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miR-29a靶基因ITGβ1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响
目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β1(integrinβ1,ITGβ1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(pMIR-ITGβ1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ1基因靶向调控的作用.方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成cDNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体pMIR-Report 上,构建出pMIR-ITGβ1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定.将pMIR-Report Luciferase载体,所构建的pMIR-ITGβ1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ1的作用机制.结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建pMIR-ITGβ1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ1-3'UTR相应的碱基位点,并显著下调荧光素酶的表达.结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显著下调萤火虫荧光素酶的表达.
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人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建
背景：多巴胺受体启动子区多态性位点的改变会影响受体的表达量，进而影响多巴胺能神经递质的作用，导致相关疾病的发生。
目的：通过克隆人DRD1基因的启动子区，构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。
方法：以人静脉血基因组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic，构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒pGL3-TK共转染HEK293细胞同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒pGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度。
结果与结论：①通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确；②与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性；③成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体，为研究该基因的转录调控提供了基础工具。 -
人干扰素λ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及其转录活性分析
目的 构建人干扰素λ1(interferon λ1,IFNλ1)基因启动子荧光素酶报告基因载体,并探讨仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7对其转录活性的影响.方法 提取BEAS-2B细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增IFNλ1基因启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-enhancer,构建IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,将其转染293T细胞,同时用质粒IFNβ-luc和pGL3-enhancer转染作为对照.转染24 h后感染仙台病毒,于感染前和感染后4、12、18和24 h收集细胞,进行双荧光素酶活性检测;用质粒IRF3-5D或HA-IRF7与质粒IFNL1-luc共转染,36 h后收集细胞,进行双荧光素酶活性检测.结果 IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;分别转染质粒IFNL1-luc和IFNβ-luc的细胞感染仙台病毒后,荧光素酶活性倍数均随时间延长呈明显上升趋势,至18 h达到峰值(分别为1 000倍和2 300倍),转染质粒pGL3-enhancer的细胞感染仙台病毒后,不同时间点收集的细胞,荧光素酶活性倍数一直处于较低水平;质粒HA-IRF7或IRF3-5D对IFNL1-luc的活化倍数明显高于pGL3-enhancer (P＜0.05).结论 成功构建了IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7均能激活IFNL1-luc的转录,为进一步研究调控IFNλ1表达的信号转导通路奠定了基础.
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PDGF-C 3'UTR区荧光素酶报告基因载体构建
目的:构建不同长度包含目的片段的PDGFC 3'UTR双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节做准备.方法:培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞,提取腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的基因组DNA,以提取的基因组为模板,通过PCR扩增不同长度的PDGFC 3'UTR片段,经胶回收后,将回收的目的片段插入报告基因载体SV40-pGL3中,再经转化将克隆好的载体转入细菌内扩增(先在固体培养基上扩增为菌落,然后再接种进液体细菌培养管中扩增),扩增细菌后进行质粒提取,并进行菌落PCR及双酶切鉴定,后送公司进行基因序列检测鉴定.结果:成功构建了不同长度目的片段的PDGFC 3'UTR的双荧光素酶报告基因载体.结论:本实验构建了不同长度的PDGF-C mRNA的3'UTR区的双荧光素酶报告基因载体,为进一步研究PDGF-C mRNA的上游miRNA调节打下了基础.
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SOX6基因3'UTR区野生型和突变型重组质粒的构建与鉴定
目的:构建含单核苷酸多态性(SNP)位点rs1065024的SOX6基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体,并用生物信息学软件预测与rs1065024位点区域相结合的miRNA,为进一步研究此SNP位点的功能及miRNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系奠定基础.方法:提取人全血基因组DNA,以基因组DNA为模板,通过PCR扩增含SNP位点在内的SOX6基因3’UTR片段,经过胶回收纯化后,将回收的目的片段插入双荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT中,再经DH5a转化扩增,挑单克隆进行菌落PCR并进行质粒提取,对质粒进行双酶切鉴定,后进行DNA测序鉴定.针对SNP进行定点突变,构建出野生型和突变型重组质粒,并用生物信息学软件预测出与SNP位点相结合的miRNA.结果:经单菌落质粒测序验证显示带有T碱基的SOX6基因3’UTR重组质粒pMIR-REPORT-3'UTR-T构建成功;经定点突变,成功将pMIR-REPORT-3'UTR-T质粒转变为pMIR-REPORT-3'UTR-C,经比对未引入任何其他突变;生物信息学预测显示,rs1065024位点位于miR-190b、miR-190a-5p、miR-451b、miR-4791与SOX6基因3'UTR的结合区域,其多态的改变可以影响miRNA与mRNA的结合效率.结论:本研究成功构建了含SNP位点rs1065024的pMIR-REPORT-SOX6-3'UTR野生型和突变型重组质粒,为今后SOX6基因3'UTR的SNP位点的功能及miRNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系研究奠定基础.
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构建psiCHECK-2-解耦联蛋白2双荧光素酶报告基因及其荧光素酶活性的分析
目的:构建含解耦联蛋白2(UCP2)-3’非翻译区(UTR)序列的野生型和突变型质粒的双荧光素酶报告基因载体,探讨微小RNA(miR)-15b对UCP2基因表达的调控作用.方法:应用生物信息软件预测miR-15b的靶基因,分别将预测靶基因UCP2的3'UTR及其突变体克隆到荧光素酶载体psiCHECK-2骨架中,构建UCP2野生型和突变型质粒.并采用测序方法鉴定psiCHECK-2-UCP2载体是否构建成功.将UCP2野生型和突变型质粒分别与miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照在293T细胞中共转染.通过双荧光素酶报告基因检测分析miR-15b对UCP2基因表达的调控作用.结果:测序鉴定证实psiCHECK-2-UCP2双荧光素酶报告基因载体构建成功.双荧光素酶报告基因检测显示转染UCP2野生型和UCP2突变型报告基因的293T细胞过表达miR-15b后,UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显下降,下调31％(P=-0.003),过表达miR-15b抑制剂后,UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显增加,上调46％(P=0.01).而miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照对UCP2突变型的表达均无明显影响(P＞0.05).结论:UCP2是miR-15b直接作用的靶基因,且miR-15b结合于UCP2基因3'UTR区域,转录后水平对UCP2有直接的抑制作用.
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E2F1对TFDP3表达的调控及其对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响
目的:构建含TFDP3基因启动子和荧光素酶报告基因的重组载体pGL3-TFDP3-promoter,观察E2F1对TFDP3转录及表达的调控作用以及TFDP3对E2F1诱导肿瘤细胞凋亡的影响.方法:以人前列腺癌PC3细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增TFDP3启动子序列并克隆入荧光素酶报告基因载体,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA瞬时单独或共同转染PC3细胞,测定荧光素酶活性以观察E2F1对TFDP3启动子的调控作用,Western blotting检测pCMV-E2F1-HA转染对PC3细胞内TFDP3表达的影响,流式细胞术检测TFDP3与E2F1相互作用对前列腺癌细胞凋亡的影响.结果:成功构建TFDP3基因启动子重组质粒pGL3-TFDP3-promoter,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA共转染PC3细胞后,TFDP3启动子诱导的荧光素酶活性较单独转染pGL3-TFDP3-promoter显著升高[(1.14 ±0.06)vs(0.61 ±0.05),P＜0.05].转染pCMV-E2F1-HA的PC3细胞的TFDP3蛋白表达是未转染细胞的2.7倍[(0.24 ±0.03)vs(0.09 ±0.02),P＜0.05].pCMV-E2F1-HA转染后PC3细胞凋亡率较未转染组显著上升[(7.10±0.003)％ vs(2.66±0.001)％,P＜0.05],而pCMV-E2F1-HA与pcDNA3.1-TFDP3共转染后细胞凋亡率较pCMV-E2F1-HA组显著下降[(4.92±0.002)％ vs(7.10±0.003)％,P＜0.05].结论:E2F1可增强TFDP3启动子的活性,增加TFDP3蛋白的表达,其可能通过此机制抑制E2F1诱导的前列腺癌细胞凋亡.
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脂多糖对人胃癌细胞环氧化酶-2基因启动子活性的影响
目的 研究炎症状态下人胃癌细胞中环氧化酶- 2( COX-2)基因启动子活性.方法 采用免疫组织化学染色方法观察人胃癌组织中COX-2的表达情况.构建人COX-2基因启动子重组质粒pGL3-COX-2-promoter,采用脂质体介导转染法将重组质粒和内参质粒pRL-TK共转染胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823.以不同质量浓度的脂多糖(LPS)工作液刺激细胞,于干预后不同时间点收集细胞,利用双荧光报告系统进行双荧光素酶报告基因活性检测,Western blotting检测COX-2蛋白的表达.结果 免疫组织化学染色观察发现,胃癌癌细胞胞质及癌旁黏膜上皮细胞的胞质中均有COX-2蛋白表达.在相同时间点,SGC-7901和BGC-823内COX-2基因启动子活性随LPS质量浓度的上升而增高(P＜0.05);高浓度(10 μg/mL)LPS刺激6h后COX-2基因启动子活性达到峰值,随后逐渐降低(P＜0.05).Western blotting检测结果显示:在10 μg/mL LPS干预下,SGC-7901和BGC-823内COX-2蛋白表达随LPS干预时间的延长而呈现上升趋势.结论 炎症刺激可激活人胃癌细胞COX-2基因启动子的表达活性.
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人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建
目的 克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体.方法 通过PCR方法 从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5'上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性.结果 经PCR方法 扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆长序列具有启动子活性.结论 成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆 IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础.
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具有miRNA海绵功能的circRNA的生物信息学分析与鉴定
目的 对一种新的具有miRNA海绵功能的circRNA--hsa_circ_0000254结构、功能进行生物信息学分析与鉴定.方法 采用生物信息学对hsa_circ_0000254的二级结构及靶向序列进行分析,通过双荧光素酶实验验证hsa_circ_0000254与靶基因的结合情况.结果 生物信息学分析发现hsa_circ_0000254,剪接序列长度为524nt,包含11个miR-125b可结合位点;双荧光素酶实验证实hsa_circ_0000254与miR-125b具有较高的结合效率.结论 hsa_circ_0000254能以miRNA海绵形式抑制miR-125b,有可能作为靶向治疗工具应用于高表达miR-125b的白血病治疗.
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葛根素对成骨细胞增殖能力及靶向Runx2的miRNA的影响
目的研究葛根素作用成骨细胞MC3T3-E1后对细胞的增殖能力和靶向Runx2基因的miRNA的影响。方法①MTT法检测葛根素作用于MC3T3-E1细胞后对成骨细胞增殖能力的影响。②碱性磷酸酶活性检测葛根素对于成骨细胞活力影响。③葛根素作用于成骨细胞后,采用荧光实时定量 PCR ( Q-PCR )和蛋白印迹法( Western blot )法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平。④采用Target Scan、PicTar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA,并与表达谱测定的葛根素作用MC3T3-E1前后miRNA变化作比较。⑤采用Q-PCR法验证葛根素作用MC3T3-E1前后靶向Runx2基因的miRNA表达量。⑥构建Runx23′UTR/突变型Runx23′UTR重组质粒、合成 miRNA-204mimics、miR-NA-204inhibitor、miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,用双荧光素酶报告基因系统验证Runx2与miRNA-204的靶向关系。结果葛根素作用后,与空白对照组比较,细胞增殖活性提高,Runx2的 mRNA和蛋白表达水平上升, miRNA-204和miRNA-344f-5p表达水平下降,miRNA-2861表达水平上升, miRNA-23a-5p、miRNA-770-5p、miRNA-871-5p 表达水平无明显改变。细胞转染48h后,只有Runx23′UTR+miRNA-204 mimics组荧光素蛋白的表达水平明显降低,说明只有miRNA-204可抑制Runx23′UTR报告基因的表达。结论葛根素可促进成骨细胞增殖,并通过下调靶向 Runx2的miRNA的表达来提高Runx2表达水平。
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TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选
目的：构建并鉴定pGL3-TNF-α3′端非翻译区( UTR)双荧光素酶报告基因( DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成cDNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3′-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体pGL3-control上,构建出pGL3-TNF-α3′UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的pGL3-TNF-α3′UTR与pSVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建 pGL3-TNF-α3′UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖( LPS )可以明显诱导转入pGL3-TNF-α3′UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的pGL3-TNF-α3′UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3′UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。
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间尼索地平对人孕烷X受体介导的CYP450酶的转录调节作用
间尼索地平(m-nisoldipine,MNS)[化学名称:1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸甲酯异丁酯]是由河北医科大学药学院首次合成的一类新型二氢吡啶类药物,存在一个手性中心,可拆分为两个光学对映体(R,S-m-nisoldipine)[1].二氢吡啶类药物为钙通道拮抗剂,特异性高,在临床上广泛用于治疗高血压.
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人P D-L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建
目的：对人源PD-L1基因启动子进行PCR扩增，构建PD-L1荧光素酶报告基因。方法：用PCR扩增方法获得PD-L1基因启动子；PD-L1启动子和载体行KpnⅠ、XhoⅠ酶切、连接和转化，然后行菌落PCR以及测序等。构建成功后转染至A549细胞中并检测PD-L1启动子活性。结果：经PCR方法扩增出PD-L1基因启动子片段，；菌落PCR鉴定各重组体构建正确并经生工测序成功；瞬时转染A549细胞后经报告基因检测得知所克隆的不同片段序列具有启动子活性。结论：成功克隆PD-L1基因启动子，构建出不同片段基因启动子荧光素酶报告基因，为进一步研究其分子机制提供详实基础。
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双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-326对BCL2L1、BAK1的靶向调控
目的 构建psiCHECK2荧光素酶报告基因载体,验证hsa-miR-326对BCL2L1和BAK1表达的影响.方法 设计合成包含与hsa-miR-326结合序列及其突变型序列的BCL2L1和BAK1基因片段,构建荧光素酶报告基因载体,转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化观察hsa-miR-326对BCL2L1和BAK1表达的影响.结果 hsa-miR-326对BCL2L1组的荧光表达有非常显著的抑制作用(P＜0.01);而对BCL2L1-mut、BAK1和BAK1-mut组的荧光表达没有显著的抑制作用(P＞0.05).结论 hsa-miR-326可以调控BCL2L1的表达,但对BAK1的表达未见影响,推测hsa-miR-326可能通过下调BCL2L1参与血小板的凋亡.
关键词： hsa-miR-326 双荧光素酶报告基因 BCL2L1 Bak1 -
双荧光素酶报告基因系统检测 CYP3A4*1G 增强 CYP3A4表达的调控作用
目的：探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法：设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段（外显子10与内含子10交界处287和181 bp），构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体，与内参质粒pRL-TK共转染HepG2细胞，通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果：与CYP3 A4启动子相比较， G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达（F＝795．575，P＜0．001），且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义（P＞0．05）。与CYP3A4启动子相比较，G 与A 等位基因在181 bp DNA 片段中均降低了荧光素酶表达（F＝23．218，P＜0．001），而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件，该抑制元件对CYP3 A4*1 G增强CYP3 A4基因表达起负调控作用。
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微小RNA-124调控靶基因IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞生长、侵袭、转移的研究
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-124在甲状腺乳头状癌(PTC)组织中的表达,探讨miR-124在PTC发生发展、侵袭转移中的相关功能机制,验证IQ结构域三磷酸鸟苷合酶-激活蛋白1(IQGAP1)为miR-124的靶基因.方法 收集手术切除并经病理检查确诊的不同病理学背景的甲状腺组织.检测miR-124在上述组织中的表达.选取3个PTC细胞株及正常甲状腺细胞株检测miR-124的表达差异.将人类miR-124模拟物(Has-miR-124 mimics)转染人K1细胞,检测转染后miR-124的表达.同时检测下游靶基因IQGPA1的表达;噻唑蓝(MTT)法、划痕实验、Transwell法、流式细胞学检测细胞生物学活性变化.运用生物信息学预测IQGAP1为miR-124的可能的下游靶基因并用双荧光素酶报告基因系统验证.结果 有转移PTC淋巴结转移灶中miR-124的相对表达量为1.120±0.104,低于转移PTC原发灶、无转移PTC、正常甲状腺组织中miR-124的表达量(P＜0.05).PTC细胞株中miR-124的表达也较正常甲状腺细胞株明显降低(P＜0.05).miR-124 mimics 转染K1后检测证实miR-124被成功增强.K1细胞中miR-124表达增强后24 ～72 h后活细胞数目明显少于对照组(P＜0.05).迁徙能力为对照组的50％,侵袭能力为对照组的40％ (P ＜0.05).细胞增殖指数降低,凋亡增加(P＜0.05).用生物信息学方法预测IQGAP1为miR-124的可能靶基因.证实miR-124增强后IQGAP1的表达量有不同程度地降低.证实了IQGAP1为miR-124的下游靶基因.结论 miR-124在PTC及PTC细胞株中低表达.miR-124表达增强后,K1细胞的迁徙侵袭、增殖能力降低,凋亡增加.生物信息学预测,IQGAP1为miR-124的靶基因.miR-124表达增强后,K1细胞中的IQGAP1表达降低.
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含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建
目的 构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体.方法 从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达:上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达.结果 经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP.结论 含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础.
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MiR-143通过负调控GLI3基因来抑制鼻咽癌细胞的迁移
目的 探讨miR-143在鼻咽癌细胞迁移中的生物学功能及可能的分子机制.方法 应用生物信息软件预测miR-143靶基因,分别将预测靶基因GLI3的3'UTR及其突变体构建到荧光素酶载体psiCHECK-2骨架中.通过荧光素酶报告基因检测分析miR-143对靶基因GLI3的调控作用,并检测转染miR-143mimics、inhibitor和siGLI3后鼻咽癌5-8F细胞miR-143和GLI3的表达水平及迁移能力的变化.结果 生物信息学预测Hh信号通路转录基因GLI3可能是miR-143的靶基因；双荧光素酶报告基因分析表明miR-143能够作用于GLI3的3'UTR；Western Blot和qRT-PCR结果进一步证明5-8F细胞中miR-143与GLI3的表达呈负相关,并影响5-8F细胞的迁移能力.结论 MiR-143可通过负调控靶基因GLI3抑制鼻咽癌细胞的迁移,为进一步研究miR-143及Hh信号通路在鼻咽癌中的作用机制提供参考价值.
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Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定
目的 构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因.方法 扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体；扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性.流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达.结果 质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功.荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关.双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的31UTR.稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降.结论 成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因.
关键词： Has-mir-335 慢病毒 结直肠癌细胞 双荧光素酶报告基因
