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基于16S rDNA高通量测序技术对肾移植术前后肠道菌群变化的研究
目的 探讨肾移植患者手术前、后肠道菌群的变化.方法 根据纳入排除标准选取在解放军第309医院全军器官移植研究所行肾移植手术的7例患者作为研究对象,收集术前3d内及术后第21天共计14份粪便标本,提取标本中原核生物全基因组后采用16S rDNA高通量测序方法分析菌群结构.结果 在门分类水平上,肾移植术后较术前,变形菌门相对丰度显著升高(P＜0.01),厚壁菌门相对丰度下降(P＞0.05);在纲、目、科、属分类水平上,相对丰度增加的菌属包括隶属于厚壁菌门的芽孢杆菌纲(P＜0.05)及其所属的乳杆菌目(P＜0.05)和肉杆菌科、颗粒链菌属;减少的菌属包括隶属于厚壁菌门梭菌纲梭菌目的毛螺旋菌科、胃瘤球菌科、真细菌属、粪球菌属以及隶属于放线菌门的红蝽菌目.术后组Shannon指数较术前呈降低趋势(P＞0.05,Wilcoxon符号秩检验).主坐标分析(PCoA)显示术前组的各标本间距离小于术后组各标本间距离,且术后组各标本在坐标中呈散在分布.结论 肾移植术后肠道菌群的改变主要包括:多样性较术前呈减少趋势;变形菌门相对丰度升高,厚壁菌门相对丰度降低.由于肠道菌群结构具有高度的个体差异,不太可能以某种特定细菌类别作为统一适用于移植术后并发症的诊断标志物.但是,纵向来看,每个移植患者肠道菌群变化所遵循的规律有可能预示移植术后患者的健康或疾病状态,并指导移植术后的治疗策略.
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磺胺药物使用对肾移植术后肠道菌群结构的影响
目的 观察肾移植术后磺胺药物使用对移植患者肠道菌群结构的影响.方法 根据纳入排除标准选取在解放军第309医院全军器官移植研究所行肾移植手术的10例患者作为研究对象,收集每例患者术前3d内及术后第30天的粪便样本各1份,共计20份粪便标本,提取标本中原核生物全基因组后采用16S rDNA高通量测序方法分析菌群结构.结果 使用磺胺药物后的OTU数量仅为术前OTU数量的50％,差异有统计学意义(P =0.003);门水平:术前检测到10个菌门的细菌,而术后使用磺胺药物后仅检测到8个菌门的细菌,各类菌门丰度同样也在前后发生了显著的变化,厚壁菌门和拟杆菌门的平均相对丰度分别由术前73.20％和10.64％下降到了使用磺胺使用后的50.17％和3.13％,而变形菌门平均相对丰度由术前13.79％上升至了磺胺使用后的42.87％;属水平:术前肠道内丰度高的20类细菌多为文献已报道或研究已表明的人体正常的共生菌,而使用磺胺类药物后肠道内丰度高的20类细菌新出现的菌种却大多为致病菌.结论 磺胺类药物在移植术后的使用会明显破坏肠道菌群结构,一些共生菌和益生菌的种类明显减少,致病菌反而增加,甚至对肠道免疫和肠黏膜屏障功能也可能存在影响,这些都不同程度的增加了二次感染的风险.
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种植体周围黏膜炎龈下微生物群落多样性研究
目的:检测种植体周围黏膜炎龈下微生物群落的多样性,研究种植体周围黏膜炎龈下微生物种类、数量以及群落分布,找出特异性微生物,为临床上选择适当的维护与干预方法提供依据.方法:采集10例患黏膜炎的种植体龈沟液样本(A组)及14例健康种植体的龈沟液样本(B组),提取样本龈沟液中的微生物总DNA作为模板,采用细菌的16S rDNA V3区通用引物进行扩增,扩增产物进行DGGE电泳分析及克隆测序分析.结果:A组较B组龈沟液量多,差异有显著统计学意义(P＜0.01).AB两组样本整体相似性为18％,A组各样本群落相似性为29.9％～60.2％,B组各样本相似性30.8％～74％.A组测得5种菌门,包括15种菌属,B组测得4种菌门,12种菌属.A组G-厌氧杆菌比例为69.65％,B组为64.51％.结论:发生种植体周围黏膜炎时龈沟液量较健康种植体增加,龈沟液量可一定程度上反映种植体周围软组织的健康状况.种植体周围组织在健康状态和发生黏膜炎时的龈沟液中微生物群落均具有高度多样性,但菌群结构差异较大.健康种植体及种植体周围黏膜炎龈下微生物群落均以G-厌氧杆菌为主,后者G-厌氧杆菌比例更高.
关键词： 种植体 聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳 16S rDNA 微生物多样性 -
双歧杆菌在儿童口腔中的分离及其分子生物学鉴定
目的:通过分离鉴定不同患龋情况儿童口腔中双歧杆菌的存在情况,奠定研究口腔双歧杆菌与儿童龋病发生关系的基础.方法:选取18例3～6岁高龋患儿为实验组,15例3～6岁无龋健康儿童为对照组,采集两组儿童龈上混合菌斑和口内非刺激性唾液,采用双歧杆菌特异性选择培养基对其进行专性厌氧分离培养;采用双歧杆菌特异性引物对培养后形成的单菌落进行分子生物学鉴定.结果:双歧杆菌特异性选择培养基上形成典型菌落,部分菌落通过革兰氏染色后光镜观察可见典型的Y或V状分叉,也有棍棒状和匙状;实验组双歧杆菌检出率为83.3％,对照组检出率为0,两组双歧杆菌检出率的差异有统计学意义(P＜0.05);实验组检出双歧杆菌的样本中通过随机挑取单菌落行PCR扩增后测序,其结果为:实验组菌斑60个菌落中齿双歧杆菌占83.3％、殊形双歧杆菌占10％、栖牙双歧杆菌占6.7％;唾液样本60个菌落中齿双歧杆菌占90.0％、殊形双歧杆菌占6.7％、柄牙双歧杆菌占3.3％.结论:高龋儿童双歧杆菌的检出率均高于无龋儿童;口腔双歧杆菌中含有的菌种主要为齿双歧杆菌、殊形双歧杆菌、栖牙双歧杆菌;齿双歧杆菌在口腔双歧杆菌中所占比例大,是高龋儿童口腔中的活跃菌种.
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16S rDNA和ITS2基因序列分析用于难鉴定病原菌分子诊断
目的 利用16S rDNA和转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)基因序列分析方法对难鉴定病原菌进行分子诊断.方法 对某三甲医院4年来的220株难鉴定细菌和130株难鉴定真菌,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)分别扩增16S rDNA和ITS2基因并测序PCR扩增布鲁氏菌特异基因,并测序进行区分布鲁氏菌和人苍白杆菌,直接从血液标本中提取细菌DNA进行16S rDNA扩增,并与BDPhoenix100微生物分析仪结果进行对比.结果 220株中8株尚未在国内临床感染标本中报道,2株尚未在国外临床报道;130株真菌中2株尚未在国内临床感染中报道.布鲁氏菌特异基因BCSP31可区分布鲁氏菌和人苍白杆菌.100例血培养标本中发现10例16S rDNA和仪器法鉴定结果不一致,以16S rDNA鉴定结果为准.结论 核糖体基因序列分析可以作为临床难鉴定细菌和真菌的分子生物学诊断方法,某些细菌的特异基因检测可作为辅助鉴定方法.
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活性污泥中硝化细菌16S rDNA鉴定方法研究
目的以活性污泥为材料,研究其中硝化细菌的分离及16S rDNA 鉴定方法.方法采用氨氧化细菌与亚硝酸氧化细菌富集、分离技术从武汉某啤酒厂曝气池活性污泥中分离得到2株纯培养菌株N1和N2.分别提取2株细菌的总DNA,利用氨氧化细菌与亚硝酸氧化细菌的16S rDNA特异性引物进行多聚酶链反应(PCR)扩增;扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳和Sanger末端终止法测序分析,用NCBI-Blast软件将测序结果在Genbank等数据库中进行同源性检索.结果 N1和N2的DNA扩增产物片断大小分别为526 bp和391 bp,测序结果经检索证实N1、N2分别与标准菌株Nitrosomonas sp. DYS317和Nitrobacter sp. R6的保守性片段有99%、100%的同源性.结论可以判定所分离得到的N1和N2菌株分别为亚硝化单胞菌属和硝化杆菌属.
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细菌性脑膜炎患者脑脊液细菌基因组DNA的提取及16SrDNA的鉴定
目的 探讨16S rDNA聚合酶链式反应(PCR)在细菌性脑脊液病原菌检查中的应用价值.方法 收集临床疑诊为细菌性脑膜炎的患者脑脊液标本,高速离心富集细菌后,进行脑脊液中细菌基因组DNA的提取,再进行16S rDNA PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳.将检测结果与传统的细菌培养结果进行比较.结果 58例患者脑脊液样本中,23例16S rDNA PCR阳性,阳性率为39.7%;58例脑脊液样本中细菌培养阳性为10例,阳性率为17.2%.PCR检测阳性率明显高于传统的细菌分离培养法(P<0.05).结论 脑脊液细菌基因组DNA提取及16S rDNA PCR鉴定技术操作简单,耗时短,灵敏度高,在细菌性脑膜炎病原学诊断方面具有良好的应用前景.
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人工髋关节置换术后感染耐药菌鉴定分析
目的 总结分析髋关节置换术后感染细菌耐药性特点,为该并发症的诊断和治疗提供一些依据.方法 选取我院收治髋关节置换后感染病例,抽取关节交液分别进行富集和抗药性筛选.然后挑选多重耐药性的菌株进行16S rDNA鉴定.结果 37份样本共富集到1638个菌株;氨苄青霉素抗性743个菌株;氨苄青霉素和制霉茼素抗性78个菌株;氨苄青霉素、制霉菌素和链霉素抗性9个菌株;多重耐药性菌株分属于鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌.结论 人工髋关节关节感染的细菌多重耐药性是引起感染难以治愈的一个因素,应引起临床医生的注意.
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16SrDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用
目的 建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值.方法 收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99％及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属.当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析.结果 经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100％)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0％.17株不常见菌株中,10株(58.8％)细菌只与1种菌相似性大于98.0％,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3％)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0％;1株菌与已知菌相似性在96.0％～98.0％之间只能鉴定到属(棒状杆菌).进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平.结论 结合16SrDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定.
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胆固醇结石患者胆囊细菌的T-RFLP研究
目的应用T-RFLP分析胆固醇结石中微生物群落结构。方法应用末端标记限制性片段长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）和克隆文库分析，以微生物群落16S rRNA基因（16S rDNA）为目标，对8例常规细菌培养阴性的纯胆固醇患者胆囊结石和胆汁中的微生物群落结构进行解析和比较。结果发现8例纯胆固醇结石患者胆汁中未找到细菌存在的证据，结石中细菌16S rDNA阳性率为37.5%（3/8），细菌16S rDNA片段测序表明细菌群落与肠杆菌科和微球菌科的微生物有较高的相似性，同时细菌群落中检出了大量的未培养微生物（Uncultured bacterium clone）。结论运用T-RFLP方法分析16S rDNA克隆片段能够有效评估纯胆固醇结石中的细菌群落结构的多样性。
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南海海洋沉积物中抗肿瘤活性菌株的初步筛选与鉴定
目的 从南海海洋沉积物中分离筛选出具有抗肿瘤活性的菌株,并对其进行鉴定.方法 利用MTT法对筛选菌株粗提取物进行抗肿瘤活性筛选,并对具有明显细胞毒性的菌株进行16S rDNA系统发育学分析.结果 在分离得到的11株海洋细菌中,菌株S24具有明显的细胞毒性.16S rDNA系统发育学分析表明,菌株S24与Pectobacterium cypripedii果胶杆菌属的16S rDNA序列相似性为99%.结论海洋沉积物来源的细菌是抗肿瘤活性物质的重要来源,是开发抗肿瘤药物的宝贵资源.
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Caco-2细胞与肠道菌共培养初建体外肠道共生模型
[目的]构建体外模拟肠道共生系统,用于评价食源性抗菌药及其耐药菌作用于肠道菌群时对人体健康造成的危害风险.[方法]21 d体外培养构建Caco-2细胞三维肠上皮,分成无菌对照组、混合的正常菌群组、沙门菌组、混合菌群-沙门菌组4组,制备混悬液,各组分别单独和混合培养4h,荧光定量PCR法测试共培养前后各菌16SrDNA菌量变化,电阻仪测试跨膜上皮电阻(TEER)数量；免疫荧光染色观察紧密连接蛋白ZO-1变化,评价三维肠上皮屏障功能的改变.[结果]在体外共培养模型内,4种肠道菌混合培养4h后同单独培养组间比较,细菌量增长无统计学差异(P＞0.05))；需氧菌的增长速度明显高于厌氧菌(P＜0.01),厌氧菌:需氧菌浓度比接近100∶1,厌氧菌仍为优势菌.TEER和ZO-1免疫荧光染色结果均提示混合肠道菌群对Caco-2细胞三维肠上皮无明显破坏,侵入性沙门氏菌可显著降低TEER值,并观察到模型的ZO-1结构受到破坏.这种破坏作用在混合肠道菌群加沙门菌群组较轻.[结论]Caco-2细胞三维肠上皮同乳双歧杆菌、植物乳酸杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌组成的混合菌群体外共培养能建立稳定的体外肠上皮模型,并具有生物学活性；正常肠道菌群对侵入性沙门菌有拮抗作用.该模型可进一步完善作为食源性抗菌药、耐药菌与肠道系统相互作用研究模型的基础.
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华南地区肉芽肿性小叶性乳腺炎患者的细菌鉴定与分析
目的：以细菌16S rDNA 序列为分子标记，对12例来自华南地区肉芽肿性小叶性乳腺炎（ GLM）患者的脓液标本进行细菌培养和分子鉴定，从而探讨该地区肉GLM与潜在致病细菌之间的关系。方法将收集到的12例脓液标本接种于血琼脂平板，对在平板上生长的细菌进行革兰染色并进行初步的鉴定。进一步通过DNA提取试剂盒提取细菌总DNA并利用通用引物对其16S rDNA序列进行PCR 扩增，然后测定其核酸序列，在Gen－Bank中通过BLAST比对查找其同源序列并进行分子鉴定，后利用MEGA 6．0软件构建所鉴定细菌的分子系统发育树。结果12例脓液标本经血琼脂平板培养后2例呈阳性，细菌检出率为16．7％，革兰染色结果表明细菌为革兰阳性杆菌。序列分析结果显示两个标本的16S rDNA序列与GenBank中已有的棒状杆菌属16S rDNA序列达到99％的相似度，并且在系统发育树中与Corynebacterium kroppenstedtii DNF00591（ KJ082041）和Corynebacterium kroppenstedtii CIBU 090024（JF299190）聚类成为一枝。结论基于收集到华南地区12例GLM标本，通过16S rD－NA基因测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，能够对GLM的细菌进行鉴定与分析。数据分析结果表明由kroppenstedtii棒状杆菌为致病菌导致华南地区GLM的概率约为16．7％。
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探讨全自动快速微生物检测系统在鉴定流感嗜血杆菌的应用
目的：探讨全自动快速微生物检测系统（VITEK MS）在鉴定流感嗜血杆菌的应用价值。方法收集广州市黄埔区红十字会医院与广东省中医院2014年3月至2015年1月从痰液或咽拭子标本中分离的流感嗜血杆菌35株，用16S rDNA测序确证。并且用VITEK MS质谱仪，API NH常规生化鉴定与MH琼脂平板上V＋X因子需求性试验3种方法对上述菌株鉴定分析。结果在35株流感嗜血杆菌细菌中，VITEK MS质谱仪与API NH常规生化鉴定差异无统计学意义（P＞0．05），而VITEK MS与M H琼脂平板上V＋X因子需求性试验差异有统计学意义（P＜0．05）。结论对于API NH常规生化鉴定与M H琼脂平板上V＋X因子需求性试验，VITEK MS能快速、准确地鉴定流感嗜血杆菌，对临床诊治提供很大的帮助，有非常好的应用前景。
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广西地区类鼻疽伯克霍尔德氏菌的分布调查
目的 调查类鼻疽伯克霍尔德氏菌在广西地区的详细分布情况.方法 于2007年底对广西地区的14个地级市进行了大规模调查,共采集了77个地点的154个土壤样品和130个水样.采样通过细菌分离培养方法、16S rDNA基因测序和鞭毛基因检测的方法进行鉴定分析,对类鼻疽伯克霍尔德氏菌检出情况的地理分布进行绘图记录.结果 154份土壤样品中分离纯化出13株类鼻疽伯克霍尔德氏菌,阳性率为8.4％,没有在水样中发现该菌；分离纯化结果与16S rDNA基因测序和鞭毛基因检测的结果完全一致.分离纯化类鼻疽伯克霍尔德氏菌阳性的采样点分布在中东、南宁、钦州、放城、北海5个地区.结论 广西地区的类鼻疽伯克霍尔德氏菌主要分布在北回归线以南,南海附近地区.
关键词： 类鼻疽 类鼻疽伯克霍尔德氏菌 16S rDNA 土壤样品 -
细菌16S rDNA基因T碱基特异的PCR产物片段化
目的探讨细菌16S rDNA检测芯片杂交前的样本处理优化方法.方法设计针对细菌16S rDNA基因全长的通用引物,通过PCR时掺入一定比例的dUTP替代dTTP,扩增长度为1.5 kb的片段,用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)消化处理掺入到双链上的dUTP后,再经浓氨水特异性断开DNA双链上原dUTP处的磷酸二酯键,然后用聚丙烯酰胺凝受胶电泳(PAGE)和琼脂糖电泳确认片段化的效果.结果本实验选用的基因当dUTP与dTTP的比例在3∶7～1∶1时,都能够获得比较理想的片段化结果.结论通过控制一定的dUTP掺入比例再经UDG及氨水处理能够得到稳定的片段化结果.
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长春市周边牧场环境中非结核分枝杆菌的分离与鉴定
目的 进一步了解长春市地区牧场周围污染的土壤、水中非结核分枝杆菌(NTM)分布情况.方法 对6株分离自吉林地区牧场周围污染的水及土壤中的疑似NTM菌株进行基因组提取,并通过PCR方法成功扩增待检NTM菌株16SrDNA基因序列,通过GenBank对6株待检菌16S rDNA基因序列进行blat分析比较鉴定.结果 长春市周边牧场环境中的水和土壤各采集300份样品,经过抗酸染色初步鉴,6株菌株为阳性,经过Blast分析发现所测6株待测菌中,新金分枝杆菌3株,耻垢分枝杆菌1株,胞内分枝杆菌1株,浅黄分枝杆菌1株.结论 长春市周边牧场环境中非结核分枝杆菌的分离率为2.0％.应对牧场周边进一步加强管理和监督,预防非结核分枝杆菌.
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重症肺炎患者血液中类鼻疽伯克霍尔德菌的鉴定及其多位点序列分型
目的 分离鉴定一位重症肺炎患者血液中的未知细菌并进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST).方法 采用VITEK-2 compact微生物系统进行鉴定和药物敏感试验,PCR法扩增细茵的16S rDNA基因,通过测序并与GenBank中相关序列进行比对.采用MLST进行分型,BURST软件分析细菌的遗传变异.结果 经VITEK-2 compact微生物系统初步鉴定为类鼻疽伯克霍尔德菌.16S rDNA PCR扩增,产物经测序与GenBank中序列比对,发现与类鼻疽伯克霍尔德菌CP012577.1序列有99％同源性,证实该菌为类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei).MLST发现一个新的序列型(sequence type,ST)-ST1348,与来自巴布亚新几内亚分离株仅有一个基因的差异,且均可溯源至澳大利亚株.结论 来源于急性感染患者血液中的未知细菌是类鼻疽伯克霍尔德菌,MLST分型发现一个新的ST序列-ST1348,该分离株与巴布亚新几内亚菌株ST246密切相关.
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环介导等温扩增技术可视化检测结核分枝杆菌
为了提升对结核分枝杆菌(MTB)检测的实用性,本文开展了采用环介导等温扩增方法(LAMP)对MTB进行可视化检测的研究.首先,根据MTB 16S rDNA序列设计LAMP引物.然后,收集临床痰液样本并进行相应处理.为了评价LAMP的特异度和灵敏度,本文用电泳产物进行检测并用钙黄绿素进行可视化验证.后,以细菌培养结果为金标准,用SPSS 17.0软件比较培养结果与LAMP的一致性.结果显示,特异度实验中无非特异扩增现象,灵敏度实验中的检测极限为10拷贝.另外,可视化产物检测方法和电泳后的灵敏性相一致.进一步进行临床实用性评价,灵敏性为94.47％,特异性为90％,与细菌培养无统计学差异,结果一致性较好(P＞0.05).综上,LAMP技术高效而可视,具有在设备匮乏的现场和基层医疗机构的应用前景.
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16S rDNA实时荧光定量PCR法与全自动培养法在血小板细菌污染检测中的应用比较
目的 比较16S rDNA实时荧光定量PCR法与全自动培养法在血小板制品细菌污染检测中的灵敏度和特异性,评价2种方法的应用前景.方法 将血小板制品污染中常见的6种细菌用浓缩血小板悬液进行稀释,并选取浓度为102、101、100的菌悬液,分别用实时荧光定量PCR法和全自动培养法进行检测:结果用16S rDNA实时荧光定量PCR法对6株细菌检测,其灵敏度和特异性均为100%,K=1.000.用全自动培养仪对6株细菌检测,其特异性均为100%;灵敏度分别为:金黄色葡萄球菌需氧瓶95.5%,K=0.886,厌氧瓶90.9%,K=0.787;表皮葡萄球菌及大肠杆菌2种培养瓶均为83.3%,K=0.667;蜡样芽孢杆菌2种培养瓶均为86.7%,K=0.684;铜绿假单胞杆菌需氧瓶度为100%,K=1.000,厌氧瓶为44.4%,K=0.286;痤疮丙酸杆菌需氧瓶为16.7%,K=0.105,厌氧瓶为91.7%,K=0.886.结论 实时荧光定量PCR法检测血小板制品中的细菌污染,灵敏度高,特异性好,且省时、经济,能应用于临床上血液样本的大规模筛查.
