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一种新的实时荧光定量PCR方法对血小板制品细菌污染检测效果的评价
目的 建立一种自主研发的针对细菌16 S rDNA基因的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法并评价该方法对浓缩血小板制品中细菌污染检测的效果.方法 设计16S rDNA基因保守区引物,构建SYBR Green Real-timePCR反应体系;然后分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和绿脓杆菌以初始浓度为1CFU/mL、10 CFU/mL和100 CFU/mL接种到浓缩血小板中,经22℃保存7d后,用实时定量荧光PCR方法进行细菌检测.结果 细菌污染后的血小板在常规保存条件下,长保存期＜7d,不同接种浓度的细菌生长情况的变化趋势基本一致,所有种类的细菌均在d1、2表现出迅猛的增殖高峰,d3以后增殖趋于平缓.结论 该Real-time PCR检测体系可定量地检测出血小板的细菌污染的情况,可适用于血小板输注前的快速细菌污染检测.
关键词： 浓缩血小板 细菌污染 实时荧光定量PCR 16S rDNA SYBR Green -
芽孢杆菌BI1的鉴定及其抑菌性研究
目的 对本实验室分离得到芽孢杆菌B11进行鉴定.方法 将该菌株的16S rDNA基因序列与GeneBank中已鉴定的16S rDNA序列对比,并结合生理生化实验综合分析.结果 菌株B11与枯草芽孢杆菌亲缘关系为接近,16S rDNA基因相似性达到99.6%,生理生化实验结果与标准枯草芽孢杆菌一致.结论 将芽孢杆菌B11鉴定为枯草芽孢杆菌.
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16S rDNA测序鉴定β溶血性G群链球菌
目的 对一起群聚性儿童肾小球肾炎暴发事件中分离到的26株β溶血性G群链球菌进行16S rDNA测序鉴定,探讨该方法在病原学鉴定方面的意义.方法 分别采用API20 Strep生化鉴定系统、部分和全序列测定16S rDNA鉴定26株β溶血性G群链球菌;使用Mega V3.1软件,采用Neighbour-joining 方法和boot-strap test对部分菌株的全序列进行树状图分析.结果 API20 Strep生化鉴定率低,未能鉴定出目的菌;采用16S rDNA测序,结果均为咽峡炎链球菌(S.anginosus),鉴定率大于97%.其中4株G群的全序列树状图分析显示,G群链球菌均与咽峡炎链球菌聚类在同一簇.结论 16S rDNA序列鉴定能提供详细明确的核苷酸信息,能区分G群链球菌不同的种,显示其在菌株鉴定方面的独特优势.
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急性肝衰竭时小鼠胆汁内微生态变化的研究
目的:研究急性肝衰竭对小鼠胆汁内菌群的影响.方法:将12只SPF级健康BALB/c小鼠分为肝衰竭模型组(M组)和对照组(K组),M组小鼠采用D-氨基半乳糖建腹腔注射建立肝衰竭模型,K组小鼠腹腔注射等量生理盐水作为对照,造模后24 h,采集小鼠血清行丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBiL)及胆碱酯酶(CHE)生化检测;采集小鼠胆汁,通过高通量测序技术测定细菌16SrDNA的V3+ V4区细菌丰度及多样性;HE染色观察肝脏组织的病理变化,LEfSe分析肝衰竭前后各段的差异菌.结果:血清生化指标和HE染色结果提示,M组小鼠肝衰竭模型建立成功;K、M两组小鼠的胆汁内均包含拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、蓝藻菌门和放线菌门这5个优势菌门;门水平上,M组小鼠胆汁内Thermi的相对丰度高于K组,差异有统计学意义(P＜0.05);科水平上,与K组相比,M组小鼠胆汁内乳杆菌科增多(P＜0.05).结论:急性肝衰竭可能会导致胆汁内乳酸杆菌科增多.
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贵州省部分地区阴道毛滴虫与人型支原体共生情况
目的：了解贵州地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况。方法：以贵州部分地区女性阴道毛滴虫病患者阴道后穹隆分泌物中采集的阴道毛滴虫虫株，实验室达到纯培养后，采用Chelex-100的方法提取滴虫基因组DNA，设计人型支原体16S rDNA特异引物，进行聚合酶链式反应（ PCR），琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行分析，观察滴虫细胞内人型支原体共生情况。结果：从临床共采集到165株虫株中，83株获得纯培养；83株中人型支原体检测结果显示有47株阳性，阳性率为56.6%。结论：阴道毛滴虫虫株与人型支原体共生情况在我国贵州地区普遍性存在。
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PCR-DGGE法检测大鼠胃肠道菌群结构的电泳条件探讨
目的:探讨PCR-DGGE技术检测大鼠肠道菌群结构的电泳条件,以获得更好的DGGE电泳图谱优化实验方法.方法:常规采集大鼠胃肠道各节段(胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠)及内容物,提取细菌总DNA,采用细菌16srDNA V3区通用引物进行PCR扩增,扩增产物在6种不同电泳条件下(分别为:200v、60℃、4h;150v、60℃、4h;150v、60℃、4.5h;150v、60℃、6h;150v、60℃、8h;85v、60℃、16h)进行DGGE分析并比较不同方法的优缺点.结果:同一样本在不同电泳条件下的PCR-DGGE图谱多样性指数、清晰度、条带数、位置等有显著性差异,其中以(200v、60℃、4h)条件下的分析效率佳.结论:电压、温度和时间等电泳条件可影响PCR-DGGE图谱多样性指数、清晰度、条带数、位置,在本实验条件下以(200v、60℃、4h)的电泳图谱效果佳.
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放线菌16S rDNA 片段扩增方法的优化
目的：通过对放线菌PCR扩增方法的综合改进，找到某些用常规手段难扩增的放线菌16S rDNA的佳PCR扩增条件。方法（1）提取放线菌基因组DNA并对其进行PCR扩增以找到适退火温度；（2）改变PCR反应体系中模板DNA和Mg2＋的浓度；（3）在反应体系中加入适量的二甲基亚砜。结果在25μL的PCR反应体系中，模板DNA浓度为10×、加入0．5μL的Mg2＋和5％的二甲基亚枫、退火温度为59℃时对放线菌16S rDNA扩增效果为理想。结论本实验研究出一种扩增放线菌16S rDNA的优化条件，为今后大批量的放线菌的分子生物学研究提供了更加高效、方便、快捷、经济的实验方法。
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前列腺液16s rDNA检测在慢性前列腺炎诊治中的临床意义
目的 探讨前列腺液16s rDNA检测对慢性前列腺炎的临床诊断和治疗意义.方法 选择符合美国国立卫生研究院(NIH)诊断标准的Ⅱ型前列腺炎和Ⅲ型前列腺炎患者67例.常规前列腺液镜检和细菌、支原体、衣原体检查,并对前列腺液中的16s rDNA进行PCR检测,治疗全部采用以抗生素为主的综合治疗.以慢性前列腺炎症状指数(NIH-CPSI)为疗效指标,治疗4周后进行疗效比较.结果 Ⅱ、ⅢA和ⅢB型前列腺炎16s rDNA阳性率分别为100%(11/11)、62.5%(20/32)、66.7%(16/24).Ⅱ型前列腺炎治疗显效率100%;在Ⅲ型前列腺炎中,ⅢA、ⅢB组无差异,而16s rDNA阳性组治疗总显效率(80.0%)明显高于16s rDNA阴性组(52.4%)(P<0.05).结论 前列腺液16s rDNA表达与前列腺炎的疗效有良好的相关性,可作为Ⅲ型前列腺炎选用抗生素治疗的依据,并对前列腺炎分型有一定参考价值.
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肿瘤研究常用动物小鼠病原菌16s rDNA检测方法的建立
目的:建立肿瘤研究常用动物小鼠病原菌快速检测方法.方法:提取经常规方法已被鉴定的小鼠病原菌绿脓杆菌、溶血性链球菌和大肠埃希氏菌DNA,利用PCR技术扩增病原菌16s rDNA全长,经纯化后直接测序.利用BLAST软件从GenBank数据库中搜索相关菌株的序列进行序列比对和同源性分析,确定病原菌的种属.结果:测序结果与数据库中搜索到的相关菌株的序列进行序列比对显示,3种病原菌测序序列分别与绿脓杆菌、溶血性链球菌和大肠埃希氏菌序列一致.结论:16s rDNA PCR方法可准确地检测肿瘤研究常用动物小鼠病原菌绿脓杆菌、溶血性链球菌和大肠埃希氏菌感染,并且缩短了检测时间.
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肿瘤研究常用动物兔病原菌16s rDNA检测方法的建立
目的:建立肿瘤研究常用动物兔病原菌的快速检测方法.方法:提取经常规方法已被鉴定的兔李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌DNA,利用PCR技术扩增病原菌16s rDNA全长,经纯化后直接测序.利用BLAST软件从GenBank数据库中搜索相关菌株的序列进行序列比对和同源性分析,确定病原菌的种属.结果:测序结果与数据库中搜索到的相关菌株的序列进行序列比对显示,3种病原菌测序序列分别与兔李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌序列一致,证实了此种方法的可靠性.结论:16s rDNA PCR方法可准确地检测肿瘤研究常用动物兔病原李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌感染,并且缩短了检测时间.
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肿瘤研究常用动物犬和猴病原菌16srDNA检测方法的建立
目的：建立肿瘤研究常用动物犬和猴病原菌的16s rDNA PCR检测方法。方法：提取犬病原菌布鲁杆菌、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和猴病原菌志贺氏菌DNA，经过通用引物扩增，PCR产物为病原菌16s rDNA全长，经纯化后直接测序。利用BLAST软件从GenBank数据库中搜索相关菌株的序列进行序列比对和同源性分析，确定病原菌的种属。结果：测序结果与数据库中搜索到的相关菌株的序列进行序列比对显示，4种病原菌测序分别与布鲁杆菌、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和志贺氏菌序列一致。结论：利用16s rDNA PCR方法可快速准确地检测肿瘤研究常用动物犬和猴病原菌，对保证肿瘤研究准确性有重要意义。
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采用16S rDNA全长序列分析和生化反应鉴定乳酶生菌株
目的:对乳酶生菌株进行鉴定,对质量标准修订提供依据.方法:采用16S rDNA全长序列测定,对从不同来源的乳酶生制剂中分离的菌株,生产菌株140623和其他参考菌株进行鉴定,并进行系统发生树分析,同时采用生化反应对鉴定结果进行验证.结果:从乳酶生制剂中分离获得的菌株和生产菌株140623均鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium),且相互之间具有很高的同源性.结论:现行乳酶生质量标准中的“肠链球菌(Streptococcus faecalis)”建议改名为“屎肠球菌(Enterococcus faecium)”.
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利用16S rDNA序列鉴定常见嗜尸性蝇类种属
目的 通过分析16S rDNA 551bp基因序列,鉴定常见嗜尸性蝇类种属.方法 随机采集17个地区放置于室外草地的家兔尸体上7个种24只嗜尸性苍蝇样本,经形态学鉴定种类后,提取胸肌DNA,对16S rDNA 551bp基因片段进行PCR扩增,产物纯化、测序后上传GenBank；利用MEGA 4.0软件构建序列间的系统发育树,分析建立种内及种间进化分歧表.结果 24只样本16S rDNA序列分析显示7种蝇类可以较好聚类；其中棕尾别麻蝇种内进化分歧整体均数为2.8％,家蝇为1.5％,丽蝇科的5个种均在0.7％以内.上述7个蝇种的种间进化分歧均数在1.6％ ～7.1％之间.其中,棕尾别麻蝇、家蝇与其它蝇类的种间分歧均数在4.0％ ～7.1％之间.结论 本文分析结果显示,蝇种间同源性相差明显,采用mtDNA 16S rDNA中551bp基因序列分析,可进行蝇种鉴定.
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PCR-DGGE法检测浮游生物16S rDNA在溺死鉴定中的应用
目的 建立并评估PCR-DGGE法检测浮游生物对溺死鉴定的应用价值.方法 大白兔30只随机分为3组:溺死组(n=12),死后抛尸组(n=12)和对照组(n=6);溺死组和死后抛尸组又分为2个亚组:东湖水域组(n=6)和墨水湖水域组(n=6).死后提取心血和肺、肝、肾、脑等组织,匀浆后,采用Percoll密度梯度离心法分离浮游生物并提取其DNA,PCR扩增浮游生物特异的16S rDNA片段后分别用琼脂糖凝胶电泳及DGGE检测分析.2个溺死案例检材同法检验.结果 溺死组各组织器官中浮游生物检测多呈阳性:肺(100%)、肝(83%)、肾(75%)、心血(83%)、脑(42%);死后抛尸组仅2例肺组织(16.7%)检出阳性;对照组全部阴性.溺尸肺组织DGGE分型网谱与相应溺死点水样分型图谱相似,而与非溺死点水样分型结果差异显著.2实际案例均呈阳性.结论 本方法不仅有助于定性诊断溺死,而且通过比较产物的多样性可以推断溺死地点,在法医学溺死鉴定中具有较大实用价值.
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浮游生物16S rDNA检测在大鼠溺死鉴定中的价值
目的 建立浮游生物16S rDNA PCR检验法应用于溺死的鉴定.方法 将15只SD大鼠随机分为溺死组、死后抛尸组和正常对照组,死后分别取脑、肝、肾和肺等脏器,提取DNA,用特异性引物扩增浮游生物16S rDNA第三和第四可变区特异片段.结果 溺死组5例,肺全部检出(100%)浮游生物16S rDNA;肝、肾分别检出4例(80%);脑检出3例(75%).死后抛尸组仅1例在肺中检出浮游生物(20%).正常对照组均未检出. 结论浮游生物16S rDNA PCR检验法可用于溺死的鉴定.
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溺死诊断中的浮游生物检测法
溺水是常见的死亡原因之一,浮游生物检验是法医学鉴定溺死的重要依据.浮游生物检验方法可分为破机法、非破机法和分子生物学方法三大类.前两者主要以形态标记为检验对象,依赖于浮游生物的理化特性,有很大局限性.分子生物学方法以分子标记为检验对象,适用范围广,信息丰富,是值得探索的新方法.本文回顾溺死鉴定中的各种浮游生物检测法,供法医工作者在实践和研究中进行参考.
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16S rDNA序列分析在嗜尸性蝇类鉴定中的应用
目的通过mtDNA上16SrDNA中551bp基因序列分析,解决依据COⅠ和COⅡ上278bp和635bp基因序列难以鉴别丝光绿蝇、铜绿蝇种类的难题,为法医学嗜尸性苍蝇种类的鉴别提供依据.方法随机采集放置在呼和浩特及成都地区室外草地家兔尸体上的铜绿蝇和丝光绿蝇,对其mtDNA上16S rDNA中551 bp基因序列进行分析、比对,构建系统发育树.结果通过对嗜尸性蝇类mtDNA上16S rDNA的551 bp基因序列分析可以对丝光绿蝇和铜绿蝇进行鉴别.结论16S rDNA上551 bp基因序列分析是对嗜尸性蝇类(尤其是铜绿蝇和丝光绿蝇)进行种类鉴定的有效方法,是对依据CO Ⅰ和COⅡ序列分析方法鉴别嗜尸性苍蝇种类的重要补充.
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硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鉴定中的比较
目的：比较和探讨硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鉴定中的应用价值。方法收集40例温州医科大学法医学系2010-2011年受理并证实溺死的鉴定案件，每例案件标本包括肺、肾、肝及现场水样4份样本，分别运用硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法对标本进行检验，硅藻硝酸消化法和浮游生物16S rDNA PCR法所需各器官检材量分别为约20 g和2 g，现场水样分别为15 mL和1.5 mL，从所需检验时间以及检出率等方面进行比较分析。结果硅藻硝酸消化法检出硅藻主要为中心硅藻纲和羽纹硅藻纲，浮游生物16S rDNA PCR法可扩增出一条162 bp的条带。平均检验每例案件所需的检验时间，硅藻硝酸消化法为（95.30±2.78） min，少于浮游生物16S rDNA PCR法（325.33±14.18） min（P<0.05）。两种方法对现场水样及肺样本的检出率均为100%，而对肝及肾样本的检出率，浮游生物16S rDNA PCR法均为80%，高于硅藻硝酸消化法40%和30%（P<0.05）。结论在溺死的法医学鉴定中，应根据具体情况来挑选合适的实验室检验方法。与硅藻硝酸消化法相比，浮游生物16S rDNA PCR法具有检材用量少、信息量大、特异性高等特点，有一定的推广和实践价值。
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变性梯度胶电泳对结膜炎细菌多态性分析
目的 应用聚合酶链反应-变性梯度胶电泳(PCR-DGGE)研究泪液细菌多态性和致病病原体.方法 直接从泪液标本中抽取总DNA,扩增16S rDNA V3区,DGGE分离后测序与传统培养方法进行比较,并作出相应的评价.结果 检测131份标本,其中59份化脓性结膜炎标本54份呈阳性结果,39份非化脓性结膜炎标本15份为阳性,而34份正常泪液标本6例扩增出目的片段.检测细菌种类依次为:葡萄球菌、棒状杆菌、链球菌、不动杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、丙酸菌属及泛菌属.有3个序列在属的水平上不能被确定,其序列分别与肠细菌、不经培养的真细菌及不经培养的β蛋白细菌有高度的序列相似性.培养方法只对葡萄状球菌、棒状杆菌、链球菌、假单胞菌,以及克雷伯氏杆菌属呈阳性.结论 PCR-DGGE印迹技术和16S rDNA序列分析能快速识别细菌性结膜炎患者中的病原菌,而且是检测和鉴定那些不能用传统培养法检测的单种细菌或多种细菌眼部感染的较为适宜的方法.
