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基于指纹图谱的丹参药材蛋白提取方法研究
目的：比较筛选适合于建立丹参药材蛋白指纹图谱的蛋白提取方法。方法：比较三羟基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）法、枸橼酸盐法、聚乙烯吡咯烷酮缓冲液（PVP buffer）法、改良饱和酚法、TCA-丙酮法、直接提取法（分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、蒸馏水）、蛋白质提取液提取法等9种蛋白质提取方法，比较其聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）谱带的差异。结果：蛋白质提取液、PVP buffer提取的蛋白质杂质较多，其谱带模糊；TCA-丙酮法、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液的背景较浅，其中分离胶缓冲液的条带少；而浓缩胶缓冲液的条带多，蛋白含量较高且背景清晰。结论：浓缩胶缓冲液适合作为建立丹参药材蛋白指纹图谱的提取溶剂。
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阿霉素对端粒序列及其相似物电泳迁移速度的影响
目的 观察阿霉素对端粒序列d(TTAGGG)不同重复次数以及与其具有相似结构的单核苷酸序列二级结构的影响,探讨阿霉素诱导端粒复重序列d(TTAGGG)n形成鸟嘌呤四联体的机制.方法 人工化学合成线性单核苷酸序列d(TTAGGG)、d (TTAGGG)2、d(TTAGGG)3、d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5、d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)、d(TTGAGG)4；用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法观察不同浓度阿霉素(0、1.25、2.5、5.0μg/mL)对端粒重复序列d(TTAGGG)4电泳迁移速度的影响；观察5.0μg/mL阿霉素对d(TTAGGG)、d(TTAGGG)2、d(TTAGG)3、d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5电泳迁移速度的影响；观察5.0 μg/mL阿霉素对d(TTAGGG)4、d(TTGGAG)4 、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4 、d(TTGAGG)4电泳迁移速度的影响.结果 随着阿霉素的浓度的提高,端粒重复序列d(TTAGGG)4电泳迁移速度也随之加快；阿霉素可使端粒重复序列d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5序列的二级结构发生改变,从而加快其电泳迁移的速度,对d(TTAGGG)、d(TTAGGG)2、d(TTAGGG)3的电泳迁移速度没有影响；阿霉素可对含有GGG碱基排列的端粒重复序列发生电泳迁移速度的加快,而对无GGG碱基排列的端粒序列类似物的电泳迁移没有影响.结论 在阿霉素存在条件下,端粒序列d(TTAGGG)n重复4次以上的寡核苷酸序列的电泳迁移速度加快,其二级结构的改变是迁移速度加快的主要原因,这种改变后形成的二级结构可能为G-四联体.
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酶联免疫印迹法对弓形虫速殖子功能性抗原分析
目的:研究弓形虫功能性抗原,为开发弓形虫病诊断试剂及疫苗提供理论基础.方法:采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹方法,对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析.结果:弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在SDS-PAGE中用125g/L的分离胶可产生较好的分辨率,分离出30多条区带.免疫印迹分析表明2种抗血清均能特异地识别弓形虫速殖子抗原,共同识别的抗原组分相对分子质量为43000、33000、27000、14000.结论:这些抗原组分是诱导宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原.
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聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良
目的:对变性及非变性聚丙烯酰胺凝胶银染方法适条件进行探讨和改良.方法:采用PCR-聚丙烯酰胺电泳、硝酸银染色检测159～196 bp及336 bp DNA片段,并对不同显影液浓度与显色温度下的结果进行比较.结果:DNA分子经改良银染法检测均清晰可见,对比良好.结论:聚丙烯酰胺凝胶电泳后采用银染技术分析,方便快捷,易长期保存,并减小了对人及环境的毒害作用.
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大鼠足阳明胃经循经部位发现特异蛋白电泳条带的实验研究
目的:通过蛋白质凝胶电泳技术,寻找大鼠循经部位与非循经部位蛋白质条带的差异,证实循经部位是否存在特异蛋白.方法:在大鼠足阳明胃经循经部位与非循经部位选取皮下结缔组织,提取蛋白质制备电泳样品,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察二者蛋白电泳条带差异.结果:在电泳图谱中可观察到大鼠循经部位存在特异蛋白电泳条带(非循经部位不存在).结论:初步证明大鼠足阳明胃经循经部位存在特异蛋白质.
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催化系统对聚丙烯酰胺凝胶聚合的影响
目的探讨不同的催化系统对不同酸碱条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶聚合的影响.方法采用不同剂量的过硫酸铵(AP)-四甲基乙二胺(TEMED)催化系统组合和过硫酸铵(AP)-硫酸亚铁(FeSO4)-抗坏血酸(VC)催化系统组合,进行碱性PAGE和酸性PAGE,观察各组凝胶聚合所需时间.结果 AP-TEMED在碱性电泳中应用,0.05%～0.1%的AP和0.1%的TEMED用量,凝胶聚合在0.5 h内完成;在酸性电泳中应用时,0.2%的AP和0.3%～0.4%的TEMED用量,凝胶聚合在2 h内完成.AP-VC-FeSO4催化系统应用于酸性电泳时设计的10组用量,48 h均未发现凝胶形成.结论 AP-TEMED催化系统在碱性PAGE中的效果好于酸性PAGE.在碱性电泳中,以0.05%～0.1%的AP和0.1%的TEMED为宜;在酸性电泳中,以0.2%的AP和0.3%～0.4%的TEMED为宜.
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人类Y染色体STR基因座多态性及其法医学应用
人类基因组的基因及基因外区域含有的二碱基、三碱基及四碱基的短串联重复序列(short tandem repeat,STR),能提供大量的遗传标记(genetic marker,GM)[1,2],可用于构建基因连锁图,诊断遗传性疾病,以及解决法医学实践中生物物证的个人识别及亲子鉴定等问题.STR基因座的DNA多态性可用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及硝酸银染色法检测,通过待测样品扩增产物与等位基因标记物比较,可迅速准确地判断扩增产物片段的大小,并命名等位基因.STR等位基因片段小,大约为核心序列长度为2～6 bp,可用于测定陈旧检材中已经降解了的DNA,解决常见性犯罪的混合斑检验问题.
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四川淫羊藿属8种植物的同工酶分析
目的 分析四川淫羊藿属8种植物的酯酶(EST)同工酶和过氧化物酶(POD)同工酶.方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE)分离叶片组织中的EST同工酶和POD同工酶,用NTSYSpc2.1软件对酶谱进行聚类分析.结果 淫羊藿属植物的EST和POD同工酶酶带都较少,13份材料仅有6条POD酶带,4条EST酶带,不同物种和同种不同居群之间的同工酶酶谱均表现出差异;通过POD和EST同工酶电泳酶谱聚类分析,将13份材料聚为两大类,第一大类全为大花类群的淫羊藿,第二大类全为小花类群的淫羊藿.结论 淫羊藿属植物的POD和EST同工酶电泳酶谱在一定程度上能反映出材料间的系统关系,但并不能完全真实的反映材料间的亲缘关系,还需要综合考虑形态学、细胞学、DNA分子标记以及地理学等更多的研究结果.
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白首乌蛋白质及同工酶电泳实验研究
目的:建立白首乌电泳指纹图谱,作为中药白首乌药材鉴定及质量检测标准之一.方法:对泰山白首乌Cynanchum bungei Decne、耳叶牛皮消C. auriculatum Royle ex Wight及其栽培种、隔山消 C.wilfoldii (Maxim.) Hemsl.等一组白首乌进行了蛋白质及同工酶电泳分析,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法并扫描电泳结果,测绘上述各样品的蛋白质及同工酶电泳指纹图谱,并与何首乌进行了对比.结果:各样品的指纹图谱均有差异,并具有各自的主要特征谱带与特征峰,白首乌与何首乌差异显著,白首乌种间亦有明显差异.结论:其指纹图谱可以作为白首乌的药材种类鉴定、检测方法之一.
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顺序特异性引物法检测胰腺穿刺物及胰液中K-ras基因点突变
自1994年以来，我们采用多聚酶链反应-顺序特异性引物（PCR-SSP）检测胰腺癌细针穿刺组织及胰液中K-ras基因第12位密码子有无突变及突变方式，现报道如下。 一、对象与方法 1.标本来源：自1994年1月至1996年12月，行病变组织细针穿刺共88例，其中胰腺癌35例，慢性胰腺炎20例，壶腹癌8例，胆管癌7例，胰岛素瘤6例及正常胰腺组织12例。采用内窥镜逆行胰胆管造影或术中胰管穿刺或术后外引流收集到胰液47份，其中胰腺癌17例，慢性胰腺炎17例，胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌各3例及胰腺外伤4例。穿刺物或胰腺离心沉淀物用蛋白酶K裂解液裂解，上清液用作PCR模板。50 μl反应体系中含50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.5、1.8 mmol/L MgCl2 ,引物浓度各1.0 μmo1/L,4种dNTP浓度各200 μmo1/L,Taq DNA聚合酶1.5 U。每一体系：94℃45 s变性，55 ℃45 s退火，72 ℃ 45 s延伸，共35个循环。扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外灯下观察。
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试剂盒配合琼脂糖EB染色法和PAGE银染法分析线粒体DNA A1555G突变的比较研究
目的 通过比较试剂盒配合琼脂糖EB染色法和PAGE银染法分析线粒体DNA A1555G突变的不同特点,探索应用标准试剂盒和PAGE银染方法检测线粒体DNA A1555G突变的快速筛查和诊断方法.方法 采用线粒体DNA A1555G突变诊断试剂盒配合PAGE胶电泳银染法检测线粒体DNA 1555位点正常者229例,A＞G突变阳性者17例,验证此试剂盒配合PAGE银染法检测的有效性和准确性.结果 线粒体DNA A1555G突变诊断试剂盒配合PAGE胶电泳银染法检测结果与酶切EB染色和测序结果完全吻合.结论 线粒体DNA A1555G突变诊断试剂盒配合PAGE胶电泳银染法和试剂盒配合EB检测法较前者更为灵敏和清晰,在分析线粒体DNA A1555G突变方面具有简单、价廉、结果直观的特点,适合在中国用于进行此突变的大规模筛查或预防性检查.
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴别紫花前胡与白花前胡及其伪品
目的 对紫花前胡的根及白花前胡的根及其伪品进行鉴定.方法 采用SDS - PAGE对紫花前胡的根及白花前胡的根及其伪品进行鉴别.结果 两者的根及其伪品的根都有明显不同,因此可以确定两者及其伪品之间有明显差别.结论 该电泳方法可作为紫花前胡和白花前胡优质种质资源及其伪品的鉴别依据之一.
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茯苓不同菌株酯酶同工酶研究
目的 探讨茯芩不同菌株间的亲缘关系.方法 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳对26种茯苓菌株的酯酶同工酶进行了研究.结果 共检测到不同茯苓菌株有2-5条酶带不等,而且深浅、宽窄都有所不同.其中基本酶带有2条,其相对迁移率分别为0.128和0.341.结论 各菌株分别具有2-5条酶带,其中5杨、T1、茯苓28、A10等亲缘关系较近,ZJ、同仁堂、麻城、PO等亲缘关系较近,5杨、靖28、华农等亲缘关系较远.
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不同产地半夏及其混淆品的SDS PAGE电泳鉴别
目的 建立不同产地半夏与其混淆品的蛋白质电泳鉴别方法.方法 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对不同产地半夏与其混淆品(英山滴水珠、本院药园掌叶半夏、蛇山半夏、钟祥半夏、钟祥掌叶半夏及戟叶犁头尖)进行鉴别分析.结果 不同产地的半夏具有相似的电泳图谱,但半夏与其混淆品图谱之间具有显著性差异.结论 SDS-PAGE电泳鉴别可以对不同产地的半夏进行初步鉴别,并可鉴别半夏及其混淆品的特征,方法简便、可靠.
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应用PAGE技术分析武汉市婴幼儿轮状病毒分子流行病学特征
对1996年4月～1997年3月期间就诊于武汉市儿童医院的1683例门诊腹泻患儿粪便标本进行了轮状病毒RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在515份标本中检出了轮状病毒RNA，阳性率为30.60%。所检出的轮状病毒2个组中，以第二亚组多见，占98.25％，2个亚组又可进一步分为五种电泳型，即S、L1、L2、L3、L4型，5种电泳型中以L1型为主，占轮状病毒RNA阳性病例的56.12%。对患儿临床表现、年龄与阳性率进行比较发现，呕吐、咳嗽、粪检时镜下脂肪球的发生均与轮状病毒感染密切相关(P<0.005)，且发病以2岁内为易感年龄。
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缺氧-复氧诱导ECV304细胞与中性粒细胞粘附的分子机制
为探讨缺氧-复氧诱导人脐静脉内皮细胞ECV304与中性粒细胞粘附的信号转导机制,以缺氧-复氧诱导粘附为模型,采用比色法检测粘附率,流式细胞术检测ECV304细胞表面粘附分子E选择素、细胞间粘附分子1的表达,Western blot法检测ECV304细胞亲环素A、磷酸化细胞外信号调节激酶、总细胞外信号调节激酶、磷酸化p70核糖体S6激酶、总p70核糖体S6激酶蛋白的表达.结果发现,经缺氧-复氧处理后,ECV304细胞 E选择素、细胞间粘附分子1的表达上调,其表面中性粒细胞粘附增加.总细胞外信号调节激酶、总p70核糖体S6激酶蛋白表达无明显改变,亲环素A蛋白表达明显上调,细胞外信号调节激酶和p70核糖体S6激酶显著活化.亲环素A抑制剂环孢霉素A以及亲环素A反义寡核苷酸均明显减轻缺氧-复氧诱导的细胞外信号调节激酶和p70核糖体S6激酶激活,显著减少ECV304细胞与中性粒细胞粘附.p70核糖体S6激酶阻断剂雷帕霉素显著抑制p70核糖体S6激酶的激活,中性粒细胞与ECV304细胞的粘附亦明显减少.细胞外信号调节激酶信号通路特异性阻断剂PD98059亦显著抑制ECV304细胞与中性粒细胞粘附.结果提示,亲环素A-细胞外信号调节激酶-p70核糖体S6激酶信号通路介导缺氧-复氧诱导的ECV304细胞与中性粒细胞粘附.
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活化淋巴细胞诱导人血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶表达
为探讨活化的淋巴细胞直接接触对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶表达的影响,用乙酸肉豆蔻佛波醇活化并经1%多聚甲醛固定的人外周血淋巴细胞,与培养的人类胚胎血管平滑肌细胞共同孵育,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定细胞培养上清液中基质金属蛋白酶的活性.结果发现,基础状态下的体外培养人血管平滑肌细胞合成基质金属蛋白酶2的酶原形式,有少量基质金属蛋白酶2的活性形式存在.经佛波醇活化淋巴细胞组上清液中可检测到基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9活性,并且基质金属蛋白酶2活性形式较对照组增加198%±27%(P＜0.01),未经佛波醇活化的淋巴细胞不影响血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶的合成和分泌.以上结果提示,活化固定的淋巴细胞可以通过细胞直接接触诱导血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶表达增加及活化,在动脉粥样硬化的斑块破裂过程中可能起重要作用.
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中医药降血脂抗动脉粥样硬化研究基地——介绍浙江中医学院分子医学研究所
浙江中医学院分子医学研究所成立于1979年，1999年成为浙江省中医心血管病重点实验室，通过省三级实验室评估。实验室面积980 m2，下设生物化学研究室、细胞生物学研究室、分子生物学研究室和免疫学研究室。主要从事脂与脂蛋白代谢研究、中医药降血脂抗动脉粥样硬化研究和中西医结合防治心血管病研究，是国内中医院校从事中西医结合基础研究的基地之一。 近十年该所已成功地从人血清中分离纯化脂蛋白(a)、载脂蛋白AⅠ、AⅣ、B100、E、C、载脂蛋白(a)、LPL和LDL受体，并能制备上述单克隆和多克隆抗体。应用酶标记、同位素标记和荧光标记技术建立用于脂代谢研究相关的测定试剂盒。开展放射免疫、免疫火箭电泳、免疫扩散、酶联免疫等方法进行脂与脂蛋白代谢的检测。应用免疫印迹试验、点杂交试验、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及配体试验等进行蛋白质分析。能利用培养的乳鼠心肌细胞、人皮肤纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞等从事中药药理学研究。目前开展的细胞微注射技术为使用分子生物学技术从事脂代谢与降脂药物作用机理的研究奠定了基础。
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悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析
目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析.方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析,收集主要蛋白质,SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量,并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清.结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白,而第二峰降段蛋白含量甚微,收集各段进行SDS-PAGE,出现6条蛋白区带,分子量分别为7、50、35、39、22和16kd.第一峰主要含22～71 kd蛋白质,峰2升段以14～16kd之蛋白质为主.对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带,蛋白分子量为50、39、22和16kd,病人血清结合百分比分别为100%、28.57%、57.14%和14.29%.结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分,第一峰的50、39和22 kd的蛋白质为主要致敏组分,第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原.
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非小细胞肺癌组织中MMP-2和MMP-9的表达和意义
目的 探讨非小细胞肺癌组织中MMP-2和MMP-9的表达和意义.方法 选取非小细胞肺癌组织140例,肺良性疾病组织40例作对照.用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫组化方法检测其MMP-2和MMP-9的表达.结果 肺癌组织中MMP-2阳性率为67.9％,MMP-9表达阳性率为75.0％,显著高于对照组肺组织16.7％和20.0％(P ＜0.05)；MMP-2及MMP-9蛋白与年龄,性别,不同病理类型的阳性率表达差异无显著性(P＞0.05);与是否发生淋巴结转移及肺癌TNM分期差异具有显著性(P＜0.05).结论 MMP-2和MMP-9在非小细胞肺癌中表达阳性率较高,在癌症细胞侵润和转移阶段有促进作用,对恶性肺癌的诊断具有重要意义.
