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家蚕肠道产蛋白酶细菌的分离筛选与分子鉴定
目的 肠道细菌对家蚕具有重要的生理作用,探明家蚕肠道产蛋白酶细菌菌群对家蚕肠道细菌的高效开发与利用具有十分重要的意义.方法 从菁松×皓月品种4龄家蚕肠液中分离与纯化肠道细菌,获得一株产高活力蛋白酶细菌,对该菌菌落进行形态学鉴定及菌体的显微镜检并结合16S rDNA方法 进行了鉴定.结果 该菌为革兰阴性杆菌,属于嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia).结论 该产蛋白酶细菌产酶能力较高,可进一步开发研究并用作微生态制剂.
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豆豉中发酵菌株的分离与鉴定
目的 从豆豉菌曲中分离并鉴定其发酵菌株.方法 将豆豉菌曲采用平板稀释的方法进行菌种分离后,采用革兰染色和16S rDNA序列分析进行菌株的鉴定.以黑豆为原料,分别接种分离的菌株进行豆豉的纯种发酵,观察并测定豆豉在发酵过程中的外观、温度、气味的变化.结果 筛选并鉴定获得10株分属魏斯菌、乳杆菌、芽胞杆菌和葡萄球菌等的菌株,且用枯草芽胞杆菌、发酵乳杆菌纯种发酵的豆豉在外观及气味等方面与自然发酵相近.结论 分离得到的枯草芽胞杆菌、发酵乳杆菌可取代自然发酵菌种,作为工业纯种发酵的参考菌株应用.
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芽胞杆菌型益生菌YK-1R的分子分类及系统发育地位的研究
目的:对具有良好益生作用的芽胞杆菌YK-1R菌株的分类地位及其与Bacillus属细菌的系统进化关系进行研究,为对益生素产品进行质量控制和设计专一性探索对此菌进行种群动态监测提供依据.方法:16S rDNA近全序列PCR扩增、克隆和测序,再对其序列在Ribosomal Database ProjectⅡ中进行比较鉴定,然后用此序列与GenBank中Bacillus属其他53种菌的16S rDNA进行系统进化关系比较,后用特异性引物扩增Bacillus subtilis相关菌的600 bp的特征序列.结果:YK-1R的序列在RDP中与Bacillus subtilis的同源性在98%以上.系统进化关系分析得到有5个分支的无根进化树,YK-1R属于Bacillus subtilis为代表的一支.此菌株也带有Bacillus subtilis相关菌的600 bp的特征序列.结论:YK-1R应为Bacillus subtilis种内的一个菌株,与普通细菌学的结果能相互印证.
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一株多功能芽孢杆菌的鉴定
目的 从土壤筛选所得l株芽孢杆菌并对该菌进行鉴定.方法 通过表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析(GenBank登录号为:JN609382).结果 形态学观察:菌落呈圆形,白色微黄,中央凸起,半透明,长时间培养容易形成褶皱；革兰染色为阳性；芽孢中生,周生鞭毛,细长且多.生理生化特征:参照《常见细菌手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》,其中接触酶反应、V-P测定、卵磷脂以及革兰染色呈阳性；能够利用D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇产酸,并能使淀粉水解；不能利用丙酸盐,不能形成吲哚,不能水解酪氨酸,生理生化试验结果显示该芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的特征一致.分子生物学鉴定:在GenBank上经过BLAT分析,其与枯草芽孢杆菌的相似性高(99％).结论 鉴定该菌为枯草芽孢杆菌.
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低渗条件下竹叶状灰岩中微生物的初步培养
目的 对低渗条件下竹叶状灰岩内部特有的微生物进行培养,了解竹叶状灰岩内部独特的微生态环境.方法 本研究采用低渗稀释培养法、透射电镜、16S rDNA序列分析方法以及培养基改造,对竹叶状灰岩中的微生物进行了初步研究.结果 在竹叶状灰岩的培养物中发现了两段未培养细菌16S rDNA的存在;在电镜中观察到两种特殊形态的微生物;采用稀释培养法成功的培养了未培养细菌,且能传代,但经过多种培养基的分离培养,未获得未培养细菌的纯培养.结论 竹叶状灰岩内部有特殊形态的未培养细菌存在,本文为进一步研究未培养细菌特有的生存机制和代谢途径奠定了基础.
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细菌性阴道病患者阴道分泌物16S rDNA序列分析
目的 分析健康妇女及细菌性阴道病( Bacterial vaginosis,BY)患者阴道分泌物16S rDNA序列.方法 提取20例健康妇女及40例BV患者阴道分泌物标本中的总DNA,针对细菌16S rDNA保守区设计通用引物进行PCR扩增、克隆、测序,将获得的16S rDNA序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中的发表序列进行比对,分析克隆群中细菌种类和比例.结果 通过阴道分泌物16S rDNA序列分析,发现健康妇女阴道分泌物中以卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus),惰性乳酸杆菌(LactobaciUus iners),加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)为优势菌种,而BV患者阴道菌群种类繁多,以加德纳菌属(Gardnerella)和奇异菌属(Atopobium vaginae)克隆子占较大比例,仅4例患者可见卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus),其他患者均未见有乳酸杆菌克隆子且奇异菌属阴道病患者甲硝唑治疗疗效较差.结论 健康妇女和BV患者阴道分泌物菌群种类有较大区别,BV患者在治疗前进行16S rDNA序列分析检测有较大的临床意义.
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儿童下气道菌群多样性及其对支气管哮喘辅助性T细胞分化机制影响研究进展
哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的一种异质性疾病[1].近年来哮喘发病率逐年攀升,据全球哮喘防治创议(GINA)委员会调查显示,全球约有3亿人受到哮喘困扰[2],世界卫生组织(WHO)预计至2025年全世界哮喘患者将会增至4亿人.研究发现,哮喘患者气道菌群在丰度及多样性等方面与正常人存在显著差异[3],而且各类辅助性T(Th)细胞的比例也存在明显不同.随着16Sr DNA序列分析技术的应用,气道菌群多样性及其对Th细胞分化的影响成为研究哮喘发病机制的重点.
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变形链球菌耐氟菌株的筛选及分子鉴定
目的:探讨变形链球菌(S.mutans)获得耐氟性的培养条件及其鉴定方法,为鉴定变形链球菌耐氟菌株提供理论依据.方法:在微需氧条件(95％N2,5％CO2)下,以梯度氟化钠(NaF)浓度对变形链球菌UA159进行培养,获得耐氟菌株.从表现型和基因型上鉴定所培养菌株.观察菌株的表型特征;采用生理生化鉴定和PCR法对该菌株16S rDNA进行克隆鉴定.结果:微需氧(95％N2,5％CO2)条件下培养出耐氟变形链球菌株.形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定,该菌株具有耐氟稳定性,与变形链球菌UA159的16S rDNA序列同源性是100％,确定该菌株为变形链球菌耐氟菌株.结论:变形链球菌耐氟菌株培养条件是微需氧(95％N2,5％CO2)和脑心浸液(BHI)培养基中培养48 h.经NaF诱导的变形链球菌UA159鉴定为变形链球菌UA159的突变株变形链球菌UA159-FR.
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一株绵羊肺炎支原体的分离及鉴定
目的 从疑似患有传染性胸膜肺炎的绵羊肺脏中分离支原菌株,并进行鉴定.方法 采用组织浸泡法分离支原体,经革兰染色及瑞氏染色后于显微镜下观察,分离株命名为TLMY 1;经通用引物对分离株16S rDNA基因进行PCR扩增及序列分析,并建立亲缘关系进化树.结果 镜下观察可见分离株TLMY 1的菌落形态呈“煎蛋样”,革兰染色为阴性,瑞氏染色为紫红色形态不规则菌体;分离株TLMY 1与Mycoplasma arginini strain C1、787 、D17等亲缘性近.结论 分离株TLMY 1为精氨酸支原体.
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国内甲型副伤寒沙门菌疫苗株的16S rRNA基因序列分析
目的 对我国4株用于或拟用于疫苗生产的甲型副伤寒沙门菌的16S rRNA基因进行序列分析,考察其保守性和差异.方法 提取4株菌基因组DNA,以16S rDNA通用引物进行PCR扩增,并对产物进行克隆及测序.结果 4株菌均可扩增出约1 500 bp的目的 基因片段,测序结果表明,4株菌中16S rDNA核苷酸序列一致性达99.77%.结论 选择保守性高的16S rDNA区段进行序列测定.以防止种子批的变异,便于对疫苗生产用种子进行质量控制.
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一株产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌的分离和鉴定
从天津塘活盐碱土壤中分离一株产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌HAP,并对其进行了表型分类和16S rDNA序列分析.结果表明,HAP是一株革兰氏阳性芽孢杆菌,菌体大小(0.7-0.9)μm×(2-3)μm,该菌可利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇,发酵型糖代谢产酸;可以水解酪素、淀粉,但不能水解酪氨酸;能够利用柠檬酸盐;其酶活力为1.22×104U/mL.结合系统发育学分析将HAP鉴定为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus).
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一株中度嗜热嗜酸细菌的分离与分子鉴定
用稀释分离法,从云南某温泉分离得到一株中度嗜热嗜酸细菌YN06.该菌株短杆状,革兰氏阴性,菌体大小为(0.3-0.5)μ mx(1-2.2)μm.16S rDNA和16S-23S间隔区序列分析表明,YN06与嗜酸硫杆菌属的喜温硫杆菌处于同一进化树分支中,相似性均高达99%以上,因此该菌株被鉴定为喜温硫杆菌.
关键词： 中度嗜热嗜酸细菌 16S rDNA 16S-23S间隔区 序列分析 -
G群链球菌的分子鉴定及耐药特征分析
目的 探讨16S rDNA测序法鉴定β-溶血性G群链球菌的价值,通过体外药物敏感性试验确定G群链球菌对青霉素、红霉素和克林霉素等抗菌药物的耐药性,并确定红霉素耐药菌株的耐药表型及基因型.方法 采用API 20 Strep链球菌鉴定系统、兰氏抗原血清分型和16S rDNA测序法对复旦大学附属华山医院临床分离的50株β-溶血性G群链球菌进行鉴定.采用琼脂稀释法对该50株G群链球菌进行体外药物敏感性试验,并通过纸片法D试验测定红霉素耐药菌株的耐药表型.通过聚合酶链反应(PCR)检测其大环内酯类耐药基因ermB和mefA.结果 50株链球菌经手工API 20 Strep链球菌鉴定系统鉴定,均为停乳链球菌.16S rDNA PCR扩增及测序,42株为停乳链球菌,8株为咽峡炎链球菌,鉴定概率＞97％.以测序结果为标准,API 20 Strep链球菌鉴定系统鉴定的准确率为84％.兰氏抗原血清分型均为G群.药物敏感性试验结果显示,50株G群链球菌中没有对左氧氟沙星、头孢曲松、万古霉素和青霉素耐药的菌株.红霉素耐药菌株共28株(56％),其中cMLs型耐药菌株26株(52％),Ms型耐药菌株2株(4％),没有发现iMLs型耐药菌株,红霉素中介菌株4株(8％).克林霉素耐药菌株共31株(62％),其中红霉素敏感而克林霉素耐药菌株3株(6％),红霉素中介而克林霉素耐药菌株2株(4％).cMLs型耐药菌株中均检测到ermB基因,2株Ms型耐药由mefA基因介导,4株红霉素中介菌株中检出ermB和mefA基因各1株.结论 16S rDNA测序法能准确鉴定G群链球菌.G群链球菌对红霉素和克林霉素的耐药率有所提高,但对青霉素敏感,β-内酰胺类药物可以作为治疗G群链球菌感染的首选药物.
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棘阿米巴土壤分离株CB/S1内共生细菌的16SrDNA序列分析
用地衣红-卡红染色进行共生菌的形态观察,鉴定棘阿米巴CB/S1内共生细菌.克隆内共生细菌的16S rDNA基因,进行基因序列分析.结果 表明,经地衣红-卡红染色棘阿米巴CB/S1内共生细菌呈黑色和棒状,在胞质内不规则分布.棘阿米巴CB/S1内共生细菌的16S rDNA基因长1 534 bp,与类亚洲嗜阿米巴杆菌(Candidatus Amoebophilus asiaticus 5a2)和韩国棘阿米巴分离株 KA/E21内共生细菌的16S rDNA基因的同源性均为98%.进化树分析表明,棘阿米巴CB/S1内共生细菌与韩国棘阿米巴KA/E21内共生细菌、类亚洲嗜阿米巴杆菌、黑脚硬蜱内共生细菌和伯恩蚜小蜂内共生细菌等细菌构成单系.
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117例梗阻性黄疸患者胆汁细菌群落限制性片段多态性分析
目的 分析梗阻性黄疸患者胆汁中的细菌群落结构.方法 选取2010年10月至2013年10月梗阻性黄疸患者117例,其胆汁细菌常规培养和厌氧菌培养结果均为阴性.每例抽取胆汁10 mL,提取胆汁细菌群落DNA,扩增胆汁细菌16S rDNA,进行终端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析,构建克隆文库并行测序和系统分析.研究数据行卡方检验.结果 117例患者中50例胆汁细菌16S rDNA为阳性,总阳性率为42.7％.结石和肿瘤引起的梗阻中胆汁细菌16S rDNA的阳性率分别为97.3％(36/37)和17.5％(14/80),差异有统计学意义(x2=65.828,P＜0.01).肝门部和肝门部以上及肝门部以下的梗阻中胆汁细菌16S rDNA的阳性率分别为43.3％(13/30)和42.5％(37/87),差异无统计学意义(P＞0.05).结石引起梗阻的细菌群落主要为肠杆菌科(埃希菌属、沙门菌属、克雷伯菌属、变形菌属)、链球菌科(链球菌属)、消化球菌科(消化菌属、消化链球菌属)、微球菌科(葡萄球菌属)、丙酸杆菌科(丙酸杆菌属)、奈瑟球菌科(不动杆菌属).肿瘤引起梗阻的细菌群落主要为肠杆菌科(克雷伯菌属、埃希菌属、伤寒沙门菌)和微球菌科(葡萄球菌属).结论 采用T-RFLP方法分析16S rDNA克隆片段能有效评估梗阻性黄疸患者胆汁中细菌群落的存在情况和多样性.
关键词： 末端限制性片段长度多态性 黄疸 梗阻性 16S rDNA 细菌群落 -
应用16S rDNA结合膜芯片检测3种产黑色素牙周可疑致病菌
目的:探讨采用16SrDNA结合膜芯片检测牙龈卟啉菌Pg、中间普氏菌Pi和变黑普氏菌Pn的价值.方法:利用Genebank中细菌16S rDNA保守区序列,设计一对通用引物,通过已知Pg、Pi和Pn的16S rDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针.先用通用引物PCR扩增所有标准菌株的DNA,PCR产物和已点样有Pg、Pi和Pn的3种探针的膜芯片杂交,进行分析.结果:膜芯片上的Pg、Pi和Pn3种探针只能与相对应的Pg、Pi和Pn的PCR产物反应,而与其他标准菌株的PCR产物无反应.结论:用16SrDNA结合膜芯片,可准确检测Pg、Pi和Pn,有很高的特异性,有望成为一种有效的临床检测方法.
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应用变性梯度凝胶电泳分析牙周基础治疗前后龈下菌群的变化
目的:应用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)方法观察比较牙周基础治疗前后龈下菌群微生态的总体变化,为临床诊疗方案的确定提供实验依据.方法:选取6例慢性牙周炎患者,观察牙周基础治疗前和治疗后6周时的临床指标变化,并采集治疗前后同一位点的龈下菌斑,提取总DNA,扩增不同的16S rDNA片段,DGGE分离,硝酸银染色,对图像进行聚类分析,并绘出聚类树形图.结果:所有患者经过治疗后,与基线相比,牙周状况均明显改善.基线和治疗后6周时,2个区间的DNA片段的条带数目无显著差异.通过聚类分析,证实同一患者基线时和基础治疗后6周时的龈下菌群具有较高的相似性,且不同的DNA片段所得到的条带图谱聚类树形图存在类似结果.结论:同一患者在基础治疗后形成的龈下菌群有类似于治疗前水平的趋势.DGGE能够观察龈下菌群的组成变化,适用于分析大量微生物标本的结构改变.
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小链霉菌HCCB10043产脂肽类抗生素的鉴定及其生物合成基因簇研究
使用高效液相色谱法分离纯化了小链霉菌HCCB10043的重要代谢产物,获得3个精制品；经高分辨质谱、二级质谱与氨基酸分析鉴定其分别为A21978C1、C2和C3.菌株16S rDNA与已知的A21978C产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379的同源性为99.2％,系统发育分析显示两者的亲缘关系很近；经基因钓取与沉默验证,结果显示该菌株的A21978C生物合成基因簇与玫瑰孢链霉菌报道完全相同.
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DGGE法评价牙周袋深度的变化对龈下微生物群落的影响
目的 应用变性梯度凝胶电泳( DGGE)方法分析经牙周基础治疗使牙周袋变浅后龈下微生物种类的变化.方法 选取2例慢性牙周炎患者(患者l和患者2),在牙周基础治疗前及治疗后6、12 、18周和1年时,采集同一位点的龈下菌斑,提取菌斑总DNA,PCR扩增16S rDNA的V3～V5区片段,DGGE分离获得条带图谱；计算条带数目和相似度,并对条带进行聚类分析.结果 患者1治疗后牙周袋探诊深度明显变浅,达到≤3 mm的正常水平；患者2治疗后牙周袋探诊深度变浅,但仍≥5 mm.治疗前后2例患者DGGE条带数目无明显变化,治疗后各时间点的DGGE条带与基线分别保持48.14％ ～ 57.8％和63.70～72.35％的相似度.牙周治疗各阶段菌群聚类特征分析显示:牙周基础治疗后6周时,菌群聚类特征与基线相比变化明显,随着时间的推移逐渐发生再变化.结论 慢性牙周炎患者在接受牙周基础治疗后,虽然牙周探诊深度变浅,但牙周微生物可能已在较短时间内发生再定植.
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不同16S rDNA通用引物对DGGE进行牙周微生物群落分析的影响
目的 初步评价不同的16S rDNA片段对变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行牙周微生物群落分析结果的影响.方法 选取3种牙周主要可疑致病菌的标准菌株,通过构建质粒DNA分别获得16S rDNA V3区、V3～V5区和V6～V8区片段,测序鉴定并进行BLAST验证;将测序正确的质粒DNA经DGGE分离和硝酸银染色后获得条带图谱.结果 由3对通用引物扩增得到的DGGE图谱并不相同.V3区引物获得的并非单一条带,且不同菌株间没有识别度;V3～V5区和V6～V8区的图谱显示:3种菌株的DNA片段均得到了单一条带,且区分性较好.结论 16S rDNA V3～V5区和V6～V8区的两对引物可用于龈下菌群多样性的研究.
