydrophobic Protein,SH)基因保守区域设计特异性引物.优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件;并应用该方法对5株MuV进行基因检测.结果 SYBR Green荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性和特异性,与其它呼吸道病毒均无交叉反应;检测敏感性为10 TCID50/0.2ml.SYBR Green荧光RT-PCR与传统RT-PCR检测MuV的敏感性相同,但大大缩短了检测时间.并可通过对SYBR Green荧光RT-PCR产物直接测序分析,进行基因型别鉴定.结论 SYBR Green荧光RT-PCR方法具有特异、敏感、快速等特点,为MuV的早期快速检测和基因型快速鉴定提供了一种新的检测技术.
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中国2006～2008年流行性腮腺炎病毒的基因特征分析
目的 分析中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同)2006～2008年流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(Mumps Virus,MuV)的基因特征.方法 针对中国2007～2008年分离到的7株MuV小疏水蛋白(Small Hydro-phobic Protein,SH)基因316个核苷酸片段进行逆转录-聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增,并对该PCR产物进行序列测定,结合从基因库下载的7株2006年中国MuV毒株序列以及世界卫生组织(WHO)MuV基因型参考株一起进行分子流行病学研究.结果 通过比较核苷酸和氨基酸同源性和构建亲缘关系树发现,中国2006～2008年14株MuV分离株同属F基因型,但序列相互间存在差异.不同省份、不同年代的MuV毒株在亲缘关系树上呈分散交叉分布,无明显的时间和地理分布倾向.此外,通过分析2006～2008年MuV的组内和组间遗传距离发现,2006～2008年的MuV毒株序列无明显规律性变化.与序列同源性和亲缘关系树分析结果一致.结论 中国2006～2008年流行的MuV同属F基因型,是由F基因型MuV的多个传播链引起的.并且1995年和2006～2008年的MuV毒株间序列差异较大,说明1995～2008年中国流行的MuV发生了一定程度的变异.另外,还发现F基因型MuV在SH基因上存在着特异性突变(CNt65、CNt105,GNt137、CNt192、CNt239),而其它基因型MuV在这些位点上均未发生改变.
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流行性腮腺炎病毒疏水蛋白基因一步法逆转录-聚合酶链反应检测方法的建立
目的 建立一种简便、快速的鉴定流行性腮腺炎病毒(Mumps Virus,MuV)基因的方法,即一步法逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR).方法 在MuV小疏水蛋白(Smallhydrophobin Protein,SH)基凶两端设计引物,同时对所建立的一步法RT-PCR方法进行敏感性和特异性实验.结果 一步法RT-PCR方法至少能检测出MuV100.7TCID50(Median Tissue Culture Infective Dose,50%组织培养感染剂量),5株MuV均呈阳性,而4株非MuV呼吸道病毒RT-PCR结果均未见阳性条带.结论 一步法RT-PCR是一种快速、简便的鉴定MuV SH基因的方法.
关键词： 流行性腮腺炎病毒 小疏水蛋白基因 一步法逆转录-聚合酶链反应 敏感性 特异性 -
一起流行性腮腺炎爆发的血清学诊断和基因型别鉴定
目的 对一起流行性腮腺炎(腮腺炎)爆发进行血清学证实,鉴定引起病毒性脑膜炎的腮腺炎病毒基因型别.方法 用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测临床诊断为腮腺炎患儿的血清和脑膜炎病人脑脊液(CSF)标本中的IgM抗体;从脑膜炎病人CSF标本中提取核糖核酸(RNA),用逆转录-套式聚合酶链反应(RT-Nest-PCR)方法扩增病毒小疏水蛋白(SH)基因255个核苷酸片段;序列测定结果与GenBank的8个基因型代表株做亲缘性关系树分析.结果 15份血清中11份腮腺炎IgM阳性,5份CSF中2份IgM阳性.5份CSF标本中2份PCR扩增产物阳性.SH基因序列测定和分析表明该2株病毒为F基因型,与1995～1996年中国流行的腮腺炎野病毒基因型一致.结论 此次疫情是由F基因型腮腺炎病毒引起的腮腺炎爆发,部分病例合并有病毒性脑膜炎.
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流行性腮腺炎病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立
目的 建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),用于检测流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)核酸.方法 针对MuV血凝素(H)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、灵敏度与准确性;并通过体外克隆技术建立MuV基因拷贝数定量分析模型.结果 引物与探针的优化浓度分别为880mmol/L和280mmol/L,具有良好的保守性和特异性,与其它呼吸道病毒均无交叉反应;方法检测灵敏度为10拷贝/反应,相当于0.01TCID50,标准曲线线性范围为107～10拷贝/反应;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好.结论 TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,为MuV的早期快速检测提供了一种新的检测技术.
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福建省一起流行性腮腺炎爆发的病毒分离及基因特征分析
目的 对福建省一起流行性腮腺炎(腮腺炎)爆发疫情进行病毒分离,了解其基因特征.方法 应用非洲绿猴肾细胞分离病毒,逆转录-聚合酶链反应扩增小疏水蛋白(Small Hydrophobic Protein,SH)基因片段,测序并分析其基因特征.结果 从爆发点采集的4例标本中,分离到3株腮腺炎病毒,均属于G基因型.此福建株与国内其他省流行的F基因型病毒株核苷酸差异性＞9％,与S(上海,Shanghai)79疫苗株SH基因核苷酸差异17.6％,与1999～2005年英国流行的G2基因亚型病毒株核苷酸同源性高(97.4％～99.8％).结论 此起爆发为G基因型腮腺炎病毒引起,是否为输入性病毒?目前在中国使用的疫苗所产生的抗体能否完全阻断?需进一步加强监测.
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多重逆转录-聚合酶链反应检测麻疹风疹流行性腮腺炎病毒基因的研究
目的探索麻疹、风疹、流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒感染的快速诊断方法.方法利用多重逆转录-聚合酶链反应(MRT-PCR)方法对麻疹、风疹、腮腺炎病毒的相关基因检测进行研究.结果直接从麻疹疫苗沪191株,风疹疫苗BRDⅡ株,腮腺炎疫苗S79株,冻干麻疹、腮腺炎、风疹联合减毒活疫苗及临床麻疹、风疹、腮腺炎患者的标本中,同时检测出麻疹、风疹、腮腺炎病毒635bp、411bp、519bp的特异性核酸片段,MRT-PCR 1次扩增灵敏度均可分别达到1TCID50.结论该方法能特异、敏感地检测临床标本中麻疹、风疹、腮腺炎病毒,是快速诊断麻疹、风疹、腮腺炎病毒感染的理想方法.
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流行性腮腺炎病毒的分子流行病学研究
流行性腮腺炎(腮腺炎)是由腮腺炎病毒(MuV)引起的急性呼吸道传染病.截止2004年,MuV已发现了12个基因型,分别命名为A～L基因型.不同基因型MuV的分布具有地域性.研究表明,在同一地域的不同时期可能有不同基因型MuV在流行,在一个国家或地区也可能同时有不同基因型的MuV流行.MuV仅一个血清型,不同的MuV基因型之间有抗原交叉性,这种交叉性是至关重要的.可保护接种疫苗后的人群免受不同基因型MuV的感染.但有些体内和体外实验表明,基因型之间的抗原交叉性是有限的.流行病学数据还表明,某些毒株和基因型或基因型内某一组病毒具有神经毒性.近年来,调查了不同MuV的神经毒性,发现C、D、G、H、I、J基因型具有明确的神经毒性.但目前引起神经毒性的遗传学基础还不清楚.虽然,目前还无流行病学证据证明在不同的基因型或毒株之间出现抗原交叉性降低现象.但有数据表明,连续的进化和基因型的再分布在理论上可能导致神经毒力增强或交叉中和能力降低的毒株出现.因此,对MuV进行分子流行病学研究,了解基因型的分布,监测人群对基因型的特异性免疫是非常必要的.
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流行性腮腺炎病毒及其疫苗
流行性腮腺炎(腮腺炎)是一种急性病毒性传染病,能引起多种并发症,腮腺炎病毒仅1个血清型,通过对其SH基因序列测定,腮腺炎病毒可分为8个基因型,各国流行的病毒为不同基因型.发达国家自广泛应用腮腺炎疫苗后,发病率下降88%～99%.但应用含Urabe或L-Zagreb疫苗株的腮腺炎疫苗或麻疹-腮腺炎-风疹联合疫苗后,发生不良反应如无菌性脑膜炎者较多.中国使用较广的为S79株,较为安全,其抗体阳转率≥85%,免疫保护率为78.87%.该毒株经蚀斑纯化后,其疫苗的抗体阳转率可提高至94%.
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生物热力学法比较板蓝根不同提取部位的抗病毒作用
目的生物热动力学表达与常规离体细胞培养法联合应用,研究并分析板蓝根不同提取部位的抗病毒作用.方法采用hela 细胞系转染流行性腮腺炎病毒,以生物热力学方法观察板蓝根不同提取部位的抗病毒作用,并以常规离体细胞培养法进行药效学验证.比较不同部位抗病毒活性.结果生物热动力学分析表明:板蓝根水煎液部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氯仿部位及石油醚部位均具有一定的抗病毒作用,萃取后部位没有抗病毒作用.其活性比较为:乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>水提部位>石油醚部位.此结果与体外细胞培养法结果一致.结论本实验初步建立了基于生物热动力学表达的抗病毒药物筛选方法.
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2016年北京市门头沟区流行性腮腺炎病毒基因特征
目的 了解北京市门头沟区腮腺炎病毒(Mumps Virus,MuV)的基因特征.方法 采集腮腺炎患者咽拭子标本分离病毒,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增小疏水蛋白(small hydrophobic protein,SH)基因片段,对扩增产物进行序列测定和基因分型.结果 门头沟区MuV分离株属于F基因型,与2011年香港流行株为接近.北京不同年代的MuV流行株分散在亲缘关系树不同的进化分支上,无明显的时间和地理分布趋势.与F基因型参考株比对,与浙江株核苷酸的同源性为97.2％,氨基酸的同源性为93.1％;与中国疫苗株JERYL-LYNN核苷酸差异达到19.0％.结论 该分离株为F基因型腮腺炎病毒,与北京近年流行株隶属不同的传播链.SH蛋白氨基酸一些保守位点已发生变异,因此应加强MuV基因型监测.
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唐山市流行性腮腺炎病毒小疏水蛋白基因序列分析
目的探讨唐山市流行性腮腺炎病毒的分子特征.方法收集唐山市不同行政区的流行性腮腺炎患儿唾液标本5份,其中,爆发病例2例,散发病例3例.经RT-PCR扩增小疏水蛋白(SH)基因并测序,利用Clustal X软件进行系统发育分析.结果唐山市分离的5株流行性腮腺炎病毒均为F亚型.各株病毒SH基因的核苷酸序列一致率为94.8%～100.0%,氨基酸序列一致率为91.4%～100.0%,但与国内主要野毒株SH基因的氨基酸序列一致率只有80.7%.系统发育分析显示,唐山市的各样本之间同源性较高,其次是国内的野毒株,而与国外野毒株及疫苗株同源性低.结论唐山市存在多种流行性腮腺炎病毒株流行,主要基因型为F亚型.
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北京地区流行性腮腺炎病毒流行株基因型分析
目的 了解北京地区流行性腮腺炎病毒流行株基因型分布和变异情况.方法 通过SH基因的序列分析,与其他基因型参考株进行同源性比较,构建亲缘进化树.结果 17株病毒均属于F基因型,VAC-S79属于A基因型,各流行株间核苷酸大差异为5.4%,与F基因型代表株Z77158(兰州)、Z77160(上海)核苷酸大差异分别为4.8%和7.0%;与疫苗株的核苷酸差异为14.6%～15.9%.结论 近2年北京地区流行的优势株为F基因型,未发现基因型间变异,但存在较大的型内差异,有变异增大趋势,需进行持续的分子流行病学监测.
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流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84六代次基因序列分析
目的 分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较.方法 WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基凶及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树.结果 WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定.与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化.7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%.2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%.结论 WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向.WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定.
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流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84全基因序列测定及分析
目的 分析流行性腮腺炎病毒疫苗WM84株(以下简称WM84株)全基因序列,并与Jeryl Lynn(JL)株和腮腺炎病毒各基因型进行比对.方法 WM84株原始毒株于原代鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)上连续传代至7代,观察每代病毒的培养特性,测定第7代病毒全基因序列,用MEGA 4.1软件分析其核苷酸及氨基酸序列与儿株的差异,用MEGA 4.1软件的相邻连接方法(neighbor-joining,NJ)构建各基因型腮腺炎病毒的系统进化树.结果 WM84株原始病毒在CEF上连续传7代的各代病毒的培养特性基本稳定.WM84株与JL2及JL5株比较,核苷酸序列同源性分别为99.90％和97.17％.WM84株与JL2株比较,核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、小疏水蛋白(SH)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、大蛋白(L)核苷酸序列同源性分别为为99.94％、99.92％、99.91％、99.81％、98.84％、99.94％、100％;氨基酸序列的同源性分别为100％、100％、99.73％、99.44％、98.23％、100％、100％.WM84株与JL5株比较,N、P、M、F、SH、HN、L蛋白核苷酸序列同源性分别为97.59％、96.84％、97.93％、97.02％、94.01％、97.02％、97.63％;氨基酸序列的同源性分别为98.72％、94.27％、98.39％、97.36％、90.82％、97.57％、99.42％.WM84株与JL2、JL5株SH蛋白的第29位和第48位氨基酸位点上无差异.WM84、JL2和JL5株均为A基因型,WM84株与JL2株的遗传距离低于与JL5株的遗传距离.结论 WM84株CEF 7代病毒与JL2株的同源性较高,其致病性、中和活性相关位点均未发生改变,表明WM84株具有稳定的免疫原性,其制备的疫苗安全有效.
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江苏省2014年流行性腮腺炎病毒基因特征分析
目的 分析江苏省2014年流行性腮腺炎病毒(MuV)的基因特征.方法 采用Vero/SLAM细胞分离流行性腮腺炎病毒,采用RT-PCR法对25株MuV分离株的小疏水蛋白(Small Hydrophobic Protein,SH)基因片段进行扩增和序列测定,结合WHO MuV参考株进行分子流行病学研究.结果 通过比较核苷酸和氨基酸同源性和构建亲缘关系树发现,江苏省2014年25株MuV分离株同属F基因型,但序列间存在差异.核苷酸和氨基酸同源性分别为94.0％～ 100.0％和84.9％～ 100.0％.MuV分离株在SH基因编码的氨基酸保守位点也发生了变化.结论 江苏省2014年流行的MuV基因型同属F基因型,为F基因型MuV的多个传播链引起,但与F基因型参考株序列差异较大,发生了一定程度变异.
