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姜黄素对氧化应激中肝星状细胞活化及细胞外基质分泌的影响
目的 观察姜黄素对氧化应激中大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化及细胞外基质分泌的影响.方法 将HSC-T6分成对照组、模型组、干预组.对照组正常培养,模型组加入100 mU/mL葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GO)干预2 h,制备细胞氧化应激模型,干预组分别加入15 μmol/L和30 μmol/L姜黄素分别干预3 h,然后给予100 mU/mL GO干预2 h.免疫荧光法观察HSC-T6中desmin和α-SMA的表达,分光光度法检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,放射免疫法检测细胞内透明质酸(hyaluronic acid,HA),层粘连蛋白(laminin,LN),Ⅲ型前胶原(procollagenⅢ,PCⅢ),Ⅳ型胶原(collagenⅣ,CⅣ)水平的变化.结果 模型组MDA较对照组显著升高(P＜0.01),姜黄素15 μmol/L干预组MDA较模型组有所降低(P＜0.05),姜黄素30 μmol/L干预组MDA较模型组明显降低(P＜0.01);模型组GSH较对照组显著升高(P＜0.01),姜黄素干预组GSH均较模型组显著升高(P＜0.01),姜黄素30 μmol/L的作用优于15 μmol/L; 对照组中α-SMA无明显表达,模型组中α-SMA大量表达,干预组中α-SMA的表达明显减少,其中姜黄素30 μmol/L的作用优于15 μmol/L;模型组HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平较对照组显著升高(P＜0.01),姜黄素15 μmol/L干预组细胞内HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平较模型组有所降低(P＜0.05),姜黄素30 μmol/L干预组HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平较模型组明显降低(P＜0.01).结论 姜黄素在低浓度内能够呈浓度依赖性地降低星状细胞内氧化应激水平,抑制星状细胞活化进而减轻细胞纤维化.
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瘦素与SB-431542干预大鼠肝星状细胞及其生物学活性的改变
目的 研究TGF-β1受体特异性拮抗剂SB-431542干预瘦素对肝星状细胞的生物活性及其相关机制.方法 采用PT-PCR法检测α 1(I)前胶原mRNA和α-平滑肌肌动蛋白(d-SMA)mRNA的变化；用间接免疫荧光来观察α1(I)前胶原蛋白、α-SMA蛋白的表达.结果 瘦素加SB-431542组与瘦素组相比,各指标之间的差异有统计学意义(P＜0.05),随浓度的增加,时间的延长,SB-431542对瘦素刺激的HSC-T6增殖纤维化有显著的抑制作用.结论 SB-431542可明显抑制瘦素的生物学活性,可能通过抑制TGF-β1信号系统而使细胞外基质(ECM)的合成减少,从而抑制肝纤维化.
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三甲散含药血清对大鼠HSC-T6细胞Rho/ROCK信号通路的影响
目的:观察三甲散含药血清对HSC-T6细胞增殖及对Rho/ROCK信号通路的影响.方法:以三甲散含药血清作用HSC-T6细胞,以MTT法检测其对HSC-T6细胞增殖的影响,ELISA检测其对Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响,荧光定量PCR检测其对α-SMA、TIMP-1、ROCK-Ⅰ mRNA表达的影响,Western blot检测其对α-SMA、TIMP-1、ROCK-Ⅰ蛋白表达的影响.结果:三甲散含药血清对HSC-T6细胞增殖抑制率从12 h开始升高,24 h达到峰值;三甲散组细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原含量较空白对照组显著降低(P＜0.05或P＜0.01);三甲散和Y-27632均能下调HSC-T6细胞α-SMA、ROCK-Ⅰ、TIMP-1 mRNA及蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01).结论:三甲散可抑制HSC-T6细胞的增殖,其机制可能与Rho/ROCK信号通路有关.
关键词： 三甲散 HSC-T6 Rho/Rock信号通路 -
23种岭南中药抗肝纤维化有效部位的高通量筛选
目的 采用高通量筛选技术评价23种单味岭南中药提取物对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响,初步筛选出具有抗肝纤维化作用的活性部位.方法 将23种临床常用单味岭南中药分别先用95％乙醇提取,再用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水依次萃取,并制成115种中草药干浸膏.采用keyFluor488 Click-iT EdU评价不同浓度梯度(50 μg·mL-1、25μg· mL-1、12.5 μg·mL-1)干浸膏对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响.结果 能使HSC-T6的增殖率明显下降的乙醇总提取物有溪黄草、黑老虎、虎杖等13种,石油醚萃取部位有黑老虎、荔枝核、虎杖和苦石莲子4种,乙酸乙酯萃取部位有溪黄草、山芝麻等13种,水饱和正丁醇萃取部位有马蹄金,水萃取部位有翠云草.其中4个萃取部位均不能降低HSC-T6增殖率的有红丝线、金盏银盘、白花丹、鸡骨草.结论 通过对23种岭南中药的95％乙醇总提物、石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水萃取物进行筛选,发现溪黄草、黑老虎等提取物对HSC-T6细胞的增殖有抑制作用,为进一步开展抗纤维化中草药有效成分的筛选及体内动物研究提供实验依据.
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柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02细胞增殖和凋亡的初步观察
目的:探讨柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine,SASP)对正常肝细胞和肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖和凋亡的影响.方法:以正常人肝细胞株(L02细胞)和大鼠肝星状细胞株(HSC-T6细胞)为研究靶细胞,用CCK-8比色法检测细胞增殖;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测HSC-T6细胞凋亡率;AO/EB染色法观察细胞凋亡形态.结果:同对照组比较,一定浓度范围的SASP对HSC的增殖具有显著的抑制作用,呈现时间和剂量效应.膜联蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(PI)双染显示SASP诱导HSC-T6凋亡也旱现时间和剂量效应;AO/EB染色出现凋亡细胞的特征性改变.而SASP干预L02后,与对照组相比,增殖和凋亡率均无统计学意义,AO/EB染色后,未出现凋亡细胞.结论:同等干预浓度的SASP能够选择性的抑制HSC增殖,诱导其凋亡.
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柳氮磺胺吡啶诱导HSC-T6肝星状细胞凋亡及其机制
目的 观察柳氮磺胺吡啶及其分解产物对肝星状细胞株HSC-T6增殖和凋亡的影响,并对其分子机制作初步探讨.方法 用CCK-8比色法检测细胞增殖;流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染检测HSC-T6细胞凋亡率;AO/EB染色法观察细胞凋亡形态,Western blot检测NF-κB P65、P-IKK、P-IκB蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察P65核转位.结果 柳氮磺胺吡啶能剂量依赖性的抑制HSC-T6肝星状细胞的增殖;AO/EB染色法、AnnexinV/PI染色结果证明柳氮磺胺吡啶能诱导HSC-T6肝星状细胞的凋亡;而5-氨基水杨酸和磺胺吡啶对HSC-T6的增殖和凋亡无影响.Western blot结果表明柳氮磺胺吡啶不是5-氨基水杨酸和磺胺吡啶抑制IKK、IκB的磷酸化、细胞核NF-κB P65的表达(P＜0.05),激光共聚焦显微镜下观察到,柳氮磺胺吡啶组P65核转位被抑制.结论 柳氮磺胺吡啶可抑制HSC-T6的增殖并诱导凋亡,其机制可能与其抑制Rel/NF-κB/IκB/IKK信号通路有关.
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鳖甲煎丸对肝星状细胞中β-catenin及NF-κB信号通路活化的影响
目的:通过研究鳖甲煎丸药物血清对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中β-catenin的表达水平及NF-κB信号通路的活化的调控作用,探讨鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机制.方法:鳖甲煎丸(0.45 g/kg,0.9 g/kg,1.8/kg)和秋水仙碱(0.2 mg/kg)药物血清培养永生化HSC-T6细胞,培养24 h后采用qPCR检测HSC-T6细胞中β-catenin mRNA的表达水平,免疫荧光检测β-catenin蛋白的表达水平,Western blotting检测p65、p50的表达水平,ELISA检测下游靶基因TGF-β和TNF-α的表达水平.结果:与空白对照组相比,鳖甲煎丸(0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg)和秋水仙碱(0.2 mg/kg)药物血清组中β-catenin mRNA的表达水平显著降低,同时,鳖甲煎丸药物血清组(0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg)能够抑制p65的蛋白表达水平,但对p50的的表达无显著影响,并可显著抑制TGF-β和TNF-α的表达,且这种调控作用具有浓度依赖性.结论:鳖甲煎丸抗肝纤维化的药理作用可能与其下调HSC-T6细胞中β-catenin的表达水平,调控NF-κB信号通路的活化,并有效抑制下游靶基因TGF-β和TNF-α的表达水平密切相关,这可能是鳖甲煎丸抑制肝星状细胞增殖、活化的重要分子机制之一.
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鳖甲煎改良方对肝星状细胞生长及TGFβ1、Smad3与Smad7表达的影响
目的 探讨鳖甲煎改良方(modified turtle shell decoction,MTSD)对肝星状细胞T6 (hepatic stellate cell T6,HSC-T6)TGFβ1、Smad3及Smad7表达的影响.方法 用含生药量为0.71 g/ml的MTSD处理HSC-T6作为实验组,与MTSD剂量相同的鳖甲煎丸(turtle shell pills,TSP)处理的HSC-T6作为阳性对照组,常规培养的HSC-T6作为正常对照组,倒置显微镜下观察比较各组HSC-T6的形态变化.CCK-8检测各组HSC-T6细胞的生长情况,并绘制生长曲线;采用Real time-PCR、免疫荧光细胞化学及Western blotting技术分别检测各组HSC-T6的TGFβ1、Smad3及Smad7基因及其编码蛋白的表达变化.结果 倒置显微镜下观察显示,与阳性对照细胞比较,MTSD处理48 h的HSC-T6,胞体变小,部分细胞死亡碎裂.CCK-8检测证实,MTSD对HSC-T6生长具有抑制作用,与2个对照组比较,MTSD处理的HSC-T6的生长减慢,从48 h开始差异具有统计意义(P＜0.01).Real time-PCR、免疫荧光细胞化学及Western blotting检测显示,MTSD能在mRNA及蛋白水平明显下调HSC-T6的TGFβ1、Smad3的表达,上调其Smad7的表达,与2个对照组相比,差异均具统计学意义(P＜0.01).结论 MTSD能有效抑制HSC-T6的生长,下调其TGFβ1、Smad3的表达,同时使Smad7的表达上调.MTSD抑制HSC-T6的生长可能与干扰TGFβ1/Smad3信号通路密切有关.
