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人参炔醇对氧糖剥夺神经细胞损伤的保护作用
目的:探讨人参炔醇对氧糖剥夺(OGD)致神经细胞损伤的保护作用.方法:体外培养PC12细胞,分为正常对照组、OGD组、人参炔醇组、尼莫地平组,加入含0.5 mmol·L(-1)Na2SO4的无糖Earle's液建立OGD损伤模型,以人参炔醇(10,20mg·L(-1))、尼莫地平(100 μmol·L(-1))处理.采用荧光显微镜观察细胞形态,Hoechst和PI双染流式细胞分析仪检测凋亡率,测定培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性与细胞Ca(2+)浓度,观察人参炔醇对OGD致PC12细胞损伤的保护作用.结果:人参炔醇能够减少OGD损伤PC12细胞LDH的释放(P<0.05,P<0.01),抑制Ca(2+)的过量产生(P<0.05,P<0.01)、显著减少细胞凋亡及坏死(P<0.05,P<0.01).结论:人参炔醇对OGD致神经细胞损伤具有保护作用.
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银杏叶提取物EGb761对海马神经元氧糖剥夺后神经元凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响
目的:通过观察银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba,EGb761)对氧糖剥夺处理的原代培养海马神经元凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响,探讨EGb761对脑缺血的神经保护作用.方法:采用海马神经元培养氧糖剥夺损伤(OGD)模型,分为正常对照组、OGD组及EGb761组,观察神经元凋亡及抗凋亡蛋白Bcl-2表达情况.结果:EGb761组较OGD组能明显减少神经元凋亡,上调Bcl-2表达(P＜0.05).结论:EGb761对氧糖剥夺处理后的海马神经元具有明显保护作用.
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芹菜素对氧糖剥夺损伤小胶质细胞的抗炎作用
目的 探讨芹菜素对氧糖剥夺(OGD)损伤后复氧复糖(OCD/R)小胶质细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生的影响.方法 将原代培养的小胶质细胞随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)组及芹菜素(10、25、50 μmol/L)组,其中DMsO组和芹菜素组小胶质细胞进行OGD 8 h,之后加入相应药物培养基,观察24 h后,收集细胞上清,用双抗夹心酶联免疫吸附法检测上清中IL-1β、TNF-α含量.结果 24 h后DMSO组细胞上清中IL-1β、TNF-α含量增多(P＜0.01).芹菜素组TNF-α、IL-1β分泌量明显低于DMSO组.芹菜素可以抑制OGD后小胶质细胞的炎症反应,且呈剂量依赖性.结论 芹菜素可以通过减少OGD/R小胶质细胞中IL-1β、TNF-α的产生而发挥神经保护作用.
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经典型蛋白激酶Cγ对突触蛋白-Ⅰ磷酸化调节及其在脑缺血损伤中的作用
目的 探讨经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)对突触蛋白-Ⅰ磷酸化水平的影响及其在小鼠原代脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中作用.方法 借助cPKCγ基因敲除(cPKCγ-/-)小鼠,利用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)在体缺血模型和原代脑皮层神经元OGD离体细胞缺血模型,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹和免疫荧光等生物化学技术,验证cPKCγ与突触蛋白-Ⅰ的相互作用,探讨cPKCγ对突触蛋白-Ⅰ磷酸化水平的调节及小鼠原代脑皮层神经元OGD损伤后对神经元形态的影响.结果 免疫共沉淀结果证明,正常及缺血小鼠脑皮层组织中cPKCγ与突触蛋白-Ⅰ均存在相互作用;对突触蛋白-Ⅰ 5个可能的丝氨酸磷酸化位点进行筛选发现,只有Ser549和Ser553位点的磷酸化水平在OGD和cPKCγ敲除前后有明显变化;进一步统计分析得出,野生型(cPKCγ+/+)小鼠原代脑皮层神经元中,OGD处理使突触蛋白-Ⅰ Ser549和Ser553位点的磷酸化水平显著降低(每组n=5,与野生型常氧组相比P＜0.05),cPKCγ基因敲除可显著降低上述两个位点的磷酸化水平(每组n=5,与野生型常氧组相比P ＜0.05),而OGD处理后降低趋势更明显(每组n=5,与野生型OGD组相比P＜0.05);除此之外,OGD处理可使cPKCγ+/+和cPKCγ-/-脑皮层神经元突起的长度和数目均显著降低(每组n=8,与野生型常氧组相比,P＜0.05),cPKCγ-/-组降低现象更加显著(每组n=8,与野生型OGD组相比,P＜0.05).结论 缺血/低氧损伤情况下,cPKCγ可能通过调节突触蛋白-Ⅰ Ser549和Ser553磷酸化水平影响神经元突起的形态,从而保护神经元免受缺血/低氧损伤.
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缺血期亚低温保存再灌注后心肌细胞收缩功能的研究
目的 探讨缺血期亚低温对常温再灌注后心肌细胞的保护作用及其可能机制.方法 本实验在中山大学心肺脑复苏研究所完成.取50只SD新生1～2d乳鼠心脏,建立心肌细胞体外模型,利用氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)和氧糖恢复(oxygen and glucose restoration,OGR)模拟缺血-再灌注过程.将细胞随机(随机数字法)分入常温对照组、32℃OGD-37℃OGR组(低温组)、37℃OGD-OGR组(常温组),并在OGR 0,0.5,1.0,1.5,2.0h分别测定心肌细胞收缩频率和平均收缩速率；在OGR0,2h分别收集细胞进行透射电镜观察超微结构以及线粒体变化,同时采取差速离心法制备心肌细胞线粒体匀浆液,使用Clark氧电极测定上述两个检测时点的线粒体呼吸控制率(respiratory control rate,RCR).采用SPSS13.0统计软件分析结果.结果 低温组和常温组在OGD1 h后都出现收缩频率和收缩速率下降,但是常温组下降更明显(P =0.000).随着OGR时间延长,两组的收缩参数都呈上升趋势,但低温组在1h后收缩功能接近正常,而常温组在观测时点始终低于对照组和低温组(P=0.000).心肌细胞超微结果提示,常温组的线粒体肿胀明显,基质密度降低.线粒体RCR测定提示,低温组和常温组在OGR 0 h都明显降低,但后者损伤效应显著延长,持续到OGR2h.结论 单纯缺血期亚低温可以减轻细胞线粒体的损伤,并有助于心肌细胞早期恢复收缩功能.
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吡咯喹啉醌对神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用及其机制
目的 研究吡咯喹啉醌(PQQ)的神经保护作用及其可能机制.方法 利用不同浓度PQQ预处理Neuro2A细胞后建立氧糖剥夺模型.复氧后6 h,观察Neuro2A细胞的细胞形态、存活率、凋亡率以及活性氧(ROS)和还原型谷胱甘肽(GSH)的浓度.结果 Neuro2A细胞形态出现严重损伤;经0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μmol/L的PQQ预处理,细胞损伤减轻;细胞存活率随PQQ浓度升高呈逐渐增高趋势;经6.4 μmol/L和12.8 μmol/L的PQQ预处理,细胞凋亡减少,细胞内ROS生成减少,GSH水平增高(P＜0.05).结论 PQQ对氧糖剥夺神经细胞损伤有一定的保护作用,这一作用可能是通过减轻氧化应激反应,降低细胞凋亡率实现的.
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有丝分裂原活化蛋白激酶信号通路介导大鼠星形胶质细胞氧糖剥夺后水通道蛋白4的表达
目的 探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是否介导缺血后大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达.方法分离培养新生Sprague-Dawley大鼠脑星形胶质细胞.第2代细胞分成对照组、氧糖剥夺(OGD)组和阻断组.后两组复制OGD 5 h后复氧模型,12 h后阻断组分别换入含U0126(1 μmol/L和10 μmol/L,U1组和U10组)、SP600125(1 μmol/L和10 μmol/L,SP1组和SP10组)和SB203580(1 μmol/L和10 μmol/L,SB1组和SB10组)的培养液.复氧后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、8 h和12 h检测OGD组细胞体积,复氧后0.5 h、1 h、1.5 h、8 h和12 h Western blotting法检测OGD组AQP4表达;复氧后24 h,检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western blotting法检测各组AQP4,磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和p38 MAPK(p-p38 MAPK)表达.结果 复氧后1.5 h、2 h、3 h和4 h时,OGD组细胞体积较对照组显著增大(P<0.001),OGD组AQP4水平较对照组显著升高(P<0.001),并在复氧后1.5 h达到峰值.OGD组p-ERK、p-JNK和p-p38 MAPK、AQP4水平较对照组显著增加(P<0.001),阻断组p-ERK、p-JNK和p-p38 MAPK较OGD组显著下降(P<0.001),SB10组AQP4较OGD组显著下降(P<0.001).除SP1组、SB1组外,各干预组LDH活性较OGD组显著下降(P<0.01),SB10组低(P<0.001).结论 MAPK信号通路,特别是p38 MAPK可介导大鼠星形胶质细胞AQP4蛋白表达,加重细胞坏死.
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二十二碳六烯酸预处理增强血管生成素-1对氧糖剥夺条件下大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用
目的 评价二十二碳六烯酸(DHA)预处理是否增强血管生成素-1(Ang-1)对氧糖剥夺(OGD)条件下大鼠脑微血管内皮细胞(BMVECs)的保护作用.方法 大鼠BMVECs传代培养,第3～4代用于实验.采用随机数字表法分为7组:正常对照组、正常对照+ Ang-1组、OGD组、OGD+ Ang-1组、OGD+DHA组、OGD+ DHA+ Ang-1组、OGD+ DHA+ GW9662+ Ang-1组.在正常对照组和正常对照+ Ang-1组加入含血清、5 mmol/L葡萄糖和1.25 mmol/L丙酮酸盐的DMEM培养液;在各OGD组用无糖、无血清的DMEM液置换原培养液.在OGD+ DHA、OGD+ DHA+ Ang-1和OGD+ DHA+ GW9662+ Ang-1组加入40 μmol/L DHA,同时在OGD+ DHA+ GW9662+ Ang-1组再加入5 μmol/L GW9662[过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)的抑制剂],以上3组在5％ CO2和95％空气条件下预处理培养1h.预处理完成后,在正常对照+Ang-1组、OGD+ Ang-1组、OGD+DHA+ Ang-1组和OGD+ DHA+ GW9662+ Ang-1组加入浓度为250 ng/ml的Ang-1.除正常对照组和正常对照+ Ang-1组在5％ CO2和95％空气条件下培养外,其余各组均在94％ N2∶5％ CO2∶1％ O2低氧条件下培养,培养时间均为24h.采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax、Bcl-2、半胱天冬酶-3(caspase-3)、血管生成素受体-1 (Tie-1)、Tie-2、磷酸化的Tie-2 (pTie-2)、磷酸化的蛋白激酶B (pAkt)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)的表达水平.结果 与正常对照组比较,OGD、OGD+ Ang-1、OGD+ DHA、OGD+ DHA+ Ang-1和OGD+ DHA+ GW9662+ Ang-1组细胞凋亡显著增加(P=0.000、0.000、0.000、0.004、0.000);Bax、caspase-3、Tie-1表达显著增加(Bax:0.62 ±0.03、0.38±0.03、0.45 ±0.03、0.26 ±0.02、0.33 ±0.02比0.16 ±0.01;caspase-3:0.76±0.05、0.42±0.04、0.52±0.02、0.32±0.02、0.40±0.02比0.15 ±0.01;Tie-1:0.51 ±0.03、0.25±0.01、0.33±0.02、0.16±0.01、0.22±0.02比0.12±0.01;P均=0.000);Bcl-2、Bcl-2/Bax、Tie-2、pTie-2表达均显著降低[Bcl-2:0.09±0.01、0.20±0.01、0.16±0.02、0.31 ±0.01、0.22±0.01比0.34 ±0.01;Bcl-2/Bax:(14.93±1.86)％、(68.03±5.56)％、(36.93±2.22)％、(119.1±13.3)％、(64.23±6.07)％比(208.33 ±7.37)％;Tie-2:0.07±0.01、0.16±0.02、0.11 ±0.01、0.21±0.01、0.18±0.01比0.26±0.01;pTie-2:0.05±0.01、0.15±0.01、0.07±0.01、0.22±0.02、0.16±0.01比0.27±0.01;P均=0.000],OGD、OGD+ Ang-1、OGD+ DHA和OGD+ DHA+GW9662+ Ang-1组的pAkt、ZO-1表达亦显著降低(pAkt:0.13 ±0.01、0.26 ±0.01、0.14 ±0.01、0.28±0.02比0.39 ±0.02;ZO-1:0.08 ±0.01、0.18 ±0.01、0.10 ±0.01、0.19 ±0.01比0.23±0.02;P均=0.000).与OGD组比较,OGD+ Ang-1和OGD+ DHA+ Ang-1组细胞凋亡显著降低(P均=0.000).与正常对照+Ang-1组比较,OGD+ Ang-1和OGD+ DHA+ Ang-1组pTie-2、pAkt、ZO-1表达显著降低(pTie-2:0.15 ±0.01、0.22 ±0.02比0.52±0.02;pAkt:0.26±0.01、0.37±0.04比0.67±0.05;ZO-1:0.18±0.01、0.24±0.02比0.39 ±0.05;P均=0.000).与OGD+Ang-1组比较,OGD+ DHA+ Ang-1组细胞凋亡显著降低(P=0.000),Bax、caspase-3、Tie-1表达显著降低(P均=0.000),Bcl-2、Bcl-2/Bax、Tie-2、pTie-2、pAkt、ZO-1表达显著增加(P均=0.000);OGD+ DHA+ GW9662+ Ang-1组上述指标差异无统计学意义(P=0.202、0.770、0.382、0.448、0.233、0.736、0.143、0.526、0.495、0.670).结论 DHA预处理可提高Ang-1对OGD环境下大鼠BMVECs的保护作用,其机制可能与激活PPAR-γ、降低Tie-1表达,从而增强对Tie-2的激活作用相关.
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黄芪甲苷、麦冬皂苷作用于大鼠星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞对中风后神经干细胞增殖和分化的影响
大脑缺血缺氧的损伤，导致体内神经干细胞巢微环境结构和功能的紊乱，实验室前期研究表明三七总皂苷、人参总皂苷能够促进中风后神经干细胞增殖、迁移和分化，促进脑缺血后缺氧后VEGF 的表达。黄芪甲苷、麦冬皂苷是否能够通过作用于神经干细胞巢内的星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞，通过调控VEGF的表达促进神经干细胞的增殖和分化尚不清楚。目的：分别将胎大鼠星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞与神经干细胞共培养，模拟体内复杂的神经干细胞巢微环境，研究黄芪甲苷、麦冬皂苷是否能够通过作用于神经干细胞巢内的星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞，通过调控VEGF的表达促进神经干细胞的增殖和分化，启动脑损伤结构和功能的修复。材料：取孕15 d SD大鼠，用以分离培养神经干细胞、星形胶质细胞、和微血管内皮细胞。方法：利用Transwell装置，分别将大鼠星形胶质细胞、微血管内皮细胞和神经干细胞共培养。设立空白对照组、模型组和中药有效成分组，于氧糖剥夺模型4小时后2h、4h和6h3个时间点分别收集处理细胞和培养液，做ELISA和免疫荧光双标染色。结果：大鼠星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞分别与神经干细胞共培养条件下，与空白对照组比较，黄芪甲苷、麦冬皂苷可显著增加Brdu、Tuj-1和Vimentin阳性细胞数(P<0.05)，显著上调VEGF的表达(P<0.05)。结论：黄芪甲苷、麦冬皂苷通过作用于大鼠星形胶质细胞和微血管内皮细胞，促进神经干细胞的增殖和分化，可能与黄芪甲苷、麦冬皂苷通过促进VEGF的分泌调控神经发生有关。
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脑红蛋白在氧糖剥夺-复氧复糖诱导人神经母细胞瘤细胞线粒体膜电位去极化及活性氧生成中的作用
目的：探讨脑红蛋白（ NGB）在氧糖剥夺-复氧复糖诱导的人神经母细胞瘤细胞线粒体膜电位去极化及活性氧生成中的作用。方法在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中，使用慢病毒干扰NGB表达，建立NGB 表达敲减及相应的空载病毒稳转株。细胞行氧糖剥夺-复氧复糖处理。荧光实时定量PCR检测人神经母细胞瘤细胞NGB mRNA表达水平，免疫印迹检测人神经母细胞瘤细胞NGB蛋白表达水平。线粒体膜电位特异性染料JC-1染色，观察线粒体膜电位变化。 DCFH-DA染色，检测细胞内总活性氧水平。检测人神经母细胞瘤细胞释放乳酸脱氢酶（ LDH）活性。结果氧糖剥夺-复氧复糖后，NGB mRNA及蛋白水平升高，分别于4 h和8 h达高峰（2.04±0.35，1.69±0.18）。 NGB转染干扰NGB慢病毒较转染空载病毒线粒体膜电位去极化水平降低[荧光比值（ JC-1红色／绿色比值）1.10±0.10比1.46±0.11，P＜0.05]，总活性氧产生增多[（36.30±5.32）荧光强度／细胞比（16.26±2.97）荧光强度／细胞， P ＜0.05]，且 LDH 释放增多[（63.42±6.14）％比（49.65±5.09）％，P＜0.05]。结论 NGB对维持线粒体稳态起重要作用。干扰NGB表达可导致细胞在缺血缺氧状况下线粒体损伤加重，活性氧释放增多，细胞损伤加重。
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血管紧张素1-7对氧糖剥夺神经胶质瘤细胞U373的保护作用
目的 研究血管紧张素1-7(Ang1-7)对氧糖剥夺神经细胞凋亡的影响.方法 用厌氧培养箱模拟缺氧环境,用EBSS(NaCl 116,KCl 5.36,MgSO40.81,NaH2PO4 1.0,hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) 10,CaCl2 1.8,NaHCO3 14.7,单位均mmol·L-1)培养基制造缺糖环境,对培养的U373细胞制作氧糖剥夺模型.实验分4组:正常组未经氧糖剥夺(OGD)处理,模型组以OGD处理3h;单用实验组和联用实验组以OGD处理的同时,分别加入终浓度为1×10-7mol·L-1血管紧张素1-7处理、终浓度为1×10-5 mol· L-1肽类激素(A779)和1×10-7 mol·L-1 Ang1-7联合处理.用显微镜观察细胞形态,以噻唑蓝(MTT)法研究细胞活力,以Annexin V-FITC法结合流式细胞术研究细胞凋亡情况.结果 与模型组相比,单用实验组改善了氧糖剥夺后U373细胞的形态,突触细长,联用实验组的细胞损伤比较严重,其形态接近模型组.正常组细胞的活力设定为1.00,则模型组细胞活力为0.45,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).单用实验组的细胞活力为0.70,与模型组相比,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).在联用实验组中,由于加入了A779,使得细胞活力降低为0.51,接近模型组水平,说明A779破坏了Ang1-7的保护作用,Ang1-7的保护作用是通过Mas受体介导的.正常组的细胞凋亡率为43.01％,模型组的细胞凋亡率为83.24％,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).与模型组相比,单用实验组的细胞凋亡率为58.46％,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),说明Ang1-7对OGD后的U373细胞起到保护作用.联用实验组的细胞凋亡率为76.78％,接近模型组水平,说明A779能够拮抗Ang1-7的保护作用.结论 Ang1-7通过Mas受体减轻细胞凋亡,对氧糖剥夺的U373细胞有保护作用.
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枸杞多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后大鼠海马神经元的保护作用
目的 研究并探讨枸杞多糖对原代培养新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/RP)损伤的保护作用.方法 以原代培养的新生大鼠海马神经元为研究对象建立氧糖剥夺再灌注损伤模型 MTT法测定神经细胞的存活率,分光光度计检测乳酸脱羟酶(LDH)漏出率、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量,激光共聚焦显微镜(CLSM)测定海马神经元细胞内Ca2+浓度和线粒体膜电位水平(MMP).结果 与氧糖剥夺再灌注损伤组比较,枸杞多糖(10,20,40 mg·L-1)组可显著提高细胞存活率(P＜0.01),降低乳酸脱氢酶漏出率(P＜0.05,P＜0.01),升高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性(P＜0.01),降低丙二醛含量(P ＜0.05,P＜0.01),抑制Ca2+浓度升高(P＜0.05,P＜0.01),枸杞多糖(20,40 mg·L-1)组能显著降低线粒体膜电位水平(P＜0.01).结论 枸杞多糖对海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤具有明显保护作用.
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Kv2.1钾通道在神经元缺氧损伤中的潜在药理学作用
目的 观察钾通道阻断剂四乙铵(TEA)对缺氧缺血损伤整体、离体模型的保护作用,阐明Kv2.1电压依赖性钾通道在缺氧缺血细胞损伤中发挥的作用.方法 应用大鼠暂时性大脑中动脉阻塞(tMCAO)脑缺血模型验证TEA对脑缺血损伤的保护作用.采用膜片钳技术观察氧糖剥夺(OGD)对稳定转染Kv2.1钾通道的人胚胎肾293(HEK293)细胞膜电位以及TEA对OGDKv2.1-HEK293细胞钾电流的影响.MTT法观察OGD对Kv2.1-HEK293的损伤及TEA的保护作用.结果 TEA(5μg·kg-1)侧脑室注射可以显著减小tMCAO大鼠的脑梗死体积;应用转基因细胞的研究证实Kv2.1-HEK293对OGD损伤的敏感性明显提高;OGD可以降低Kv2.1-HEK293细胞膜电位;TEA(10 mmol·L-1)能显著抑制OGD Kv2.1-HEK293钾电流,同时使其所受的细胞损伤降低.结论 钾通道阻断剂TEA对整体和离体缺氧缺血损伤模型均发挥细胞保护作用,这种保护作用与对Kv2.1的阻断密切相关;提示Kv2.1可能是抗脑缺血药物开发的潜在靶点.
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大鼠皮层小胶质细胞氧糖剥夺模型的制备
目的 培养Wistar大鼠皮层小胶质细胞,建立氧糖剥夺模型.方法 培养Wistar大鼠皮层小胶质细胞,应用OX42抗体进行鉴定,缺氧培养小胶质细胞后测定LDH漏出率.结果 小胶质细胞培养至第8天OX42染色阳性细胞为(97.33±2.15)%;氧糖剥夺60min 时,LDH漏出率明显增加(P<0.05).结论 成功培养大鼠皮层小胶质细胞,在培养第8天可制备氧糖剥夺模型.
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安脑丸对大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤的防护作用
目的 探讨安脑丸对神经元缺氧缺糖损伤大鼠模型细胞凋亡的防护作用.方法 体外培养新生SD大鼠皮层神经元,完全随机分为正常对照组、模型组及安脑丸高、中、低剂量组.正常对照组正常培养,模型组及安脑丸各剂量组建立氧糖剥夺模型,安脑丸各剂量组加不同浓度(分别稀释10、20、30倍)含药血清的培养液,测定各组细胞存活率及凋亡率,免疫印迹法检测caspase-12、细胞色素C、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Bcl-2表达量的变化.结果 与正常对照组相比,氧糖剥夺模型组细胞凋亡率增加[(22.0±2.2)％比(3.2±0.6)％,P＜0.05],存活率明显降低[(62.4±4.6)％比(100.0±3.1)％,P＜0.05]；GRP78表达上调(P＜0.05),细胞色素C蛋白表达增加(P＜0.05),caspase-12表达增加(P＜0.05),Bcl-2表达减少(P＜0.05).安脑丸低、中、高剂量组细胞存活率分别为(74.9±2.7)％、(83.0±2.2)％、(75.2±2.8)％,均明显高于模型组(均P＜0.05)；安脑丸中剂量组细胞存活率明显高于安脑丸低、高剂量组(均P＜0.05).安脑丸中剂量组与模型组比较,24 h凋亡率明显减少[(10.4±0.7)％比(22.0±2.2)％,P＜0.05]；细胞Bcl-2表达增加(P＜0.05),细胞色素C释放和caspase-12的表达减少(均P＜0.05).结论 安脑丸对氧糖剥夺诱导的皮层神经元细胞凋亡有防护作用.
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脑红蛋白对氧糖剥夺/复氧复糖诱导的人神经母细胞瘤细胞系自噬的影响
目的 探讨脑红蛋白(Ngb)对氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)诱导的入神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)自噬的影响.方法 通过在SH-SY5Y细胞中转染Ngb质粒,建立Ngb过表达(NGB OE)及相应的空载(Vector)稳转株.细胞行OGD/R处理.聚合酶链反应(PCR)检测自噬相关基因(Atg5、Atg7、BECN1)及FUN14结构域包含蛋白-1(FUNDC1) mRNA表达水平,免疫印迹方法检测自噬相关基因(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达水平.差速离心法分离线粒体及细胞质,分别使用免疫印迹方法检测帕金森病相关蛋白(Parkin、Pink1)表达水平.结果 OGD/R处理后,自噬相关基因Atg5、Atg7、BECN1、FUNDC1 mRNA水平升高(高分别为4.90±0.71、6.72 ±0.75、2.71±0.39及3.96±0.78倍,均P ＜0.05),细胞质中Parkin减少而线粒体中Parkin显著增加.过表达Ngb不能改变自噬相关基因Atg5、Atg7、BECN1 mRNA水平,细胞质或线粒体中Parkin无显著变化.但可以增加FUNDC1mRNA含量(3.96±0.78倍比6.86±0.63倍,P＜0.05).结论 Ngb不能影响OGD/R诱导的SHSY5Y细胞自噬或线粒体自噬水平,而对FUNDC1基因的表达有促进作用,其作用机制需要进一步深入研究.
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通络救脑注射液对氧糖剥夺大鼠脑微血管内皮细胞分泌巨噬细胞炎性蛋白-1β的影响
[目的]观察通络救脑注射液对氧糖剥夺损伤(OGD)的大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液中巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)分泌情况及其受体--趋化因子受体5(CCR5)表达的影响.[方法]氧糖剥夺法建立内皮细胞OGD模型,酶联免疫银光法(ELISA)法检测脑微血管内皮细胞条件培养液中MIP-1β含量的变化,免疫组化法及Western blot法观察内皮细胞中MIP-1β及其受体CCR5的表达情况.[结果]OGD组的内皮细胞分泌大量MIP-1β至上清液,该组内皮细胞胞浆大量表达MIP-1β,同时CCR5的蛋白表达量亦随之上升,加入通络救脑注射液的OGD组,其上清液中MIP-1β分泌量显著性下降(P<0.01),MIP-1β及其受体CCR5在内皮细胞上的表达也有不同程度的下降.[结论]通络救脑注射液能够抑制OGD损伤时内皮细胞M1P-1β的分泌,减少MIP-1β和CCR5的表达,对内皮细胞缺氧损伤后趋化因子释放的抑制是其发挥解毒通络药效的途径之一.
关键词： 脑微血管内皮细胞 氧糖剥夺 巨噬细胞炎性蛋白-1β 通络方药 -
异丙酚在血脑屏障氧糖剥夺体外模型中对紧密连接蛋白ZO-1表达的影响
目的 探讨异丙酚在血脑屏障氧糖剥夺(OGD)体外模型中对紧密连接蛋白ZO-1表达的影响及其机制.方法 分离纯化Bal b/c小鼠的脑微血管内皮细胞进行体外培养,构建血脑屏障体外模型,并通过OGD处理模拟体内缺氧、缺血状态将细胞分为对照组、OGD损伤组、不同浓度(5、10、20、40 μmol/L)异丙酚处理组及蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波酯(TPA)处理组.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测内皮细胞存活力,电阻仪检测内皮细胞阻抗(TEER)值,聚合酶链反应(PCR)和Western blot分别检测异丙酚对ZO-1 mRNA和蛋白表达的影响,PKC活性检测试剂盒测定PKC活性;通过加入PKC激活剂检测PKC在异丙酚调节ZO-1表达过程中的作用.结果 10、20、40 μmol/L异丙酚可显著抑制OGD诱导的内皮细胞活力,TEER值降低和ZO-1表达水平下降(P＜0.05);此外,10、20、40 μmol/L异丙酚还可抑制OGD诱导的PKC激活(0.856±0.124、1.017±0.104、0.930±0.149 vs 0.595±0.112).在PKC激活剂的作用下,异丙酚对ZO-1 mRNA和蛋白表达的上调作用均无显著影响(0.361±0.441 vs 0.344±0.023,P=0.403;0.169±0.011vs 0.161±0.019,P=0.489).结论 异丙酚可通过抑制PKC信号通路上调血脑屏障OGD体外模型紧密连接蛋白ZO-1的表达.
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氧糖剥夺对人脐静脉内皮细胞通透性的影响
目的:建立体外氧糖剥夺模型模拟脑缺血缺氧损伤,探讨氧糖剥夺对人脐静脉内皮细胞(HUVECS)屏障功能的影响.方法:细胞培养至完全融合后换成无糖培养基置于低氧手套箱(0.3％O2)分别处理0.5h、1h、2h和4h后,利用CCk-8法检测细胞存活,利用跨内皮细胞电阻(trans-endothelial electrical resistant,TEER)方法检测HU-VECs细胞通透性的变化,以及Western blot检测紧密连接相关蛋白的表达.结果:氧糖剥夺处理0.5h、1h、2h和4h后,HUVECs细胞存活率逐渐下降,TEER值逐渐降低,紧密连接蛋白Occludin、VE-cadherin的表达明显降低.结论:氧糖剥夺破坏内皮细胞间的紧密连接功能,增加HUVECs细胞的通透性,导致细胞的存活率明显降低.
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低氧预适应对氧糖剥夺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用
目的:观察低氧预适应(HPC)对氧糖剥夺(OGD)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用,并探讨其可能机制.方法:SH-SY5Y细胞随机分为4组:正常对照组:常规培养,不进行OGD处理;HPC处理组:将神经元放入低氧培养箱内(2％O2),30 min后立即取出,再恢复常氧培养,反复5次;OGD组:无糖培养基、低氧培养箱内(1％O2)处理细胞10 h,然后复氧复糖培养24h;HPC+OGD处理组:细胞HPC后,行OGD处理.通过形态学观察,MTT比色法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)漏出量判断细胞损伤的程度,原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡水平,Western blot检测Caspase 3、低氧诱导因子1α(HIF-lα)的蛋白表达.结果:HPC可减轻OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡,降低LDH漏出量,明显增加OGD组SH-SY5Y细胞的活力(P＜0.05).Western blot显示HPC+ OGD组Cas-pase3蛋白的表达明显低于OGD组(P＜0.05);HIF-lα蛋白的表达明显高于OGD组(P＜0.05).结论:HPC对体外培养的SH-SY5Y细胞OGD损伤具有保护作用,其机制可能与上调HIF-lα蛋白有关.
