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2009年云南省柯萨奇病毒B3型分离株A103/KM/09全基因序列分析
目的 分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103/KM/09全基因序列,了解其遗传特性.方法 设计针对柯萨奇病毒B3型引物,提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列,利用Geneious和Mega 5.05软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析,应用RDP 3和SimPlot 3.5.1重组软件对序列进行重组分析.结果 该分离株全基因组核苷酸序列长度为7389 bp.其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Nancy的同源性分别为81.0％和95.7％;与其他柯萨奇病毒B3型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81.0％～ 88.0％和95.7％～98.0％;进化分析发现CVB3可分为5个分支(Ⅰ～Ⅴ),核苷酸之间的差异为16.2％ ～ 24.3％;中国分离株属Ⅴ分支,又可分为A～D亚分支,核苷酸之间的差异为4.3％～11.4％.并发现A103/KM/09株基因序列在非结构区可能存在重组事件.结论 柯萨奇病毒B3型分为5个基因型,云南分离株A103/KM/09属于Ⅴ-D亚型,而中国分离株已经发生一定进化.
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柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备
肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶.柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚.本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(+)的表达框,获得pET28a(+)-3D重组质粒.异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(+)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白.3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性.结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究.
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淋巴细胞趋化因子增强柯萨奇病毒DNA疫苗黏膜免疫及预防小鼠心肌炎的作用
本研究在已建立的柯萨奇病毒B3型(CVB3)黏膜疫苗chitosan-pVP1基础上,引入C家族趋化因子,即淋巴细胞趋化因子(LTN),以期诱导更强的黏膜免疫应答,获得更有效的免疫保护作用.将pLTN与pVP1各50 μg混合后,与chitosan形成共聚复合物,隔周滴鼻免疫小鼠,共4次;末次免疫后2周,检测血清IgG、粪便IgA及肠系膜淋巴结细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性.同时,以3 LD50/0.1 ml CVB3腹腔感染小鼠,7 d后检测血清肌酸激酶(CK)活性及心肌病理学改变.结果显示,与对照组相比,chi-(pVP1+pLTN)可显著提高CVB3特异性血清IgG水平、粪便IgA水平以及增强肠系膜淋巴结特异性CTL应答.病毒攻击后,chi-(pVP1+pLTN)组心肌炎发病率仅为16.7%,显著低于chi-(pVP1+pcDNA3.1)组的33.3%.心肌组织病理显示,chi-(pVP1+pLTN)组心外膜下仅有轻微炎症,而chi-(pVP1+pcDNA3.1)组除心外膜下有较多淋巴细胞聚集外,心肌内尚有少量炎症浸润和坏死灶.结果提示,LTN与VP1质粒经chitosan共包装后进行滴鼻免疫,可增强CVB3特异性黏膜免疫应答,更有效地预防病毒性心肌炎的发生.
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柯萨奇病毒B3型诱导的免疫偏离与心肌炎发病关系的研究
目的 研究2种近交系小鼠在柯萨奇病毒B3型(CVB3)感染后辅助性T细胞(Th)免疫偏离对心肌炎发病的影响.方法 用CVB3腹腔感染BALB/c和C57BL/6 2种近交系小鼠,感染后7 d通过检测小鼠血清肌酸激酶(CK)活性,观察心脏外观变化以及心脏石蜡切片H.E染色观察心脏病理改变,比较2种小鼠心肌炎的发病情况;通过体外感染心肌细胞观察病毒复制情况以及体内心脏组织病毒载量的分析,比较2种小鼠对病毒感染和复制的差异;通过检测感染小鼠细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-12和γ干扰素(IFN-γ)的表达,抗CVB3 VP1抗体的亚型以及T-bet和Gata-3的表达,比较2种小鼠Th免疫偏离的情况.结果 CVB3在体外和体内都可以感染BALB/c和C57BL/6 小鼠心肌细胞,但仅BALB/c小鼠感染后可发生明显的病毒性心肌炎,C57BL/6 小鼠则不能;BALB/c小鼠感染后表现为Th1 型免疫反应而C57BL/6小鼠则偏向于Th2型免疫反应.结论 CVB3感染2种品系小鼠表现为不同的心肌炎发生率,与其诱导了不同类型的免疫偏离密切相关.
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重组水疱性口炎病毒载体疫苗皮下免疫效应的初步研究
柯萨奇B组病毒(CVB3)是导致人类急慢性心肌炎、扩张性心肌病的重要病原体之一.目前还没有疫苗或有效的药物防治病毒性心肌炎,我们观测了以水疱性口炎病毒VSV为载体的疫苗皮下免疫诱导的CVB3特异性免疫应答及保护效果,并比较了与传统蛋白疫苗之间的差异.以VSV为载体的病毒疫苗在小鼠模型中通过皮下免疫可以诱导强劲的体液免疫和T细胞免疫,但与VP1蛋白疫苗比较,除了分泌IFN-γ的T细胞外差异无统计学意义.VSV-VP1免疫组(一次免疫)的保护效果略好于VP1蛋白免疫组(三次免疫),提示VSV-VP1疫苗保护效果增加的可能原因是VSV VP1皮下免疫诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞的比例增加,以上实验结果为水疱性口炎病毒作为疫苗载体应用提供了理论基础.
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氧化苦参碱对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡及相关因子的影响
目的 探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡及其凋亡相关因子蛋白表达的影响.方法 42只BALB/c小鼠随机分为正常对照组(NC)、病毒性心肌炎模型组(VM)、OMT高剂量组(OMT-H,25 mg·kg-1·d-1)、OMT中剂量组(OMT-M,12.5 mg·kg-1·d-1)、OMT低剂量组(OMT-L,6.25 mg·kg-1·d-1)、OMT极低剂量组(OMT-EL,3.125 mg·kg-1·d-1)、利巴韦林对照组(RB,100 mg·kg-1·d-1).病毒性心肌炎小鼠由柯萨奇病毒B3型腹腔注射感染所致,各治疗组从末次给予病毒24 h后开始,腹腔注射,每日1次.于治疗第12天,每组处死小鼠6只,留取心肌标本.TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况,免疫印迹法和免疫组织化学法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达情况.结果 OMT治疗显著降低了病毒性心肌炎小鼠凋亡心肌细胞的数量,与病毒性心肌炎模型组比较,OMT-L组效果佳(P＜0.01).与病毒性心肌炎模型组小鼠比较,OMT治疗组的小鼠心肌组织中Bax蛋白表达降低,而Bcl-2蛋白表达没有明显改变.结论 氧化苦参碱可减少病毒性心肌炎小鼠心肌细胞的凋亡,该作用与下调Bax蛋白表达有关.
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GYY4137通过Bcl-2/Bax/Cleaved caspase-3信号通路改善柯萨奇病毒B3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡
目的：探讨外源性 H 2 S对柯萨奇病毒B3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)体外模型,随机分为正常组、模型组、模型组+50μmol/L GYY4137组、正常组+50μmol/L GYY4137组。Hoechst 33342染色法及流式细胞术分别检测心肌细胞凋亡,TBA 法及酶标法分别检测各组细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的表达,Western blot 法检测各组细胞Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与模型组比较,给予50μmol/L GYY4137后,心肌细胞凋亡明显好转(P<0.01)；50μmol/L GYY4137能使模型组心肌细胞 MDA 显著降低、SOD明显增加(均P<0.05)；给予50μmol/L GYY4137后,模型组心肌细胞Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达明显降低(均P<0.05)、Cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)；单纯给予50μmol/L GYY4137对正常心肌细胞上述各项检测指标无明显影响(均P>0.05)。结论GYY4137可显著改善柯萨奇病毒B3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡,其作用机制与抑制 Bcl-2/Bax/Cleaved caspase-3信号通路激活有关。
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疏风解毒胶囊体内抗病毒作用的实验研究
目的 观察疏风解毒胶囊体内抗呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)和柯萨奇病毒B3型(CVB3)的作用.方法 分别用RSV、HSV-I、CVB3感染小鼠建立模型,实验分疏风解毒胶囊高、中、低剂量组,利巴韦林组,清开灵组,病毒对照组及正常对照组,灌胃给药,记录各组小鼠死亡数及存活时间.以肺指数、动物死亡保护率及生命延长率等指标观察疏风解毒胶囊体内抗病毒的作用.结果 与病毒对照组比较,疏风解毒胶囊能明显降低RSV感染小鼠肺指数,并存在剂量依赖关系,其肺指数抑制率略低于利巴韦林组,而明显高于清开灵组.同时疏风解毒胶囊对3种病毒所致的动物死亡保护率、生命延长率等指标均明显增加,与上述对肺指数抑制率的结果吻合.结论 疏风解毒胶囊可有效地改善RSV感染所引起的小鼠肺部肿胀,对RSV、HSV-I、CVB3病毒感染小鼠均有明显保护作用.
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HMGB1不同结构域对CVB3心肌炎疫苗免疫增强作用的比较研究
目的 本研究在已构建好的柯萨奇病毒B3型(CVB3)疫苗pVP1的基础上,分别引入编码HMGB1不同结构域的质粒DNA,通过检测共免疫诱导的免疫应答强度,比较其各结构域介导的免疫增强作用.方法 首先构建了编码HMGB1的不同结构域的质粒pHMGB 1-A、B、C-box,分别与pVP1疫苗混合后肌注免疫小鼠,于末次免疫后10 d检测其诱导的特异性抗体和细胞免疫应答.结果 与pVP1单独免疫组相比,pHMGB1-B box共免疫组可显著提高特异性血清IgG水平,同时也显著增加了脾脏IFN-γ+T的细胞数量;C-box仅显示出促进T细胞免疫的效应且程度较B-box小,对抗体水平无明显增强作用;A-box对抗体水平和细胞免疫应答的促进作用都不明显.结论 HMGB1不同结构域对病毒性心肌炎DNA疫苗诱导的体液和细胞免疫应答具有不同程度的增强效应,其中B-box可综合增强CVB3特异性体液和细胞免疫应答,C-box仅有促进T细胞应答效应,而对抗体水平无促进作用,A-box对抗体水平增加和细胞免疫应答的促进作用不明显.该研究不仅有助于深入了解HMGB1不同结构域的免疫佐剂效果差异,更为科学合理应用HMGB1增强免疫应答提供了一定的基础数据.
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四种靶向因子与柯萨奇病毒B3 VP1融合基因疫苗免疫效果的比较
目的:比较巨噬细胞源趋化因子(MDC)、补体片段C3d3、志贺毒素B亚单位(STxB)和小鼠β-防御素2(mBD2)分别与柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1构建的融合基因疫苗及VP1基因疫苗对小鼠的免疫效果.方法:将雄性BALB/c小鼠随机分为6组,每组22只,分别于股四头肌注射pcDNA3、pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3、pcD-NA3/STxB-VP1和pcDNA3/mBD2-VP1,接种剂量为每次100μg/只,3周免疫1次,共3次.每次免疫后第14天内眦静脉取血,用微量中和试验滴定血清中和抗体滴度.第3次免疫后第21天,每组随机取3只小鼠,制备脾淋巴细胞,用CCK-8细胞计数法检测特异性CTL的杀伤活性;每组取3只小鼠以3LDLD_(50)CVB3病毒攻击,第7天取血处死,检测血清病毒滴度;其余小鼠以5LDLD_(50)的CVB3攻击,观察各组的生存情况.结果:除了pcDNA3对照组,其他各组的中和抗体滴度均随免疫次数的增加而提高(P＜0.01),第3次免疫后,pcDNA3/MDC-VP1、peDNA3/VP1-C3d3和pcDNA3/mBD2-VP1组的抗体滴度明显高于peDNA3/VP1组(P＜0.01);pcDNA3/STxB-VP1和peDNA3/mBD2-VP1组CTL杀伤活性显著高于其他各组(P＜0.01).致死量病毒攻击后,pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3和pcDNA3/mBD2-VP1组小鼠血中病毒滴度显著低于其他组(P＜0.01);pcDNA3/MDC-VP1和pcDNA3/VP1-C3d3组小鼠生存率显著高于其他各组(P＜0.05).结论:pcDNA3/MDC-VP1和pcDNA3/VP1-C3d3能诱导出较强的体液免疫和细胞免疫,能有效降低血中病毒滴度,获得较高的小鼠生存率;整体效果优于其他组.
