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实时荧光定量PCR检测普氏立克次体
目的 采用新型TaqMan-MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法.方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因(ompB)序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900型)上建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999);与巢式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍.用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA,检出结果均为阴性.用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本,某些样本检测为阳性,而用巢式PCR检测的结果均为阴性.结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA,可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒.
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普氏立克次体120kDa表面抗原C段基因的克隆与表达
采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增出120kDa表面抗原C段基因片断,并将其克隆于原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30/67,将重组质粒转入大肠杆菌M15,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.SDS-PAGE分析发现重组质粒转化菌产生了一67kDa重组蛋白;在免疫印迹分析中,该67kDa重组蛋白与普氏立克次体免疫血清发生特异反应,显示 67kDa重组蛋白具有普氏立克次体120kDa表面抗原特性.
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普氏立克次体120kDa表面蛋白N端和C端重组蛋白的抗原特异性研究
用免疫印迹和酶联免疫吸附试验分析普氏立克次体N端和C端重组蛋白,发现2个重组蛋白除与普氏立克次体免疫血清发生特异性反应外,并与立氏立克次体免疫血清发生反应,这2种立克次体也被这2个重组蛋白免疫血清所识别,提示这2个重组蛋白含有普氏和立氏立克次体的共同抗原决定簇.
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流行性斑疹伤寒的护理体会
流行性斑疹伤寒是普氏立克次体通过体虱为媒介而传播的一种急性传染病.临床特征表现为起病急,持续高热、头痛、皮疹及神经系统中毒症状.患者是惟一的传染源,病原体进入血行后即有传染性.如病程迁延合并肺炎,心肌炎等愈后不良.下面将我科2003～2007年收治的4例流行性斑疹伤寒的观察及护理介绍如下.
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小儿流行性斑疹伤寒的观察及护理
流行性斑疹伤寒是普氏立克次体通过体虱为媒介而传播的一种急性传染病.临床特征起病急,持续高热、头痛、皮疹及神经系统中毒症状.患者是唯一的传染源,病原体侵入血行后即有传染性.如病程迁延合并肺炎、心肌炎等愈后不良.下面将我科2001年1月～2004年9月收治4例流行性斑疹伤寒的患者观察及护理介绍如下.
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普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白免疫原性的研究
目的:评价普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白的免疫原性.方法: 将纯化的N端和C端重组蛋白分别免疫小鼠,采用酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验分析免疫小鼠的体液免疫应答水平;用MTT法评价小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,分析免疫小鼠的细胞免疫应答水平,并采用RT-PCR方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞被重组蛋白刺激后细胞因子的表达.结果: N端和C端重组蛋白均诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,诱导高水平的小鼠脾淋巴细胞增殖;经两种重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞均表达了IFN-γ和IL-2.结论: 普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,可作为流行性斑疹伤寒亚单位疫苗的候选蛋白.
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无极县杨坊小学生斑疹伤寒血清学结果及其启示
共调查石家庄市无极县杨坊村7～13岁小学生74名.血清莫氏立克次体抗体阳性率为66.2%(49/74).血清普氏立克次体阳性率为12.2%(9/74).被调查者均未察觉被跳蚤咬过,仅有少数被虱子咬过.
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斑疹伤寒的诊断和治疗(上)
1流行性斑疹伤寒流行性斑疹伤寒(Epidemic Typhus)又称虱传斑伤寒(Louse-Borne Typhus),是由普氏立克次体(RickettsiaProwazeki)以人虱为传播媒介所致的急性传染病.临床特点是稽留高热,严重头痛、皮疹及中枢神经系统症状.病程2～3周.建国前,本病发病率高,常有流行;建国后已基本控制,目前仅有少数散发病例.但在非洲如埃塞俄比亚等地区此病仍多见.
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斑疹伤寒型别鉴定的研究
斑疹伤寒包括流行性斑疹伤寒和地方性斑疹伤寒两个病种,分型报告疫情是非常必要的.目前采用能够分型的微量补体结合试验作为实验室诊断的方法,但由于抗原高度交叉,只能以同源高于异源的血清效价来分型,但不能分型者为数不少.本文是在分析莫氏、普氏立克次体核苷酸序列的基础上,选择具有特异性的序列合成引物,通过PCR扩增法[1]对2种斑疹伤寒立克次体进行鉴别诊断,达到分型的目的.现报告如下.
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流行性斑疹伤寒的观察及护理
流行性斑疹伤寒是普氏立克次体通过体虱为媒介而传播的一种急性传染病.临床特征表现为起病急，持续高热、头痛、皮疹及神经系统中毒迁延合并肺炎,心肌炎等愈后不良，下面将我院近年来收治4例流行性斑疹伤寒的观察及护理介绍如下:
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用种特异性聚合酶链反应检测普氏立克次体的研究
目的建立特异敏感的快速检验普氏立克次体PCR检测方法,并能与莫氏立克次体相区分.方法采用种特异性巢式PCR方法,进行实验室模拟检测.结果以普氏立克次体的rpa14/16基因为靶标设计了两对引物;该引物特异性实验表明仅普氏立克次体特异性片段可以扩增出来,其余相关立克次体均扩增不出,尤其可鉴别其同群的莫氏立克次体;敏感性测试结果可检测出63fg的普氏立克次体DNA,可检测出0.05个鸡胚半数感染量(CEID50)的立克次体;对人工模拟的小鼠脏器研磨液、血液标本检测发现该法在血液标本中的检测敏感性下降3～4个滴度.结论我们建立的巢式PCR可快速检验普氏立克次体,有望为临床确诊流行性斑疹伤寒和排除鼠型斑疹伤寒提供实验室依据.
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普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析
目的 克隆与表达普氏立克次体(Rickettesia prowazekii)主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性.方法 采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒；将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白.将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹.结果 经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒；9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白；结果显示FtsZ、GroEL、Rp828、EF-Ts等4个蛋白特异性好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应；其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应.结论 FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原.
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普氏立克次体120kDa表面抗原N段基因的克隆与表达
目的克隆和表达普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)120kDa外膜蛋白N段基因.方法采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增其120kDa表面抗原N段基因片段,将其与原核表达载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/26kDa,将重组质粒转入大肠杆菌,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.结果获得长为717bp的PCR片段,序列分析结果与已知普氏立克次体120kDa表面抗原基因一致;SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量26.3kDa处有一表达带;免疫印迹分析证明它能与普氏立克次体免疫兔血清反应;经双波长薄层扫描分析,目的蛋白占全菌体蛋白的20%;提取表达菌体包涵体检查,证明目的蛋白主要存在于包涵体中.结论普氏立克次体120kDa表面抗原N段基因在大肠杆菌中获得了高效表达,该重组蛋白具有良好的免疫反应性.
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普氏立克次体120kDa表面抗原N端和C端重组蛋白的抗原特异性研究
免疫印迹分析证明N端重组蛋白和C端重组蛋白均能与普氏立克次体免疫血清特异反应,N端重组蛋白仅与立氏立克次体免疫血清发生交叉反应,C端重组蛋白则与立克次体属的立氏立克次体和莫氏立克次体免疫血清发生交叉反应.用ELISA分析重组蛋白与各种相关病原体免疫血清的交叉反应,发现N端重组蛋白和C端重组蛋白与立克次体属内的立克次体免疫血清有较强的交叉反应,但是与贝氏柯克斯体、恙虫病东方体以及其它病原体免疫血清无交叉反应,提示N端重组蛋白和C端重组蛋白具有立克次体属特异性.
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普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端重组蛋白的免疫原性研究
将普氏立克次体全细胞抗原和120kDa表面蛋白的N端和C端重组蛋白进行纯化,将纯化后的重组蛋白分别免疫小鼠和家兔.酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验分析免疫动物血清特异性IgG,发现N端和C端重组蛋白均能有效地诱导小鼠和家兔产生较高水平的特异性IgG,C端重组蛋白刺激小鼠和家兔产生的特异性IgG水平比N端重组蛋白刺激后的特异性IgG水平高.对免疫动物的脾脏细胞作体外淋巴细胞增殖试验发现N端和C端重组蛋白均能诱导较高水平的脾淋巴细胞增殖.对免疫小鼠作足垫肿胀试验,C端重组蛋白比N端重组蛋白诱导更明显的特异性迟发型变态反应.采用RT-PCR方法检测全细胞抗原免疫小鼠脾淋巴细胞被不同抗原刺激后的细胞因子的表达,发现两个重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞均表达了IFN-γ和IL-2两种细胞因子,说明它们可以促使THO细胞向TH1细胞分化.本研究结果证明120kDa表面蛋白的N端和C端重组蛋白均具有良好的特异性体液免疫和细胞免疫原性,可以作为流行性斑疹伤寒亚单位疫苗的候选蛋白.
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立氏立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达
采用PCR方法,从立氏立克次体基因组中扩增长为1188bp的ompB基因片段,将该基因片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组原核表达质粒pQE30/ompB;将pQE30/ompB转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因.SDS-PAGE分析发现pQE30/ompB转化菌表达了一44kDa重组蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫兔血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,与其它立克次体免疫血清反应呈阴性,用该重组蛋白免疫血清做间接免疫荧光,检测立氏立克次体结果为阳性,而检测贝氏柯克斯体、恙虫病立克次体和普氏立克次体的结果为阴性.本研究证明pQE30/ompB转化的大肠杆菌表达了ompB基因片段,所产生的重组蛋白具有立氏立克次体抗原特异性和良好的免疫反应性.
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普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端基因的克隆与表达
采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增出120kDa表面抗原的N端和C端基因片断,并将其克隆于原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30/N和pQE30/C,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.SDS-PAGE分析发现两重组质粒转化菌分别产生了一26kDa(N端)和67kDa(C端)重组蛋白;在免疫印迹分析中,26kDa和67kDa重组蛋白均与普氏立克次体免疫血清发生特异反应,证明27kDa和67kDa重组蛋白分别为120kDa表面抗原的N端和C端重组蛋白,具有普氏立克次体120kDa表面抗原特性.
