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丙型肝炎病毒西安株2a型包膜蛋白E区部分cDNA的分析
丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白区（E区）基因是HCV基因组中变异大的部位，不同分离株的核苷酸差异可达40%左右［1］。作者对陕西省HCV地方株的全部E1，部分E2/ NSI区进行了序列测定，并与已发表的多个株做同源性比较。 1.材料和方法：HCV血清取自西京医院丙型肝炎患者，血清经5′非编码区通用引物RT-PCR确认HCV RNA阳性，引物参照HC-J6设计［2］。序列分别为：R1（+）GTGGGTAA-GGTCATCGAT(695～712)，R2（+）GCCGACCTCATGGGGTAC-(731～748)，R3（-）ACCTAGTGCCAACTGCCATTGGT(1 586～1 603)，R4（-）GTTGATGTGCCAACTGCC(1 592～1 609)。 用异硫氢酸胍-冷酚法一步提取HCV RNA，反转录成cDNA，用R1/R4，R2/R3进行套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物纯化、回收，与PGEM-T载体连接，克隆并测序。 2．结果：将所分离毒株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与已报道的HC-J6，HC-J1，BEBE1，HC-J8，HCV-H，HCV-HB，HCV-T的相应序列进行比较。从表1可见，在核苷酸水平上分离株E区与HC-J6相应序列的同源性为78.2%，与其他几株的同源性相对要低一些，与中国河北株HCV-HB的同源性低；在氨基酸水平上分离株E区与HC-J6相应序列的同源性为75.7%，与其他株的同源性低，与中国河北株HCV-HB的同源性低。 3.讨论：HCV 核酸存在广泛的异质性，其中E区不断发生变异，可能是使病毒在体内持续存在的原因，其变异亦可能与疾病程度、对干扰与治疗的抵抗、引起慢性化及肝细胞癌等有一定相关，赵小宁等［3］已经用RT-PCR法从1例陕西地区丙型肝炎患者血清中扩增并克隆和测定了5′NCR，C区的基因序列，分析同源性为2a型，本次研究用同一份血清，测定了全部E1区，部分E2/NSI区共878 bp的核苷酸序列，将所得序列与已报道的几株HCV序列比较后发现，我们的分离株同HC-J6的同源性大，同属于2a亚型。我国已有完整克隆的河北株、北京株和台湾株，但都属于HCV-1b型，本次对2a型的实验克隆对全面了解HCV基因组的结构及其变异，对HCV的基础及临床研究都具有重要意义。
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端粒酶核酶真核表达质粒pBBS212Rz的构建与鉴定
目的:构建含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达质粒pBBS212Rz,为以端粒酶为靶点的基因治疗消化系肿瘤研究奠定基础.方法:将人工合成的端粒酶核酶基因通过基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体pBBS212中.根据260nm的紫外光吸收值计算重组质粒pBBS212Rz浓度.结果:端粒酶核酶基因成功地定向插入了载体pBBS212,经酶切后用聚丙烯凝胶电泳鉴定确认.重组质粒浓度为1.77 g/L.结论:成功构建了含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达重组质粒pBBS212Rz.
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用RT-PCR方法从人胎肝细胞内克隆VEGF基因的研究
血管内皮细胞生长因子具有维持血管正常功能,促进血管内皮细胞增殖,提高血管通透性,改变细胞外基质的等作用,与创伤组织的修复和血管生成密切相关.为此,本研究利用RT-PCR技术钓取VEGF基因的cDNA序列.具体方法是,用常规方法从胎肝组织中提取纯度高RNA后进行甲醛变性凝胶电泳;电泳结束后,在紫外灯下可看见凝胶上有28s和18s两条清晰的电泳带,其亮度之比约为2:1,这显示:获得的RNA较完整,没有降解.取适量胎肝细胞总RNA,遵循PolyATtract(mRNA Isolation System的操作要求分离纯化mRNA后,以Oligo(dT)为引物,遵循cDNASynthesis System操作步骤合成dscDNA.根据文献报道的VEGF基因序列,用Goldkey软件设计的PCR反应体系中的上下游引物,它们分别为:上游引物为:5'-CGGCTAGCGC-CTCCGAAACCA TGAACT-3',下游引物为:5'-GGTAC-CTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3',两条引物5'端下画线碱基序列分别为NheI和KpnI的酶切位点.以逆转录反应的产物dscDNA为模板,用保真性强的pfu TaqDNA聚合酶进行扩增,其中设计的上下游引物浓度各为1mM,反应参数为:94℃变性30秒,60℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,共25循环,后于72℃继续保温5min,反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.研究发现:经PCR反应后,获得的DNA片段长度为470bp左右,与预先实验设计相吻合.用干净的刀片切下含DNA片段的凝胶条,以PCR产物纯化试剂盒回收.纯化的DNA片段催化dATP加尾后,插入pGEM-T-Easy克隆载体中,构建的重组体转化DH-5a细菌,筛选出的阳性克隆命名为pT-VEGF.提取的重组质粒DNA,用限制性内切酶NheI和KpnI进行双酶切鉴定,酶切得到470bp大小的DNA片段.这进一步表明:VEGF基因的cDNA序列已克隆成功.pT-VEGF阳性克隆在ABI377全自动测序仪上进行序列分析,结果显示:通过RT-PCR方法克隆出来的DNA序列,与Genebank网站上的人VEGF121的cDNA序列完全一致,由Kozak序列,转录起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.因此,本研究克隆出了表达VEGF的cDNA序列,为下一步构建VEGF基因的表达载体,揭示VEGF作用的分子机制和体外大规模合成VEGF细胞因子奠定基础.
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脑胶质瘤Th1/Th2类细胞因子的漂移及意义
我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测了4株脑胶质瘤细胞株、52例新鲜脑胶质瘤标本和15例脑胶质瘤患者外周血标本的Th1/Th2类细胞因子的表达情况，初步探讨了脑胶质瘤Th2类细胞因子漂移的意义。 1．材料与方法：胶质瘤细胞株SHG-44、U251、C6和9L，购自上海细胞生物研究所或本室保存。胶质瘤组织标本52例，取自我院患者，术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。术后病理：星形细胞瘤Ⅰ级4例，星形细胞瘤Ⅱ级6例，间变性星形细胞瘤23例，多形性胶质母细胞瘤9例，少突胶质细胞瘤3例，脉络丛乳头状瘤1例，室管膜瘤2例，髓母细胞瘤4例。胶质瘤患者外周血标本15例，取自术前静脉血。细胞传代收获1×106个细胞；胶质瘤组织约1 cm3大小，仔细去除坏死组织；外周血5～10 ml，肝素抗凝，Ficoll梯度离心法分离出单个核细胞；总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法［1］。（1）检测指标：以IFN-γ、IL-2代表Th1类因子，IL-4、IL-6、IL-10、IL-13代表Th2类细胞因子，β-actin为内参照。（2）逆转录反应：5～10 μg细胞总RNA，加入0.1 mol/L DTT 2 μl、4×dNTP 1 μl、M-MLV 1 μl (200 U)、下游引物P2 1 μl(50 pmol/L)，总体积20 μl。37℃ 1 h后，95℃ 10 min灭活M-MLV。（3）PCR反应：继续加入25 mmol/L MgCl2 8 μl、4×dNTP 1 μl、上游引物P1 1 μl,总体积98 μl；95 ℃ 5 min后，加入Taq DNA聚合酶2 μl (1 U/μl) 。循环条件为94 ℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，后72℃延长7 min。（4）1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。
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尼古丁对炎性细胞活化及细胞间粘附分子基因表达的影响
本文观察了尼古丁对炎性细胞活化、炎性细胞与内皮细胞粘附及内皮细胞粘附分子表达的作用,同时观察764-3(从丹参中提取的单体)对上述部分作用的影响,将有助于阐明尼古丁在COPD等慢性炎症疾病发病中的作用并为防治提供实验资料.方法:按以往报道的方法,收集大鼠腹腔PMN,观察尼古丁作用下PMN释放的β-g及溶菌酶活性,以反映PMN的活化;培养脐静脉内皮细胞,加入PMN,以观察尼古丁对PMN-内皮细胞粘附的影响;转化及扩增含ICAM-IcDNA的质粒,酶切、PEG法纯化及琼脂糖凝胶电泳鉴定ICAM-IcDNA,提取内皮细胞总RNA,进行Northern blot,用光密度扫描仪确定杂交区带的光密度积分面积值代表mRNA水平,以观察尼古丁对ICAM-1 mRNA表达的影响.结果与结论:1.尼古丁对炎性细胞活化的作用.PMN加入尼古丁(500 μg/mL,下同)后β-g的活性(μg/10 7 h)由8.76±1.01(n=6,下同)增至26.01±3.87,溶菌酶的活性(μg/mL*h-1)由20.0±1.5增至47.0±5.8均P>0.05,加入764-3后则使两者活性分别降至17.62±4.10和38.9±6.6,与单加尼古丁相比P>0.05,说明尼古丁可活化PMN,764-3可对抗之.2.尼古丁对PMN和内皮细胞粘附的作用.加入尼古丁组与对照组相比粘附的PMN数(×104)由38.5±9.8(n=13,下同)增至61.0±4.4(P>0.05),加入764-3后则降至31.5±7.8,说明尼古丁可增强PMN与内皮细胞的粘附,764-3可对抗之.3.尼古丁对内皮细胞表达ICAM-1的影响.尼古丁刺激组与对照组相比mRNA的光密度值由479 477增至785 486,说明尼古丁可刺激内皮细胞的ICAM-1 mRNA表达增多.
