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PI3K抑制剂LY294002对鼠前脂肪细胞分化和C/EBPα及PPARγ表达的影响
目的 研究磷脂酰肌醇激酶(PI3 K)抑制剂LY294002对小鼠前脂肪细胞分化和CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响,探讨胰岛素受体底物(IRSs)/PI3K信号通路在前酯肪细胞分化中的作用.方法 小鼠3T3-L1细胞分为实验组和对照组,实验组加入LY294002(25 μmol/L),对照组加入同体积DMSO.应用0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10(-6)mol/L地塞米松和5 μg/mL胰岛素诱导两组前脂肪细胞分化,在培养的0d、2d、4d、8d分别收集细胞,实时PCR法及Western blot法检测细胞中C/EBPα和PPARγ表达水平.培养8 d油红O染色,观察细胞分化情况.结果 小鼠3T3-L1细胞基础状态下两组C/EBPα及PPARγ表达差异无统计学意义(P>0.05);诱导分化时实验组C/EBPα及PPARγ表达低于对照组(分别P<0.05,P<0.01).油红O染色示实验组细胞无明显脂滴.结论 PI3 K抑制剂LY294002能抑制小鼠前脂肪细胞分化及C/EBPα和PPARγ的表达,提示IRSs/PI3K信号通路可通过调节PPARγ和C/EBPα的表达在3T3-L1前脂肪细胞的分化中发挥重要作用.
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不同浓度葡萄糖对3T3-L1细胞分化及insig-1和insig-2 mRNA表达的影响
目的:观察不同浓度葡萄糖对小鼠前脂肪细胞(3T3-L1细胞)分化及insig-1和insig-2mRNA基因表达的影响,探讨insig基因在脂肪细胞分化与代谢中的作用.方法:将3T3-L1细胞分别在高葡萄糖浓度(25 mol/L G.S)、低葡萄糖浓度(5.5 mol/L G.S)和甘露醇(19.5 mol/L甘露醇+5.5 mol/L G.S)中诱导分化,利用油红"O"染色检测脂肪细胞分化,RT-PCR和原位杂交法检测insig-1和insig-2 mRNA、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(AP2)mRNA表达的动态变化.结果:随着3T3-L1细胞的分化,insig-1和insig-2 mRNA和AP2 mRNA表达逐渐上调,低糖诱导组及甘露醇对照组细胞分化程度显著低于高糖诱导组,但两组insig-1和insig-2 mRNA的表达较高糖诱导组明显上调(P＜0.05),而AP2mRNA表达则下调;低糖诱导组与甘露醇对照组细胞分化程度及各基因表达无明显差别.结论:葡萄糖浓度可影响脂肪细胞分化;低糖时脂肪细胞分化及脂质沉积相对受抑制,可能与insig基因表达上调有关.
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胰岛素对稳定表达人脂联素3T3-L1细胞P PARγ2m RNA表达的影响
目的 探讨胰岛素对稳定表达人脂联素3T3-L1细胞PPARγ2mRNA表达的影响.方法 重组脂联素真核表达质粒(pcDNA3.1+-hADPN)脂质体法稳定转染3T3-L1细胞.用胰岛素(500ng/mL)处理未转染、转染空载载体、转染pcDNA3.1+-hADPN的3T3-L1细胞,RT-pCR检测PPARγ2 mRNA的表达量.结果 ①稳定转染了pcDNA3.1+-hADPN的未分化和已分化3T3-L1细胞,PPARγ2表达量较未转染组明显增加(P＜0.01).②胰岛素可明显抑制PPARγ2 mRNA的表达(P＜0.05).③稳定转染pcDNA3.1+-hADPN可改善胰岛素抑制作用(P＜0.05).结论 稳定转染pcDNA3.1+-hADPN可明显增加未分化和已分化的3T3-L1细胞PPARγ 2 mRNA表达.胰岛素抑制PPARγ 2 mRNA表达,转染PcDNA3.1+-hADPN可改善胰岛素抑制作用.
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重组人脂联素真核表达载体的构建及表达
目的 为进一步研究脂联素(ADPN)的功能提供实验基础,构建含重组人脂联素(hADPN)真核表达载体的3T3-L1细胞株.方法 酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD18-T和真核表达质粒pcDNA3.1+,回收目的 基因片段与线性化的真核表达质粒,经连接、转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,经酶切和核苷酸序列测定鉴定.脂质体法转染3T3-L1细胞,G418筛选阳性细胞克隆扩增,通过RT-PCR的方法逆转录合成脂联素基因片段.结果 重组真核表达质粒酶切后获得5.4 kb和800 bp两个片段,大小与理论值一致.并经核苷酸序列测定证实.RT-PCR产物经凝胶电泳后于紫外分析仪下可见在250 bp前有一清晰条带,和扩增目的 基因片段长度234 bp一致.结论 成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒并在3T3-L1细胞中稳定表达.
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吡格列酮对前脂肪细胞分化及GILZ蛋白表达的影响
目的:探讨吡格列酮在3T3-L1前脂肪细胞分化及糖皮质激素诱导亮氨酸拉链(GILZ)蛋白表达调节方面的作用.方法:形态观察3T3-L1细胞分化过程,不同浓度吡格列酮(1×10-4mmol/L～1×10-2mmol/L)处理细胞48 h,然后于分化的第2、4、6天用油红O染色测定细胞甘油三酯相对含量,实时荧光定量PCR法检测过氧化物增殖活化受体(PPAR) γ2和脂蛋白酶(LPL)的mRNA表达.不同浓度药物处理细胞48 h后,Western blot检测GILZ蛋白表达.结果:油红O法显示甘油三酯相对含量随药物处理浓度的增加而增加,与对照组比,1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L组甘油三酯含量显著性增加(P＜0.05).实时荧光定量PCR检测显示PPARγ2、LPL的mRNA表达也是随着药物处理浓度的增加而增加.与对照组比,吡格列酮高于1×10-3mmol/L浓度时,PPARγ2、LPL的mRNA表达显著性增加(P＜0.01).Western blot显示GILZ蛋白表达随着药物处理浓度的增加而降低.结论:吡格列酮可下调GILZ表达,上调PPARγ2及下游LPL的表达.
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苦瓜总皂苷对3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞炎症因子的影响
目的：探讨苦瓜总皂苷对3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖摄取量、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的影响。方法采用MTT法确定苦瓜总皂苷浓度，利用油红“O”染色法鉴定脂肪细胞的形成，用地塞米松处理脂肪细胞复制胰岛素抵抗细胞模型，添加苦瓜总皂苷作用24 h后，运用实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT-qPCR）检测脂肪细胞中TNF-α和IL-6的mRNA表达，酶标记免疫吸附测定法（ELISA）检测培养液中TNF-α和IL-6蛋白含量变化。结果选定用于实验的苦瓜总皂苷的作用时间为24 h，浓度为苦瓜高剂量组（5 mg·mL-1）、苦瓜低剂量组（2.5 mg·mL-1）；诱导分化3T3-L1细胞12 d形成成熟细胞；地塞米松处理3T3-L1脂肪细胞48 h胰岛素抵抗脂肪细胞模型复制成功；苦瓜总皂苷干预3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞后，葡萄糖摄取量显著增高（P<0.01），TNF-α和IL-6的表达和蛋白分泌显著降低（P<0.01），并呈浓度依赖性。结论苦瓜可以改善胰岛素抵抗细胞模型的胰岛素抵抗状态，与降低炎症因子表达相关。
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柚皮苷对前脂肪细胞3T3-L1增殖和诱导分化的影响
目的 观察柚皮苷对前脂肪细胞3T3-L1增殖和分化的影响,并探讨其影响3T3-L1分化的可能作用机制.方法 培养3T3-L1细胞,并用不同浓度的柚皮苷进行干预,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖,用油红O染色和染色比色法分析脂肪细胞的分化程度.逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)mRNA的表达.结果 柚皮苷能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化,并能抑制PPARγ2、C/EBPα基因的表达.结论 柚皮苷可抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,并能通过下调分化相关基因的表达抑制分化.
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吡格列酮对早期脂肪细胞分化中PPARγ2启动子转录活性的影响
目的 探讨吡格列酮对脂肪细胞早期分化中PPARγ2启动子转录活性的影响及分子调控机制.方法 荧光素酶双报告基因法分别检测吡格列酮对MID诱导的3T3-L1分化细胞中含全长、C/EBP串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复串联重复序列及AP-1结合区的PPARγ2启动子转录活性的影响;染色体免疫共沉淀(ChIP)法检测GILZ蛋白与PPARγ2启动子区DNA的结合.结果 吡格列酮处理组各PPAR.γ2启动子区转录活性比对应的无吡格列酮对照组显著增加(P＜0.05,P＜0.01),C/EBP区的转录活性显著性高于AP-1区(P＜0.01).ChIP检测显示,吡格列酮处理组GILZ蛋白结合的PPARγ2启动子DNA明显低于对照组(P＜0.01).结论 吡格列酮可能降低GILZ蛋白与PPARγ2启动子DNA结合,增加PPARγ2启动子转录,从而增强脂肪细胞分化.C/EBP串联重复序列在吡格列酮增强PPARγ2启动子转录活性作用中起了主要作用.
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米非司酮对前脂肪细胞的分化及核因子κB激活的影响
目的：探讨米非司酮（RU486）对前脂肪细胞分化及核因子κB（NF-κB）激活的作用。方法：形态观察3T3-L1细胞分化过程，不同 RU486浓度的药物（0．1～10 mmol／L）处理细胞48 h，于分化的第9天油红O染色测定甘油三酯相对含量，实时荧光定量PCR法检测PPARγ2、C／EBPa、脂蛋白脂酶（LPL）和脂肪酸合成酶（FAS）的mRNA表达。免疫印迹检测IкBα蛋白水平，免疫荧光观察NF-κB蛋白核移位。结果：甘油三酯相对含量随药物浓度的增加而降低，与对照组比，从0．5μmol／L RU486处理开始甘油三酯相对含量显著性降低（P ＜0．05或P ＜0．01）。与对照组比，5μmol／L RU486组的PPARγ2、C／EBPa、LPL和FAS mRNA表达均显著性降低（P ＜0．01），IκBα蛋白含量降低（P ＜0．01），NF-κB 由细胞浆到细胞核的核移位。结论：RU486可下调IκBα蛋白水平，激活NF-κB 核移位，下调PPARγ2、C／EBPa、LPL和FAS的mRNA表达，抑制前脂肪细胞分化。
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白藜芦醇对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物合成的影响
目的 通过研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物合成的影响,探讨其在细胞能量代谢中的作用.方法 诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,分别设置对照组和10、20、40 μmol/L的Res干预组,油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,透射电镜观察细胞内线粒体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测线粒体合成过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子(peroxisome proliferato-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1orα)、含PR结构域的锌指蛋白16 (PR domaincontaining 16,PRDM16)的表达水平.结果 Res干预导致10、20、40μmol/L组细胞内的脂质蓄积量与对照组相比分别减少了10.7％、38.9％、62.9％(P均＜0.01);细胞内的线粒体数量增加,体积增大;细胞内PPARγ、PGC-1α、PRDM16蛋白表达水平增加.其中10 μmol/L组PPARγ、PGC-1α的表达量为对照组的(1.91±0.38)、(1.59±0.10)倍(P＜0.01),20 μmol/L组PPARγ、PGC-1α和PRDM16的表达量为对照组的(3.76±0.28)、(1.61±0.15)和(1.30±0.10)倍(P＜0.01),40 μmol/L组PPARγ、PRDM 16的表达量为对照组的(3.88±0.31)、(1.22±0.13)倍(P＜0.05).结论 Res可能通过促进3T3-L1细胞线粒体的生物合成,减少其脂质蓄积,从而提升细胞能量代谢水平.
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利培酮抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化
目的：研究利培酮对3T3‐L1前脂肪细胞分化的影响。方法采用经典的激素鸡尾酒法诱导3T3‐L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，油红O染色观察。向诱导培养基中加入利培酮研究其对3T3‐L1前脂肪细胞分化的影响。结果用激素鸡尾酒法成功地将3T3‐L1前脂肪细胞诱导为成熟的脂肪细胞。0．1、1、10μmol／L的利培酮均能够抑制3T3‐L1前脂肪细胞的分化。结论利培酮能够抑制3T3‐L1前脂肪细胞的分化。
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腺病毒载体介导的siRNA对3T3-L1细胞脂联素表达的影响
目的 构建携带小鼠脂联素(Acrp30)siRNA腺病毒载体,并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达的影响.方法 首先用KpnⅠ+NotⅠ双酶切本课题组前期构建的质粒pSilencer1.0-U6-Acrp30-1和pSilencer1.0-U6-Acrp30-3,得到目的 片段U6-Acrp30-1和U6-Acrp30-3,并将目的 片段亚克隆入穿梭质粒pShuttle,用PmeⅠ线性化穿梭质粒pShuttle-U6-Acrp30-1和pShuttle-U6-Acrp30-3,并与pAdeasy-1在BJ5183内同源重组,筛选、鉴定、测序后,在XL10-Gold中扩增重组腺病毒质粒,后在293细胞内包装扩增为重组腺病毒Ad-Acrp30-1和Ad-Acrp30-3.用此重组腺病毒感染3T3-L1脂肪细胞,用RT-PCR和ELISA检测其Acrp30 mRNA和蛋白表达.结果 设计并构建了小鼠Acrp30 基因特异性siRNA腺病毒载体,该载体感染脂肪细胞后,能显著抑制其Acrp30 mRNA和蛋白表达.结论 构建的Acrp30 基因特异性siRNA腺病毒载体能有效的抑制脂联素基因在3T3-L1脂肪细胞中的表达.
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MCHR1基因沉默对3T3-L1细胞诱导分化的影响
目的 运用RNA干扰技术沉默黑色素浓集激素受体1(Melanin-Concentrating Hormone Receptor 1,MCHR1)基因的表达,观察其对3T3-L1细胞诱导分化的影响,为肥胖症的基因治疗提供新思路.方法 用含绿色荧光蛋白的重组载体sh-MCHR1,通过脂质体法转染3T3-L1细胞.细胞诱导分化的同时用黑色素浓集激素(Melanin-Concentrating Hormone,MCH)干预,并在不同时点对脂滴进行油红O染色.采用RT-PCR以及Western blot分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor y,PPAR γ)、CCAAT/增强子结合蛋白-α(CCAAT/Enhancer-Binding Protein α,C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2,ap2) mRNA和蛋白的表达.结果 重组载体sh-MCHR1成功转染;与阴性转染组相比,sh-MCHR1转染组d 10后,油红O染液相对OD510值显著下降(P＜0.05);PPARγ、C/EBPα和ap2 mRNA的表达量分别在d6、d8和d8后显著下降(P＜0.05);3者蛋白的表达量均在d8后显著下降(P＜0.05).结论 shRNA沉默MCHR1基因可减缓3T3-L1细胞诱导分化,其可能通过抑制PPAR γ、C/EBPα和ap2的表达而实现.
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葛根素对3T3-L1前脂肪细胞分化及胰岛素抵抗模型糖代谢的影响
目的:研究葛根素(Pur)对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响,以及在胰岛素抵抗状态下对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢的影响.方法:不同浓度Pur干预3T3-L1细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响;油红0染色法检测其对前脂肪细胞分化过程及成脂的影响;地塞米松诱导3T3-L1细胞建立胰岛素抵抗模型,用不同浓度Pur进行干预,测定细胞的葡萄糖消耗量.结果:Pur(3～ 300μmol/L)对3T3-L1前脂肪细胞增殖无明显影响;Pur(30～ 300μmol/L)促进3T3-L1细胞的分化成脂,增加胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖代谢,且具有量效关系.结论:Pur能够促进3T3-L1细胞的分化成脂,增加胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖代谢,改善胰岛素抵抗.
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人参皂苷Rh1与Rg1对脂肪细胞增殖分化的影响比较
目的 比较人参皂苷Rh1与Rg1对3T3-L1细胞增殖分化的影响,为进一步研究Rh1对糖脂代谢的影响奠定基础.方法 以不同浓度的Rh1与Rg1(25、50、100μmol/L)处理3T3-L1细胞,以MTT比色法检测两者对细胞生长的影响.鸡尾酒法诱导3T3-L1细胞向成熟的脂肪细胞分化,诱导开始时即加入上述浓度的Rh1与Rg1,细胞分化成熟后测定细胞成脂程度,并测定细胞内PPARγ及脂联素基因和蛋白表达的变化.结果 (1)Rg1和Rh1均促进3T3-L1细胞的增殖,且在中高浓度下的Rh1更能促进细胞生长.(2)两者均抑制3T3-L1细胞的成脂分化,且Rh1的抑制作用更强.(3)与Rg1相比,Rh1在中高浓度下下调PPARγmRNA以及上调脂联素mRNA的作用都更强.(4)Rh1和Rg1均减少PPARγ的蛋白表达,增加脂联素的蛋白表达,且在中高浓度下Rh1的作用更显著.结论 人参皂苷Rh1对3T3-L1细胞的促增殖作用以及抑制分化作用都强于Rg1,且Rh1能显著下调细胞内PPARγ基因和蛋白的表达,并促进脂联素基因和蛋白的表达.
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黄芪提取物对3T3-L1细胞的影响及其部分作用机制
目的 观察黄芪提取物对3T3-L1细胞增殖、分化和分泌Leptin、PAI-1的影响,探讨中药黄芪调脂作用的部分机制.方法 培养3T3-L1细胞,并用不同浓度的黄芪多糖和黄芪甲苷进行干预,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖,用油红0染色和染色比色法分析脂肪细胞的分化程度.用ELISA法检测细胞培养上清中Leptin、PAI-1的含量.结果 黄芪多糖和黄芪甲苷均能促进前脂肪细胞的增殖和分化,且对Leptin分泌均有促进作用,而二者对PAI-1的分泌均有抑制作用.结论 中药黄芪调脂机制复杂,其可能通过促进前脂肪细胞的增殖与分化和影响脂肪细胞分泌功能而达到调脂作用.
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原纤毛在3T3-L1细胞向脂肪细胞分化过程中的动态变化及对脂滴生成的影响
目的 研究原纤毛在3T3-L1前体脂肪细胞分化中的表达及对脂肪分化的影响.方法 诱导3T3-L1前体脂肪细胞向脂肪细胞分化,在分化第0天和第4天分别孵育水合氯醛以化学方式抑制原纤毛.Western blot法检测原纤毛关键蛋白驱动蛋白3a(Kif3a)、鞭毛内转运蛋白88(IFT88)和乙酰化α微管蛋白(acAT)以及脂肪分化关键蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达;免疫荧光染色检测acAT反映原纤毛数目;双萤光素酶报告基因系统检测PPARγ基因启动子活性;油红染色检测脂滴沉积程度.结果 原纤毛关键蛋白Kif3a、IFT88以及acAT在分化第0天呈高表达,分化第2天表达降低,分化第4天表达恢复至第0天水平,分化第8天又明显减少.在分化第0天给予水合氯醛,可明显抑制原纤毛关键蛋白Kif3a、IFT88以及acAT的表达及数目,显著增加PPARγ的启动子活性和蛋白表达及脂滴沉积.而在分化第4天给予水合氯醛,与溶媒对照组相比,虽也显著抑制原纤毛生成,但PPARγ启动子活性和蛋白表达及脂滴沉积无明显变化.结论 原纤毛在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中呈动态变化;分化早期原纤毛减少可明显增加脂滴生成能力,然而一旦分化过程被启动,原纤毛减少不影响脂滴生成.
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pEGFP-C3 -insig2融合基因真核表达质粒的构建、表达及其对下游基因的影响
目的:构建insig 2基因的真核表达质粒, 转染3T3-L1细胞并观察对下游脂肪酸结合蛋白(AP2)mRNA、脂联素mRNA表达的影响.方法:采用RT-PCR法获取小鼠全长insig 2基因, 并克隆入真核表达载体pEGFP-C3中.酶切、测序鉴定后, 经脂质体转染入3T3-L1细胞, 通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达及下游基因的变化.结果:成功地构建了pEGFP-C3-insig 2融合基因的真核表达载体, 荧光显微镜观察到pEGFP-C3-insig 2融合蛋白在转染的3T3-L1细胞胞质中的表达, insig 2基因的转录明显上调.转染后24 h、 72 h较0 h AP 2 mRNA和脂联素mRNA的转录水平明显下调.结论:构建了insig 2基因的真核表达质粒, 在转染的3T3-L1细胞中insig 2的过表达可能影响该细胞的脂肪代谢.
关键词： Pegfp-C3-insig2 3T3-L1细胞 表达
