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16S rDNA基因芯片检测临床常见感染性细菌
目的提高细菌和临床微生物检测的速度和准确性,建立含有20种细菌探针在内的感染性细菌检测用基因芯片模型.方法使用16S rDNA克隆探针和合成的寡核苷酸探针两种,利用点样仪制成基因芯片.细菌DNA经过16S rDNA通用引物扩增后与芯片上的探针杂交,然后用荧光扫描仪检测信号.结果基因芯片能够用于细菌检测,克隆探针具有广泛和灵敏的特点,但是交叉反应明显;寡核苷酸探针具有较高的特异性,但是灵敏度稍差.结论cDNA探针和寡核苷酸探针结合或设计几个不同的探针来指向同一株细菌很可能是将来基因芯片的检测方向.
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慢性前列腺炎患者前列腺液16S rDNA检测的临床意义
目的:探讨慢性前列腺炎患者前列腺液16S rDNA检测的临床意义.方法:对116例慢性前列腺炎患者前列腺液采用PCR方法检测其16S rDNA,比较不同亚型前列腺炎的16S rDNA阳性率并分析其相关性.结果:29例Ⅱ型前列腺炎前列腺液16S rDNA PCR均阳性,阳性率100%;87例Ⅲ型前列腺炎前列腺液16S rDNA PCR阳性71例,阳性率82%,其中ⅢA型前列腺炎前列腺液PCR阳性率94%(45/48),ⅢB型前列腺炎前列腺液PCR阳性率67%(26/39).结论:16S rDNA的检测可能成为慢性前列腺炎分型的一个指标.
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淋球菌性菌血症的快速筛查及鉴定
目的探讨16S rDNA检测技术在快速筛查鉴定淋球菌性菌血症中的应用价值.方法选择1例反复规律性发热、畏寒1个月入院的41岁男性菌血症患者,入院前几天开始出现尿急、尿频和尿痛症状,大便正常,贫血消瘦外容,皮肤黏膜稍苍白,无出血点及皮疹,全身浅表淋巴结未及肿大,血尿常规异常,肝肾功能尚可.采用PCR检测菌血症患者外周血病原菌16S rDNA,对其扩增产物进行DNA测序,再将DNA序列结果与GenBank中的已知序列进行同源性比较;同时对外周血病原菌进行分离培养鉴定及药敏实验.结果16S rDNA扩增产物序列与GenBank中的已知序列进行同源性比较后确定为淋病奈瑟菌,同外周血分离培养鉴定结果一致.结论检测淋球菌性菌血症患者外周血16S rDNA具有高效率、高特异性、高灵敏度、快速准确等特点.
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生物转化法制备葫芦素B产酶菌株的筛选与鉴定
葫芦素B(CuB)是临床用于治疗肝炎和肝癌等疾病的药物,开发以葫芦素B葡萄糖苷(CuBg)为原料生产CuB的生物转化工艺,具有潜在的工业应用价值,获得一株特异性产酶菌株是转化工艺开发的首要工作.首先利用甜瓜蒂和污水富集培养产酶菌株,平板分离法获得纯培养;之后以含CuBg的甜瓜蒂提取物为底物,筛选出能将CuBg转化为CuB高产菌株,并对筛选获得的菌株进行分类鉴定;后对转化工艺进行优化,提高转化率.结果分离到一株编号为RW-2放线菌菌株,其滤除菌丝的发酵液处理甜瓜蒂提取物,其中的CuBg被转化为CuB,CuB的含量显著提高;经形态学鉴定和16S rDNA序列分析,确定该菌株是一株链霉菌(Streptomyces sp.);经过转化工艺优化后,该菌株发酵制备的粗酶液转化甜瓜蒂提取物,其中CuB的含量从1.50 g/L提高到3.27 g/L,提高了1.18倍,CuB的转化得率达99.5％.利用生物转化法将低活性的CuBg转化高活性的CuB,具有反应条件温和、工艺简单,转化得率高的优点,在药物CuB生产中有一定的应用价值.
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基于16S rDNA的肠道微生态分子流行病学实验室检测方法
由于肠道菌群的复杂性,使得检测与分辨菌群具有极大的挑战性.传统的肠道菌群分析方法因所需时间长、操作繁琐、敏感度低等局限,逐渐遭到淘汰.随着对核酸研究的深入及分子生物学技术的发展,目前多采用基于16S rDNA基因序列的分子流行病学实验室检测方法用以分离和鉴定肠道微生物.
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美洲大蠊肠道无色杆菌的分离鉴定及其抑菌活性的初步研究
目的 从美洲大蠊肠道中分离、鉴定4株内生无色杆菌,并初步测定其抑菌活性和鉴定其关键次级代谢生物合成基因.方法 采用平板划线法、16S rDNA PCR扩增、Blast比对和大似然值法构建系统发育树,对4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌进行分离、鉴定.采用牛津杯法初步测定4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌次级代谢产物的抗菌活性.采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳法鉴定4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌的关键次级代谢生物合成基因PKS Ⅰ、NRPS和卤化酶基因FADH2.结果 从美洲大蠊肠道中分离得到了4株内生无色杆菌,且4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌与已知无色杆菌Ach-romobacter xylosoxidans、Achromobacter aegrifaciens和Achromobacter marplatensis的相似度均在99.3％以上.抑菌实验结果表明,4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌等病原菌均具有一定的选择抑制作用.琼脂糖凝胶电泳结果显示,均能从4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌的关键次级代谢生物合成基因PKS Ⅰ、NRPS,且在菌株WA5-1-54的检测到卤化酶基因FADH2.结论 美洲大蠊肠道内生无色杆菌可能具有产抑菌活性物质的能力.
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小熊猫感染肺炎克雷伯氏菌的检查及药敏试验
目的 为确诊导致一只6岁左右的雌性小熊猫死亡的病因.方法 无菌采集死亡小熊猫的心、肝、脾、肺等样品并进行病原学检查.通过对多个内脏样本进行细菌平行分离鉴定(形态特征、生化特性和16S rDNA分析),对分离得到的一株优势菌(R1)进行小鼠人工感染及药敏试验.结果 R1被鉴定为肺炎克雷伯氏菌,且未检测到别的细菌;R1对小鼠具有较强致病力,LD50为6.5×104 CFU/mL,且死亡小鼠与该小熊猫具有一致临床表现和病理剖解症状;R1对头孢噻肟等药物敏感,对丁胺卡那等药物敏感性为中介,对青霉素等耐药.结论 该小熊猫死于肺炎克雷伯氏菌感染.该菌对青霉素类抗生素耐药较强,且耐药谱较广,对大环内酯类、多肽类抗生素均有耐受作用,对头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素敏感.
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幽门螺杆菌16S rDNA指纹图和PCR-RFLP基因分型研究
目的探讨我国幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的基因多态性及其与相关疾病之间的关系.方法应用PCR掺入法制备16S rRNA基因探针,建立16S rDNA指纹图技术和尿素酶C(ureC)基因的PCR-RFLP法,并结合统计学软件进行聚类分析,对临床分离的14株Hp进行基因分型.结果 14株Hp的16S rDNA指纹图谱显示10个HaeⅢ杂交带型和12个HindⅢ杂交带型;ureC基因的变异度较小,14株Hp中有12株PCR-RFLP图谱完全一致.通过杂交结果示意图和SPSS10.0软件进行聚类分析,HaeⅢ、HindⅢ及两种酶杂交结果的综合,均将14株Hp分为两型.两种方法结果综合进行聚类分析,14株Hp在基因水平上分为三型.结论差异显著的DNA指纹图谱说明了不同Hp菌株间基因组结构的高度变异性.16S rDNA指纹图谱较ureC基因的PCR-RFLP谱型更敏感地表达Hp各菌株的变异,可准确有效地对Hp作出基因分型.未发现Hp菌株间有特异的疾病图谱存在.
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布氏菌分离株16SrDNA基因遗传进化分析
目的 检测内蒙古布氏菌临床分离株的16SrDNA基因序列,构建16SrDNA遗传进化树,确定该菌株的分类地位.方法 用BCSP31-PCR对临床分离株检测,再进行16SrDNA双向测序;从GeneBank下载标准参考菌株和与布氏菌有共同抗原细菌的16SrDNA基因序列;用Mega6.0进行序列比对并构建遗传进化树.结果 BCSP31-PCR结果显示均有223 bp扩增条带,16SrDNA测序得到单一基因序列;比对后发现有4处特异片段,经Blast比对,位于844-1224包括380 bp的片段为布氏菌独有;进化树显示布氏菌临床分离株与标准菌株聚在1个末端分支上,遗传距离接近0,无法精细区分相互关系;与人苍白杆菌聚集在1个亚分支上,遗传距离0.019;与其它试验菌株如霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔菌遗传进化距离较远,遗传距离＞0.02.结论 从遗传进化角度对布氏菌分离株与标准菌株的亲缘关系进行分析,布氏菌所有种型遗传距离接近,提示布氏菌16SrDNA为高度保守序列,不宜做遗传进化分析的靶基因;布氏菌与人苍白杆菌有较近的亲缘关系;布氏菌属16SrDNA特有的380 bp的基因片段可作为布氏菌快速鉴定的靶序列.
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16S rDNA序列分析方法研究儿童口内细菌菌群变化
目的 分析龋齿儿童和无龋健康儿童口内微生物群落的异同,找出与儿童龋齿发病相关的菌群,及无龋齿儿童的优势菌群.方法 提取7例龋齿及7例无龋齿儿童唾液样本中的总DNA,利用16S rDNA序列分析技术分析克隆群中细菌种类和比例.结果 1)嗜血菌属、奈瑟菌属及链球菌属在两组检出率均高;2)龋齿组检出32个属类,78个种型;无龋齿组检出34个属类,82个种型;龋齿和无龋齿均检出29个属类和58个种型;3)嗜血菌属、梭形杆菌属的检出率在无龋组高于龋齿组,罗氏菌属、孪生球菌属、纤毛菌属及巨型球菌属在龋齿组的检出率高于无龋组,其差异均具有统计学意义(P＜0.05);4)莫拉菌属、沃氏葡萄球菌及棒状杆菌属只在龋齿组检出,坦纳菌属、互氧菌属、梭目菌菌属、桑肠杆菌及鞘氨醇单胞菌属只在无龋组检出.结论 奈瑟菌属、链球菌属及嗜血菌属为无龋儿童的优势菌属,龋齿组与无龋齿组相比,口内微生物多样性减少且差异大,与龋齿发生相关的菌群比例增高.
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咽部标本16s rDNA序列分析方法的建立及应用
目的 建立一种非培养的、以16s rDNA序列分析为基础的咽喉标本细菌筛查技术.方法 提取标本中的总DNA,针对细菌16s rDNA保守区设计通用引物进行PCR扩增、克隆、测序,将获得的16s rDNA序列与数据库中的发表序列进行比对,分析克隆群中细菌的种类和比例.结果 16s rDNA序列分析方法,能够对正常成人的咽部标本进行分析;在咽部标本中发现了不动杆菌、真杆菌、流感嗜血杆菌等;在这些细菌中,既有能够常规分离培养的细菌,也有常规难以分离培养的细菌.结论 成功建立了咽部标本的16s rDNA序列分析方法;通过分析正常成人咽部标本,得到正常人体咽部菌群的种类和比例,发现了多种不能常规分离培养的细菌.
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从西藏微小牛蜱检出类查菲埃立克体和边缘无形体16S rDNA
目的鉴定微小牛蜱(Boophilus microplus)所携带的埃立克体病原体.方法依据蜱传埃立克体16S rDNA序列设计引物,建立埃立克体属特异性套式PCR检测微小牛蜱DNA样本(每份DNA由2个蜱提取);克隆DNA样本中的埃立克体16S rDNA的5′末端片段并测定其序列.结果西藏某地的43份蜱DNA样本中有16份(37%)经套式PCR扩得阳性片段,而四川某地的27份蜱DNA样本扩增结果均为阴性.测定16S rDNA的5′末端片段(～450bp)的序列,发现两种序列,一种与边缘无形体16S rDNA完全一致,另一种与查菲埃立克体16S rDNA相关,但它们之间有7个碱基(～1.6%)的不同.结论西藏某地的微小牛蜱中携带有类查菲埃立克体和边缘无形体,该类查菲埃立克体可能是一个埃立克体新种.
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一株产抑制真菌活性全霉素的胶州湾海洋链霉
目的研究胶州湾海洋链霉菌M095抑菌活性代谢产物及菌株M095的分类.方法采用ESI-MS,EI-MS,1H-NMR,13C-NMR和APTNMR等波谱分析进行结构测定;并根据培养特征、形态特征及16SrDNA序列分析进行分类.结果获得一种对金黄色葡萄球菌和丝状真菌毛霉miehei(Tü 284)均有显著抑制作用的化合物,经鉴定其结构与全霉素相同;该菌株可能为球孢类群中的一个变种.结论本文首次报道了全霉素对丝状真菌的抑制作用,拓宽了全霉素的抗菌谱.
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一株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的海洋放线菌的鉴定及系统发育分析
从海南三亚海域的海绵中分离到一株抗耐甲氧西林金黄色芎芍methicillin-resistant Sta phylococcus aureus(MRSA)的海洋放线菌A115.该菌株在燕麦片琼脂上插片培养孢子丝螺旋形,孢子长圆形,表面有稀疏的短刺;菌株细胞壁含LL-DAP,糖型C;16S rDNA序列分析及系统发育分析表明,分离菌株A115与Streptomyces allbogriseolus属同一分支,同源性为99.0%,但形态学、生理生化鉴定及活性情况存在一些差异.由此推断菌株A115为S.albogriseolus的海洋变种,命名为Streptomyces albogriseolus var.marine.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 海洋放线菌 16S rDNA 系统发育分析 -
实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌
目的:运用实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌,为早期快速诊断气性坏疽提供新方法.方法:以产气荚膜梭菌16s rDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物与探针,将PCR扩增所得产物片段克隆,作为定量检测的标准品,绘制标准曲线.并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性、重复性及可行性.结果:实时荧光定量PCR法对产气荚膜梭菌的检测具有高度特异性,与创伤弧菌等24种相关细菌等均无交叉反应;检测灵敏度以纯菌计数达9×102cfu/mL,相当于9 cfu/反应;反应体系有较高稳定性;整个操作过程仅需3 h;300例创伤可疑分泌物样本的荧光定量PCR检测结果与细菌培养结果一致.结论:实时荧光定量PCR法特异、灵敏、快速,适用于产气荚膜梭菌的临床检测及突发事件的批量检测.
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四川泸县艾伯特埃希菌的分离与鉴定
目的 利用艾伯特埃希菌检测技术调查泸县地区家禽中艾伯特埃希菌的带染情况.方法 采集市售鸭肠及鸡肠,肠内容物经EC肉汤增菌后,PCR检测eae基因,阳性增菌液接种麦康凯琼脂,挑取不发酵乳糖、eae阳性菌落进一步通过16S rDNA测序及MLST分析,确认为艾伯特埃希菌.结果 本研究从147份鸡肠及内容物中检出12株疑似艾伯特埃希菌,经16S rDNA测序、MLST聚类分析表明该12株菌与艾伯特埃希菌参考菌株具有高度亲缘性,可证实为艾伯特埃希菌.结论 本研究证实了泸县地区家禽中存在艾伯特埃希菌,表明艾伯特埃希菌检测技术有效可行,具有推广应用价值;获得的菌株为进一步推广研究艾伯特埃希菌生物学特征、流行病学等提供资源.
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1株卵磷脂酶阴性蜡样芽胞杆菌的鉴定分析
目的 分析国家标准方法GB 4789.14-2014、全自动微生物鉴定系统和16S rDNA鉴定方法在鉴定1株卵磷脂酶阴性蜡样芽胞杆菌中的应用性.方法 用血平板从一变质豆奶中分离到1株细菌,形态疑似蜡样芽胞杆菌,应用国家标准方法GB 4789.14-2014、全自动微生物鉴定系统和16S rDNA鉴定方法对该细菌进行鉴定,并评价这3种方法在鉴定蜡样芽胞杆菌的应用性.结果 该细菌被鉴定为卵磷脂酶阴性的蜡样芽胞杆菌,且在这3种鉴定方法中,国家标准方法GB 4789.14-2014与全自动微生物鉴定系统结合可鉴定出该细菌,而16S rDNA鉴定则可单独鉴定出该细菌.结论 国家标准方法GB 4789.14-2014、全自动微生物鉴定系统和16S rDNA鉴定方法对蜡样芽胞杆菌的鉴定互为补充,各有优劣势.
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Real-time PCR快速检测钩端螺旋体方法的建立
目的:采用新型TaqMan探针建立检测钩端螺旋体的实时荧光定量PCR.方法:根据钩端螺旋体16s rDNA设计的一对引物及探针,以钩体标准菌株的核酸为模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7500)建立实时荧光定量PCR.结果:建立的定量标准曲线的循环CT值与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.998),与普通PCR相比,荧光PCR的灵敏度是其1000倍,检测其他细菌DNA,未检测到信号.结论:本研究中检测钩端螺旋体的实时荧光定量PCR具有高度的特异性和敏感性,特别适合检测样本中微量的钩端螺旋体.
关键词： 钩端螺旋体 Real-time PCR 16S rDNA -
基因芯片检测常见肠道致病菌感染的研究与评价
目的 建立一种快速准确的方法对引起腹泻的常见肠道致病菌做初步筛查,并对早期治疗和后诊断起指导作用.方法 培养大肠埃希氏菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、志贺菌、伤寒沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、艰难梭菌、普通变形杆菌等的标准菌株.根据生物信息学技术设计以16S rBNA序列为靶基因设计各细菌的特异型探针和引物.待测细菌经Cy5标记后的引物以不对称PCR方法扩增后,与固定探针的芯片进行杂交.然后用荧光扫描仪扫描,判定细菌的种类.结果 我们建立的针对16S rRNA序列的基因芯片检测系统能够成功地将14属的细菌鉴定到属.在纯培养物的低检测浓度为103CFU/mL.结论 我们所建立的基因芯片系统具有高通量和高准确性,可以作为临床鉴定细菌的一个重要的工具.
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16S rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和玻璃体标本中细菌的鉴别作用
背景 眼内炎是多种内眼手术的严重并发症,以往感染菌的确定多采用细菌培养和涂片染色法,但存在花费时间长和阳性率低的问题.16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA的序列,利用16S rDNA分子测序技术检测细菌具有高度的特异性. 目的 利用16S rDNA测序技术对细菌性眼内炎房水和/或玻璃体标本中的感染菌进行鉴定,探讨该技术在眼部感染性炎症诊断中的作用.方法 收集2015年6-12月在青岛眼科医院临床诊断为细菌性眼内炎的患者5例5眼,抽取每例患者的房水0.1～0.2 ml或玻璃标体标本0.5 ～1.0ml,各取50 μl用于高通量测序,剩余标本行涂片检查和细菌培养.采用D3096-01微量DNA试剂盒提取标本中细菌DNA,对收集的标本DNA样品进行16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增,应用MiSeq 300测序仪对扩增的16S rDNA高变区序列进行测序,分析标本中病原菌的分类组成、分布特点以及各病原菌在标本中的相对含量,取50 μl无RNA酶水于一次性无菌离心管内作为空白对照. 结果 共收集到5份房水或玻璃体标本,涂片染色结果阳性者2例,外伤性细菌性眼内炎为革兰阳性杆菌,滤过泡感染性细菌性眼内炎为革兰阴性杆菌,而细菌培养法结果均为阴性.16S rDNA测序技术发现,5例标本检测阳性率为100％.外伤性细菌性眼内炎标本中高丰度菌属为葡萄球菌属、链球菌属和假单胞菌属,分别占65.28％、18.90％和12.76％;白内障术后2d急性细菌性眼内炎患眼标本中高丰度菌属有假单胞菌属、不动杆菌属和Limnobacter菌属,分别占53.68％、8.62％和5.96％;滤过泡感染性细菌性眼内炎标本中高丰度菌属有莫拉菌属和假单胞菌属,分别占88.89％和9.52％;白内障术后22 d迟发性细菌性眼内炎标本中相对含量较高的菌属有假单胞菌属,占84.63％;白内障术后1d急性细菌性眼内炎患眼标本中相对含量较高的有假单胞菌属,占97.89％.结论 16S rDNA测序可准确鉴别眼内炎患者房水和玻璃体标本中的致病菌,该方法检测的阳性率明显高于传统的涂片染色法和细菌培养法.
