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牙周致病微生物与牙周病风险因素和临床指标的关系
目的:探讨牙周致病菌的分布特点与牙周病风险因素和临床指标之间的关系.方法:通过PCR方法特异性扩增细菌16S rDNA,明确10种主要牙周致病菌在正常和牙周病变部位的分布.结果:特定的牙周致病菌和细菌组合,与吸烟等牙周风险因素和临床指标之间存在相关性.结论:牙周病的发病和进展可能有其特定的细菌学病因.
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16S rDNA生物芯片微阵列方法检测立克次体的初步研究
目的:以16S rDNA为对象,生物芯片微阵列技术为平台,建立一种能在未知标本中快速检测6种立克次体的方法.方法:针对每种立克次体16S rDNA的可变区,分别设计和合成4条寡核苷酸探针.利用微阵列技术构建立克次体检测用生物芯片.待测立克次体染色体DNA用16S rRNA通用引物扩增掺入荧光素,然后与芯片杂交.利用各种立克次体的4条特异性探针是否全部出现杂交信号来做出判断.结果:以寡核苷酸为探针的生物芯片系统可以实现6种立克次体的检测.对伯氏考克斯体、汉氏巴尔通体、恙虫病东方体,本系统可以将其鉴定到种或属的位置.从第4号探针的不同可以将普氏立克次体和立氏立克次体这两个群区分开来.犬埃立克体检测始终为阴性,可能和没有合适的标本有关.从接到样品到判读出结果,整个检测过程大约需要4.5h.敏感性检测结果表明本法比PCR-电泳法敏感10倍.结论:利用16S rDNA生物芯片微阵列方法可以快速检测6种立克次体.
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16S rRNA序列同源性分析结合系统发育树构建鉴定6株生殖道乳杆菌
目的 对6株分离自健康妇女生殖道乳杆菌进行16S rDNA鉴定和系统发育分析.方法采用Nugent评分进行镜检,筛选健康女性阴道分泌物进行乳杆菌纯培养,抽提染色体DNA,16S rRNA PCR扩增,构建系统发育树.结果 采用16S rRNA序列同源性分析方法与系统发育树构建,鉴定201101菌株、201102菌株、201103菌株、201201菌株和201202菌株分别相应与唾液乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌及卷曲乳杆菌形成一个分支,验证可信度均达到100％；201104菌株16S rDNA序列与鸡乳杆菌的16S rDNA序列同源性达99％,系统发育树验证可信度达到98％以上.结论 16S rRNA序列同源性分析与系统发育树构建相结合,可以较准确鉴定细菌种类.
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T-RFLP快速分析慢性腹泻患者肠道菌群及其应用研究
目的建立快速检测分析人体肠道菌群的方法,协助慢性腹泻病原学诊断.方法上游引物的5′端用6-FAM进行荧光标记,PCR反应结束后选择适当的限制性内切酶酶切消化,在测序仪上通过毛细管电泳即可检测5′末端荧光标记的限制性片段.利用不同细菌产生的不同峰谱达到快速对细菌定性、定量的目的.对30例慢性腹泻患者和22例健康人进行肠道菌群分析,从而探讨菌群变化情况.结果该法能够对人体肠道菌群进行定性和定量分析,30例腹泻患者均发现肠道菌群紊乱.结论该法快速、特异、敏感.一个样品中能同时检测多种细菌,是一种很有希望的新技术.
关键词： 16S rDNA 聚合酶链反应 末端限制性片段长度多态性 肠道菌群 厌氧菌 -
脱腐预处理对土壤总DNA提取质量的影响
目的 探索一种提高土壤总DNA提取质量的简易脱腐方法.方法 于2014年3月,采集河南省某市农田4个采样区的混合土样(07、08、1A、2A).分别用脱腐预处理后试剂盒提取(预处理组)和直接试剂盒提取法(未预处理组)提取土样总DNA,对保守序列16S rDNA和非保守序列(抗生素抗性基因sulⅡ、tetM、tetC和1类整合子酶基因intI1)进行PCR扩增.采用Gene Genius凝胶成像系统定量分析软件Gene Tools进行灰度值分析.结果 预处理组和未预处理组提取的各个土壤总DNA均可扩增出16S rDNA,且PCR产物灰度值差异无统计学意义(均P＞0.05);非保守序列sulⅡ、tetC和intI1基因的PCR扩增产物灰度值在两组中差异无统计学意义(均P＞0.05);预处理组tetM基因的表达水平高于未预处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).未预处理组的sul Ⅱ、tetM、tetC和intI1基因PCR扩增产物中均检测出了非特异性条带,而预处理组目的条带单一、较少非特异性条带.结论 脱腐预处理方法提取的土壤总DNA更有利于后续分子生物学实验.
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空气环境中葡萄球菌的鉴定及耐药性分析
目的 对环境中分离的葡萄球菌进行种属鉴定和药敏实验,研究环境中葡萄球菌的分布状态、生化特性和耐药特征.方法 以空气撞击法收集石家庄市距地面10～15 m的室外空气微生物样品37份及某公共场所室内空气样品5份,对分离的细菌纯化培养后进行革兰染色、16S rDNA序列分析、生化鉴定和耐药性分析.结果 分离出19株葡萄球菌属细菌,分别属于头状葡萄球菌(6株)、人葡萄球菌(4株)、溶血葡萄球菌(3株)、表皮葡萄球菌(2株)、猪葡萄球菌(1株)、沃氏葡萄球菌(1株)、葡萄球菌科氏亚种(1株)和金黄色葡萄球菌(1株).环境中人葡萄球菌和表皮葡萄球菌对头孢类、氨基苷类、大环内酯类和氟喹诺酮类药物敏感;人葡萄球菌和溶血葡萄球菌对四环素类药物敏感;葡萄球菌均对磺胺类药物有不同程度的耐药.结论 空气环境中存在多种葡萄球菌,且对抗生素有一定耐药性.
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城市污水中气味类香菌的分离与鉴定
目的 分离并鉴定城市污水中的病原细菌--气味类香菌.方法 采用选择性培养基细菌分离方法,从城市污水中分离出菌株JD23,利用16S rDNA分子生物学技术和生物信息学技术,通过16S rDNA序列分析,构建系统发育树,结合常规生理生化实验和形态学观察鉴定菌株种属,并确定其分类学地位.结果 该菌株与Myroides odoratus M58777.2相似度达98%,结合常规生理生化实验和形态学观察,进一步确定JD23为气味类香菌.结论 选择性培养基结合16S rDNA序列分析方法可分离并鉴定城市污水中的气味类香菌.
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基于16S rDNA序列分析研究根腐病三七根内可培养细菌的多样性
目的 分析根腐病三七根内可培养细菌的多样性.方法 用牛肉膏蛋白胨培养基分离根腐病三七根内的细菌,经细菌通用引物27F/1492R扩增16S rDNA后,分别用Rsa Ⅰ和Hin6 Ⅰ限制性内切酶对扩增产物进行酶切,结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法和DNA测序技术,对分离自根腐病三七根内的细菌进行初步鉴定.结果 根腐病三七根内的细菌分属于8个类群,依占总菌数的比例分别是芽孢杆菌属Bacillus 22.47％、无色杆菌属Achromobacter 5.62％、寡养单胞菌属Stenotrophomonas 5.62％、类芽孢杆菌属Paenibacillus 4.49％、鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium 1.12％、苍白杆菌属Ochrobactrum 1.12％、不动杆菌属Acinetobacter 1.12％及肠杆菌科的一些属58.43％.结论 泛菌属和芽孢杆菌属是根腐病三七根中的两大优势细菌类群.
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16S rDNA测序在呼吸机相关性肺炎痰液细菌多样性分析中的应用
目的 用16S rDNA测序研究呼吸机相关性肺炎(VAP)患者痰液中致病菌的种类和丰度,探讨VAP病原学诊断的新方法.方法 对31例VAP患者进行支气管肺泡灌洗,提取痰液标本细菌DNA,进行聚合酶链反应(PCR)鉴定,同时进行痰液细菌培养.利用16S rDNA测序技术进行宏基因测序及生物信息学分析,并将测序结果与细菌培养结果比较.结果 ①31例VAP患者中27例患者的痰液标本550 bp处扩增出特异的DNA产物用于测序分析.16S rDNA测序共得到103 856条序列,39 Mb的原始数据.Tag物种注释27份样本均可注释到属的水平.②样本复杂度分析:Alpha多样性分析显示27份样本Shannon指数约为1.20,Simpson指数约为0.48,表明VAP痰液样本中细菌物种丰富且较为复杂.稀释曲线趋势分析提示部分VAP痰液样本还存在较多未被测序检测到的物种.③样本多样品分析:VAP痰液样本16S rDNA测序分析共出现放线菌门、拟杆菌门、硬壁菌门和变形菌门4个细菌门.以属为分类标准,优势菌属为链球菌属88.9％(24/27),变性菌属77.8％(21/27),不动杆菌属70.4％(19/27),鞘氨醇单胞菌属63.0％(17/27),普氏菌属63.0％(17/27),克雷伯菌属55.6％(15/27),假单胞菌属55.6％(15/27),水杆菌属55.6％(15/27),棒状杆菌属55.6％(15/27).④16S rDNA测序法与细菌培养结果比较:测序法检测可发现普通细菌培养未检测到的普氏菌属、变性菌属、水杆菌属、鞘氨醇单胞菌属;两种方法共同检测到的7种菌属中,测序法检测到的链球菌属[88.9％(24/27)]、克雷伯菌属[55.6％(15/27)]、不动杆菌属[70.4％(19/27)]、棒状杆菌属[55.6％(15/27)]的阳性率均高于普通细菌培养[分别为18.5％(5/27)、18.5％(5/27)、37.0％(10/27)、7.4％(2/27),P＜0.05或P＜0.01],假单胞菌属阳性率较普通细菌培养法有增高趋势[55.6％(15/27)比25.9％(7/27),P=0.050];而测序法与细菌培养检测到葡萄球菌属[7.4％(2/27)比11.1％(3/27)]、奈瑟菌属[18.5％(5/27)比3.7％(1/27)]的阳性率则均无差异(均P＞0.05).结论 16S rDNA测序分析证实VAP患者的痰液致病菌菌种复杂多样,物种丰富,多种多重耐药菌株定植.与普通细菌培养比较,16S rDNA宏基因组测序发现病原体阳性率更高.16S rDNA基因测序技术可能成为VAP病原学诊断的新方法.
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雾霾中检出1例西宫微球菌的报告
目的 对分离自雾霾的一株溶血性细菌进行种属鉴定.方法 使用自然沉降法收集某地雾霾环境下的微生物进行培养,对分离的细菌纯化培养后进行革兰氏染色、16S rDNA序列分析和生化鉴定.结果 从雾霾中分离获得一株革兰氏阳性球菌,经生理生化反应鉴定为西宫微球菌,16S rDNA测序分析与生化结果一致.结论 雾霾空气中存在条件致病菌西富微球菌,鉴定该菌对研究和防治公共卫生安全有重要意义.
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16S rDNA克隆文库法与PCR-DGGE法在口腔菌群分析中的对比研究
目的 比较16S rDNA克隆文库法与变性梯度凝胶电泳联合PCR法(PCR-DGGE)在口腔微生物多样性研究中的检测效率. 方法 采集6例逆行性牙髓炎患者根管细菌样本,提取细菌总DNA,采用细菌通用引物27F/1492R、HAD-1/2分别扩增16S rDNA的全长或V2-V3区域,PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳和DGGE分离,纯化目的条带后克隆测序.测序结果与数据库序列比对,鉴定细菌组成. 结果 琼脂糖电泳分离到16S rDNA约1.5 kb条带,每个样本检测到8-15种细菌;DGGE分离到V2-V3区约含6-12条位置不同的239 bp谱带,每个样本检测到6-12种细菌. 结论 与DGGE法相比,16S rDNA克隆文库法测得的菌群更全面,敏感性和特异性更高.
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结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立
目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价.方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR( FQ-PCR)反应体系；提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本；以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV).结果靶向Mtb 16S rDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA) 1.2 pg/μL,即(38.9 +3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27％和1.26％.结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测.
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新疆油污土壤中石油烃降解菌筛选及鉴定
目的 从新疆克拉玛依油田油污土壤中筛选具有降解能力的菌株,为今后构建本源石油降解微生物菌群提供技术支持和菌种储备.方法通过以石油烃为唯一碳源的选择培养基的分离培养,获得能够利用石油烃为碳源的菌株,并通过16S rDNA序列测定方法对菌株进行鉴定.结果分离得到18株能以石油作为唯一碳源和能源的石油降解菌株,通过序列分析,初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、动性球菌属(Planococcus sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、短杆菌属(Brevibacillus agri sp.)等5类.在不同土壤中分离出的降解菌株不同,含油量较高的土壤中种类较多.结论新疆克拉玛依油田油污土壤中的石油降解菌株以假单胞菌属为主,而且随着污染严重程度的不同降解菌株的种类也不同.
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大黄酸对糖尿病小鼠肠道菌群影响的初步研究
目的 研究大黄酸对2型糖尿病模型(db/db小鼠)和正常对照模型(db/m小鼠)肠道菌群丰度、种类的影响.方法 将db/db小鼠和db/m小鼠分为随机分为实验组、对照组,在标准饮食的基础上分别给予大黄酸溶液(120mg/kg)和纤维素钠溶液(1％)灌胃,分别于实验0、2、3周无菌收集小鼠粪便,进行V3-V5、V5-V6高可变区16S rDNA基因组测序,分析四组小鼠肠道菌群组成结构和菌落多样性的变化,并比较各组间差异.结果 大黄酸治疗后两组小鼠拟杆菌明显增多,硬壁菌明显减少,两组小鼠肠道菌群多样性指数(Shannon-Wiener指数)治疗后均降低.db/db组小鼠血糖较对照组降低(t=3.499,P=0.013).结论 大黄酸可以增加db/db小鼠和db/m小鼠肠道中拟杆菌数量,减少硬壁菌数量,同时db/db小鼠和db/m小鼠肠道菌群多样性在大黄酸治疗后都降低.
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一株拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的初步研究
目的 对一株具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的特性进行研究.方法 采用菌落法测试多株芽孢杆菌对18种不同来源致病菌的抑制效应,并对其中一株可拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌(KC株)进行鉴定和电泳分析.结果 该芽孢杆菌(KC株)经生理生化以及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌;KC株对人源、鱼源、畜禽源和鸡粪源的多重耐药菌有不同程度的拮抗效应;SDS-PAGE分析提示,35 kD左右的分泌蛋白可能参与了KC株的抑菌活性.结论 具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌,且该菌分泌的35 kD蛋白可能参与抑菌活性.
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一株携带质粒的人两歧双歧杆菌的分离与鉴定
目的:分离携带天然质粒的人双歧杆菌.方法:用自制的改良型Blb双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离双歧杆菌,对初步质粒检测阳性的单菌落通过糖发酵试验、(G+C)mol%测定和16S rDNA序列分析,进行菌株鉴定.结果:筛选到一株携带天然质粒的人双歧杆菌,编号B200304,在1.0%琼脂糖凝胶上,测得质粒的相对分子质量约为22 kb.通过对该菌株的形态学观察和糖发酵试验等生理生化特征研究,证明该菌株为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum);HPLC法测得其(G+C)mol%为55.6,16SrDNA序列分析进一步证实该菌株为两歧双歧杆菌.结论:分离得到一株携带天然质粒的人两歧双歧杆菌新菌株.
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粪便乳杆菌新种在中国的再发现
目的 分离鉴定白鹭粪便中的乳杆菌.方法 使用乳杆菌PCR快速检出技术检出白鹭粪便样品中的乳杆菌.将乳杆菌的保守基因16S rDNA、rpoA和recA克隆测序,并进行序列分析.使用细菌微量生化管和常规生化试验测定乳杆菌糖发酵产酸等生化特征.结果 从白鹭粪便样品得到1株乳杆菌菌株FZB1,其16S rDNA基因和粪便乳杆菌AFL13-2的16S rDNA基因相似,相似性为99.2％.RpoA的氨基酸残基序列比对结果表明:该菌株和姬鼠乳杆菌、动物乳杆菌、鼠乳杆菌的亲缘关系近,其相似性分别达到了97.1％、97.1％和96.7％.该菌株的RecA氨基酸残基序列和粪便乳杆菌完全相同,和姬鼠乳杆菌、动物乳杆菌、鼠乳杆菌的RecA氨基酸残基序列有较高的相似性,分别为91.9％、91.5％和91.5％.生化鉴定结果表明:该菌株符合乳杆菌属和粪便乳杆菌的生化特征.结论 我们从中国的白鹭粪便中分离鉴定到了一株粪便乳杆菌,这是2013年在南非发现的新种.粪便乳杆菌在中国的再次发现充实了乳杆菌种质资源库,证明了粪便乳杆菌的广泛分布.
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玉溪地区自然陈化烟叶表面可培养细菌多样性研究
目的 为了较全面的了解陈化烟叶的细菌多样性,进一步挖掘其中的有益微生物.方法 以种植于玉溪元江县的红大烤烟品种为材料,利用16S rDNA克隆测序技术,系统研究了云南玉溪红塔区和元江县两仓库中不同自然陈化时期烟叶表面可培养微生物的种群结构.结果 陈化初期,烟叶表面细菌数量较少,元江县低水分烟叶陈化30 d时细菌数量达到高峰;红塔区高水分烟叶陈化4.5个月时细菌数量达大;经过16S rDNA鉴定,烤烟叶面细菌包括芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobactersp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)和泛菌属(Pantoea sp.)等8个细菌属.结论 不同时期、不同地点陈化烟叶表面细菌的优势种群不尽相同,而芽孢杆菌属始终为优势种群.另外,研究中分离到的大量可培养细菌,为进一步筛选烟叶表面有益细菌提供了重要线索.
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三联益生菌对便秘小鼠肠道推进功能改善及其对小鼠肠道菌群调节作用的研究
目的 研究新型嗜酸乳杆菌NCFM-乳双歧杆菌Bi-07-鼠李糖乳杆菌NH001三联益生菌制剂对便秘小鼠小肠蠕动的促进作用, 以及其对小鼠肠道菌群构成比例的调节作用.方法 小肠推进率实验:将50只KM小鼠适应性饲养后随机分为空白对照组、模型对照组和低中高三个剂量组.空白对照组和模型对照组给予蒸馏水, 低中高剂量组每天分别给予0.165、0.330、0.990g/ (kg·bw) 益生菌制剂, 灌胃14d后使用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型观察小肠墨汁推进率;肠道菌群调节作用实验:将42只BALB/c小鼠中随机抽取10只作为自身对比空白组, 适应性饲养后将所有小鼠随机分为空白对照组和低中高三个剂量组, 空白对照组给予蒸馏水, 各剂量组以相同剂量给予益生菌制剂灌胃.自身对比空白组于灌胃前无菌采集小鼠直肠粪便, 所有小鼠灌胃30d后无菌采集直肠粪便, 使用16SrDNA基因测序对粪便中菌群DNA进行多样性及各水平菌群物种测定.结果 高剂量组便秘小鼠小肠推进率显著高于模型对照组 (P<0.05) ;各剂量组肠道菌群多样性、双歧杆菌属、乳杆菌属数量较灌胃前显著增加 (P<0.05) , 大肠埃希菌属、梭菌属、肠球菌属较灌胃前显著降低 (P<0.05) .结论 三联益生菌能够有效促进便秘小鼠肠道蠕动能力, 改善便秘症状;同时对小鼠肠道菌群结构有调节作用.
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应用PCR与温度梯度凝胶电泳分析龈上菌斑微生物群落
目的应用PCR与温度梯度凝胶电泳(PCR-TGGE)分子技术对成年健康口腔的龈上菌斑中微生物群落组成进行分析.方法8例成年个体包括4男4女,年龄19～29岁,分别采取每例个体上下颌牙周龈上菌斑样品,共18份(个体Subl间隔10天采集2次样品).提取菌斑DNA,PCR扩增16S rDNA V3可变区,产物经TGGE后进行相似系数分析.结果同一个体的上下颌微生物群落组成相似性系数为81%～95%,而不同个体的龈上菌斑微生物群落组成相似性系数,均在60%以下.结论不同个体具有其独特的牙周微生物群落,而且在一定时期内组成稳定.
