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贵州省2014-2017年H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析
目的 分析2014-2017年贵州省H7N9禽流感病毒HA和NA基因的分子特征和感染风险.方法 对2014-2017年贵州省获取的18例确诊人感染H7N9病例和6份环境样本分离的H7N9病毒株的HA和NA基因进行扩增,运用生物信息学软件解析其变异和遗传进化.结果 2014-2015年贵州省2株毒株与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013疫苗株HA和NA基因的同源性高,分别为98.8％ ～ 99.2％和99.2％;2016年2株和2017年14株与A/Hunan/02650/2016疫苗株同源性高,分别为98.2％～ 99.3％和97.6％～ 98.8％;2017年其余6株与A/Guangdong/17SF003/2016疫苗株同源性高,为99.1％～99.4％和98.9％～99.3％.所有毒株均属于长江三角洲分支,但主要聚集为3个次分支.2017年贵州省西部有6株毒株(含2例人感染病例毒株)裂解位点存在插入突变为PEVPKRKRTAR ↓ GLF,具备高致病性禽流感病毒的分子特征;受体结合关键位点存在A134V、G186V和Q226L突变,NA蛋白颈区“QISNT”均缺失,毒株A/Guizhou-Danzhai/18980/2017发生耐药突变R294K,9株毒株NA蛋白糖基化位点发生NCS42NCT突变.结论 2014-2017年贵州省H7N9禽流感病毒HA和NA基因存在遗传差异,关键位点的变异增强了病毒对人体的易感性和毒力,部分毒株发生耐药突变,其感染与致病风险增加.
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鸡源H9N2亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因序列分析
对1996～2001年间自中国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因(NA),进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性.结果表明,NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.1%～99.8%和95.7%～99.7%,说明NA基因稳定遗传,高度保守.与A/chicken/HongKong/G9/97相比较,发现中国大陆鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶蛋白在其茎部的第63、64、65位点上都有3个氨基酸的丢失,而与中国邻近的韩国、巴基斯坦鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶没有氨基酸的丢失,因此这些部位的氨基酸丢失可初步认为是中国大陆H9N2流感病毒分离株的一个标记.系统进化树分析表明,该8株病毒的NA基因属于相同的进化分支,即A/duck/HongKong/Y280/97-like分支,尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like分支的分离株.中国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化亚分支,说明H9N2亚型禽流感的发生与流行和地域有一定的相关性.
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1996～2005年中国H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性分析
测定了1996～2005年间在中国分离并保存的395株H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列,应用生物信息学工具进行了分析.结果表明:NA基因序列的进化树表现为一主要进化主干伴随多侧分支进化,同一年份的毒株可以分为几个分支存在;疫苗株在NA基因序列进化树上存在明显的滞后现象;NA没有氨基酸的丢失与插入;抗原决定簇大部分位点保守且各抗原决定簇之间的变异情况各有特点,其中197～199位、431～434位和339～347位点的变异频率高,而153位、328～336位、367～370位、400～403位抗原决定簇的氨基酸变异频率相对比较小;除了抗原决定簇外还有些氨基酸位点的变异频率很高,它们分别是18、23、30、93、143、208、216、221、249、265、267、307、385、437位氨基酸,其中143位和267位这两个位点的变异频率高于抗原决定簇位点,具体生物学意义还需要进一步研究;NA蛋白的酶活性中心位点高度保守;二硫键和糖基化位点保守.NA基因的这些特点为流感的预防、控制以及NA抑制剂药物的应用提供了一定的参考依据.
关键词： H3N2亚型流感病毒 神经氨酸酶基因 变异 -
浙江省近几年甲3亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因分析
目的 通过浙江省1998～2005年甲3亚型流行性感冒(流感)病毒的神经氨酸酶(NA)基因的序列比较,阐明近几年NA基因的变异与流感流行的关系.方法 对浙江省1998～2005年流感流行期间分离的甲3亚型流感代表性毒株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因,进行核苷酸序列测定,并用Bio-Edit软件作分析处理.结果 浙江省近几年流感流行期间分离到甲3亚型流感病毒代表株13株,其NA基因核苷酸长度均为1 338bp,由此推导的氨基酸数为446个.1998～2005年甲3亚型流感病毒在NA基因区发生可遗传的氨基酸变异达22个,其中1998～1999年、1999～2002年变异大,均达到9个氨基酸的差异;2003年后病毒的变异趋向平稳,这与NA基因系统进化树的结果相一致.此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异,而在2003年后的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间的符合程度较好.结论 近年来浙江省甲3亚型流感病毒的NA区域与血凝素区域相似,均发生了较大的抗原性漂移,提示1999～2005年发生的2次流感流行是由于当年的甲3亚型流感分离株变异影响到病毒的抗原性所导致的.
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上饶市乙型流感病毒耐药基因分析
目的 分析上饶市乙型流感病毒耐药基因,为临床用药和疾病控制提供依据.方法 从哨点医院采集疑似流感患者咽拭子样本,接种犬肾传代细胞(Madin-Darby Canine Kidney,MDCK)及进行分离培养.选择分离到的乙型(即B型)流感病毒株进行核酸提取后进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因并进行核苷酸测序,采用DNA Star6.0,Mage5.0生物软件对测序结果进行分析处理,推导出氨基酸序列,进行基因特性分析.结果 7株乙型流感病毒NA基因同源性高达99.5％以上,NA蛋白催化活性位点和辅助位点均无氨基酸替换.结论 7株毒株均对流感病毒NA抑制剂药物敏感,但仍应加强对流感病毒的耐药性监测.
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内蒙古自治区第一株甲型H1N1流行性感冒病毒的血凝素基因与神经氨酸酶基因的特性
2009年3月开始在墨西哥和美国等地暴发了由甲型H1N1流行性感冒(流感)病毒引起的甲型H1N1流感,该疫情在短期内迅速蔓延至全球[1-4].甲型H1N1流感病毒属正黏病毒科甲型流感病毒属,基因组约为13.6 kb,由大小不等的8个独立片段组成[ 5].本研究对1例甲型H1N1流感患者咽拭子样本进行病毒核酸检测和病毒分离培养,并分析所得病毒的血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的特性.
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H9N2亚型禽流感病毒纤突蛋白基因的分析
目的克隆禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)纤突蛋白血凝素基因和神经氨酸酶基因,并与同一亚型不同毒株的病毒进行比较.方法本研究以自行设计的引物,一次性成功地扩增出KMⅢ毒株HA和NA全长基因cDNA,并将它们克隆和测序.以获得的核苷酸序列和氨基酸序列与其它毒株的HA蛋白和NA蛋白比较.结果 HA基因由1683bp组成,编码560个氨基酸;NA全基因为1407bp、编码469个氨基酸残基;HA1羧基端的氨基酸组成是:R-S-S-R,符合低致病力毒株的分子特征.它们的氨基酸组成虽有差异,但与血凝素和神经氨酸酶功能关系密切的氨基酸残基却高度保守.联机检索表明,KMⅢ的HA基因cDNA与其它H9N2亚型 HA基因大同源性在82%～96%之间.NA基因 cDNA与其它H9N2亚型NA基因的大同源性在88%～97%之间.结论我们首次克隆和测序了KMⅢ毒株的HA基因和NA基因,并对它们进行了分析.
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2014-2016年广东省肇庆市人感染H7N9禽流感病毒基因组特征分析
目的 了解广东省肇庆市2014-2016年人感染H7N9禽流感病毒基因进化特征.方法 对肇庆市17例H7N9患者咽拭核酸直接进行8节段基因序列扩增与测定,用BioEdit5.0、MEGA6.0进行同源性和重要氨基酸位点分析,采用Neighbor-Joining法构建进化树,参比序列从GenBank下载.结果 7份H7N9病例标本获得8节段全基因序列,HA与A/chicken/Dongguan/695/2014 (H7N9)相似度高,NA与A/ chicken/Dongguan/1075/2014 (H7N9)相似度高;内部基因与2013-2014年广东东莞、深圳禽源H7N9及H9N2相似度较高.HA和NA基因与广东省东莞、广州、深圳等地市的H7N9序列同处于珠三角进化分支,与安徽、浙江、江苏等长三角分支的序列相似性低.HA蛋白受体结合位点发生G186V、Q226L变异,裂解位点序列均为PEIPKGR↓ GLF,含有2个碱性氨基酸;M2蛋白上发现耐药位点S31N,PB2蛋白上发现E627K突变,NA蛋白上未发现耐神经氨酸酶的位点变异.结论 肇庆市人感染H7N9病毒株可能来源于2013 2014年广东省珠三角地区禽源H7N9和H9N2,G186V、Q226L和E627K位点变异增强了对人的易感性.
关键词： 人感染H7N9禽流感病毒 血凝素基因 神经氨酸酶基因 序列分析 -
One-step RT-PCR-RFLP方法筛查新型甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐药株
目的 分析2013年江西省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因第275位氨基酸变异情况,掌握甲型H1N1流感病毒耐药特性,为甲型H1N1流感临床治疗和疾病控制提供参考.方法 收集江西省流感监测哨点医院采集的流感样病例的鼻咽拭子标本,采用狗肾传代细胞(MDCK)对标本进行病毒分离,对分离的31株新型甲型H1N1流感病毒进行核酸提取,采用一步法逆转录-聚合酶链反应(One-step RT-PCR)扩增病毒M基因部分片段,采用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)方法,分析扩增的部分NA基因第275位是否发生组氨酸(H)到酪氨酸(Y)的突变.结果 2013年江西省31株甲型H1 N1流感病毒NA基因第275位氨基酸均为组氨酸,未发生变异.结论 2013年31株毒株均对Osehamivir敏感,One-step RT-PCR-RFLP方法筛查新型甲型H1N1流感病毒Osehamivir耐药株简便可行.
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甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析
[目的]了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律.[方法]分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性H1N1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析.[结果]2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性H1N1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9%～78.8%),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979～2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1%～79.3%).但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异.[结论]2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 神经氨酸酶基因 遗传进化 -
郴州市2009年流感病原学监测及A(H1N1)NA基因特征研究
[目的]了解2009年郴州市流感病毒流行株的病原学特征,为流感防控提供科学依据.[方法]采集哨点医院ILI咽拭子标本,用MDCK细胞进行病毒分离,采用HA和HI试验对流感病毒进行分型鉴定;采集暴发疫情ILI咽拭子用PCR法检测流感病毒核酸；随机抽取4、10月份的季节性A(H1N1)流感毒株进行NA基因测序,测序结果与国内各省市流行株及WHO推荐的北半球疫苗株作同源性比对,绘制种系进化树.[结果]分离哨点医院监测标本2 284份,阳性254份:其中季节性A (H1N1) 109株、A(H3N2) 97株、甲型H1N1 30株、B型18株;PCR检测3 024份标本,甲型H1N1核酸阳性1 002份,阳性率33.13％; BLAST比对结果显示,4、10月份的季节性A(H1N1)毒株与2009年WHO推荐的北半球疫苗毒株A/Brisbane/59/2007的核酸同源性分别为99％和98％；种系进化分析结果表明4月份分离株与疫苗株亲缘关系近,而10月份分离株较4月份分离株已明显发生变异.[结论]2009年郴州市甲型流感病毒异常活跃,其中1～6月季节性A (H1N1)为优势毒株,7～9月A(H3N2)为优势毒株,10～12月甲型H1N1为优势毒株,且出现甲型H1N1流感大流行.季节性A(H1N1)病毒在流行过程中NA基因已经发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测其变异情况.
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表达A型H5N1血凝素的重组副流感病毒5能使小鼠抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的攻击
安全有效的疫苗是阻止高致病性（ HPAI）禽流感病毒H5 N1在人群中大规模暴发的好方法。目前FDA批准的H5 N1疫苗有明显的局限性，因此，迫切需要更加有效的H5N1疫苗问世。副流感病毒5（ PIV5）是一种副黏病毒，在人群中不引起任何疾病，因此是一种可行的疫苗载体。在我们的研究中，用单剂量的表达有来自一 H5 N1亚型病毒血凝素（HA）的重组活PIV5（rPIV5-H5）免疫小鼠，发现对致死剂量的HP AI H5 N1攻击具有免疫作用。另外，我们试验了把H5N1 HA插入到PIV5基因组中不同位置对PIV5制成的疫苗有效性的影响。有趣的是，当把H5N1的HA插在前导序列，即PIV5启动子和第一个病毒基因（其编码核蛋白NP ）之间时，不能产生有活力的病毒。当把 H5 N1的 HA 插在NP和下一个基因V／磷蛋白（ V／P ）之间时，能引起病毒生长缺陷。当把H5 N1的HA插在小疏水基因（SH）和血凝素-神经氨酸酶基因（HN）交界处时，其制成的疫苗对HPAI H5N1有好的免疫力：在小鼠试验中，只要用1000 PFU的剂量便已足够。本研究说明了表达有H5N1 HA 的重组PIV5有潜力成为HP AI H5 N1的候选疫苗。
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流感病毒血凝素基因、神经氨酸酶基因在小鼠中的免疫效果观察
流感病毒血凝素基因,神经氨酸酶基因免疫BALB/c小鼠,获得特异阳性抗体反应,抗体滴度与基因免疫量呈正相关性,各实验组免疫小鼠抗同型流感病毒攻击存活率为100%,血凝素基因免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为100%,神经氨酸酶基因免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为75%,血凝素基因与神经氨酸酶基因联合免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为100%.
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赣州市2014年甲型H1N1流感病毒奥司他韦耐药株的筛查结果
目的 分析2014年赣州市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因第275位氨基酸变异情况,掌握其耐药特性,为甲型H1N1流感防治提供参考.方法 收集赣州市流感监测哨点医院采集的流感样病例鼻咽拭子标本,采用狗肾传代细胞(MDCK)对标本进行病毒分离,对分离的24株甲型H1N1流感病毒进行核酸提取,采用一步法逆转录-聚合酶链反应(One-step RT-PCR)扩增病毒NA基因部分片段,采用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)方法,分析扩增的部分NA基因第275位是否发生组氨酸(H)到酪氨酸(Y)的突变.结果 2014年赣州市24株甲型H1N1流感病毒NA基因第275位氨基酸均为组氨酸,未发生变异.结论 2014年24株毒株均对Oseltamivir敏感,One-step RT-PCR-RFLP方法筛查甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐药株简便可行.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 神经氨酸酶基因 耐药性
