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克隆性基因重排检测BIOMED-2系统中内对照体系的改进
目的 监测克隆性基因重排各检测管中PCR反应体系的完整性及反应条件的稳定性,避免基因重排的假阴性结果.方法 利用多重PCR方法,检测免疫球蛋白(Ig)中IgH-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3、IgK-VJ、IgK-V/i克隆性基因重排和T细胞受体(TCR)中TCRβ-VJ1、TCRβ-VJ2、TCRβ-DJ、TCRγ-VJ1和TCRγ-VJ2克隆性基因重排.①选择GC100和GC300作为管内对照,在各反应管中加入适当的内对照引物,浓度分别为0.625 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L,PCR扩增后行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),分析结果.②根据①的实验结果,在各反应管中加入适浓度内对照,以制备好的突变浓度为20%、10%、7.5%、5%、2.5%的基因重排样本为模板,PCR扩增后行PAGE,分析结果.结果 克隆性重排检测引物工作液浓度均为10 μmol/L;检测IgH-FR1、IgH-FR2、IgK-VJ、IgK-V/i、TCRβ-VJ1、TCRβ-VJ2、TCRβ-DJ和TCRγ-VJ1各管中,加入管内对照基因的扩增片段大小均为100 bp,引物浓度均为5 μmol/L;检测IgH-FR3管中,管内对照基因的扩增片段大小为300 bp,引物浓度为5 μmol/L;检测TCRγ-VJ2管中,管内对照基因的扩增片段大小为300 bp,引物浓度为1.25 μmol/L.改进后体系检测敏感度在2.5%~5.0%之间.结论 在BIOMED-2系统中增加合适的管内对照,能够监测每个检测管中PCR反应体系的完整性及反应条件的稳定性.
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聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用
目的:探讨聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用.方法:提取正常组大鼠和链脲佐菌素致糖尿病模型组大鼠心肌组织总RNA,逆转录得到cDNA第一链,以此为模板进行PCR扩增,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术分析不同循环数及模板量与PCR产物量间的关系.结果:PCR扩增反应在第20～25个循环,起始模板量为0.8～2.4μg时,PCR产物量与起始模板量呈现较好的线性关系.结论:通过控制起始模板量,减少PCR循环数使目的基因的扩增处于PCR扩增指数期,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DM银染技术,可以通过比较PCR扩增产物量的变化以分析目的基因表达水平的差异.
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不同产地人参中水溶性蛋白质含量的差异性研究
目的 针对长白山区15个不同产地人参中水溶性蛋白成分的含量进行比较研究,以鉴别人参质量的地域性差别.方法 采用SDS-PAGE获得人参中水溶性蛋白的电泳胶片,通过凝胶成像软件将胶片转化成浓度-比移值图谱,累计叠加不同产地的谱图,比较分析不同条带的浓度变化情况.结果 不同产地人参中水溶性蛋白的SDS-PAGE电泳谱带条数无明显差别,主要谱带为13条,但因浓度的不同而引起的谱带的指纹信息差异较大.结论 人参水溶性蛋白的含量在不同产地间存在差异,与地域性密切相关.
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2462例婴幼儿急性腹泻轮状病毒感染情况调查
目的:研究5岁以下急性腹泻患儿人类轮状病毒(HRV)的感染情况. 方法: 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测轮状病毒抗原,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测HRV核酸型别.结果: HRV的检出率在10～12月份高(约为55%),1～6月份次之(约为35%),7～9月份低( 约为8% ).HRV的感染率以6个月至2岁组高(占46.0%),<6月组次之(占27.0%),2～5岁组低(占8.6%).1996年10月至1997年1月,本地区流行的HRV电泳型以长型为主,占63.0% (46/73) , 未见混合型.结论:HRV是本地区10～12月间6个月至2岁婴幼儿急性腹泻的主要病原.
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用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序法制备DXS9898 基因座等位基因分型标准物
目的:探索一种快速制备X染色体短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因座等位基因分型标准物的简便方法.方法:采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)切胶回收-二次PCR-测序的方法制备X -STR基因座等位基因分型标准物.结果:应用此法制备出大量的DXS9898基因座等位基因分型标准物.结论:利用PCR- PAGE切胶回收-PCR测序制备STR基因座等位基因分型标准物是一种简便易行的方法.
关键词： 聚丙烯酰胺凝胶电泳 切胶回收 DXS9898基因座 等位基因分型标准物 -
三种栽培龙胆种子的电泳鉴别
目的 鉴别条叶龙胆、粗糙龙胆和三花龙胆等三种东北栽培龙胆种子,规范中药材生产.方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对条叶龙胆、粗糙龙胆和三花龙胆三种植物发芽种子的POD、SOD、MDH、ADH、CCO进行电泳分析.结果 通过POD电泳可准确鉴别出三种龙胆种子,通过SOD和ADH可分别准确地鉴别出粗糙龙胆和三花龙胆.
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我国旋毛虫地理株的同工酶分析
目的 为旋毛虫属的分类提供依据.方法 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对我国6个猪源旋毛虫地理株(河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津)肌幼虫的超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸酶(ME)、酯酶(EST)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)进行分析,并以旋毛虫(17tichinella spiralis,T1)、乡土旋毛虫(T. nativa,T2)、布氏旋毛虫(T. britovi,T3)、伪旋毛虫(T. pseudlospiralis,T4)及纳氏旋毛虫(T. nelsoi,T7)的国际参考株作为对照.结果 我国6个猪源旋毛虫地理株的4种同工酶(SOD、ME、EST、GLDH)酶谱均与T1的相同.结论 经4种同T酶分析我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1.
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南平市婴幼儿腹泻轮状病毒核酸电泳分析
[目的]研究南平市婴幼儿腹泻轮状病毒流行趋势.[方法] 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对1998-2000年167份腹泻粪便标本进行轮状病毒RNA分析. [结果] 从167份标本检出A组轮状病毒55份,其中秋冬季腹泻的阳性率为45%(54/121),春夏季为 2%(1/46);轮状病毒RNA分型:A组长型40株(73%);A组短型15株(27%);1998年A组长型占90%,1999年A组长型降至73%,2000年长型占47%,短型上升至53%;[结论]A组轮状病毒是南平市婴幼儿腹泻的主要病原,A组长型与短型的流行在不同年份呈动态变化的趋势.
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福州市2003年婴幼儿轮状病毒腹泻监测
[目的]研究福州市婴幼儿轮状病毒腹泻流行趋势.[方法]应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对4家医院婴幼儿腹泻粪便标本进行轮状病毒核酸(RNA)分析.[结果]从466份标本检出A组轮状病毒269份,检出率57.7%.RNA分型:A组长型263株,占97.8%;A组短型6株,占2.2%;[结论]A组长型是福州市2003年婴幼儿轮状病毒腹泻流行的优势型别.
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家蝇抗菌物质诱导表达后的电泳分析
目的 探讨家蝇抗菌肽的诱导及电泳分离方法.方法 家蝇三龄幼虫针刺体壁诱导后,第48h提取其血淋巴,置于100℃、80℃水浴10s、30s、lmin、3min、5min等不同时间后,观察不同温度处理不同时间后的去杂蛋白效果和对溶壁微球菌的抑菌效果,并对各样品进行电泳分离.结果 血淋巴100℃水浴10s、30s、1min仍有抑菌活性,处理3min和5min无抑菌活性;80℃水浴30s-5min均有抑菌活性,电泳显示100℃处理3min和5min的样品与其他相比缺少2条蛋白区带.结论 针刺诱导的家蝇抗菌肽分离时血淋巴预处理采用80℃水浴lmin去杂蛋白效果较好,诱导的血淋巴100℃处理3min和5min即丧失抗菌活性,电泳显示缺少2条区带,此2条差异区带可能为抗菌肽组份.
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灭囊灵对体外培养的猪囊尾蚴虫体蛋白质组分及含量的影响
目的探讨灭囊灵杀灭猪囊尾蚴的作用机理.方法应用PAGE和薄层扫描技术,观察灭囊灵对体外培养猪囊尾蚴虫体蛋白质组分及含量的影响.结果灭囊灵组囊尾蚴蛋白经PAGE可分离出17～25条蛋白带.经薄层扫描分析:灭囊灵0.6ml、1.2ml和2.4ml三个剂量组在70～75区段蛋白扫描无峰;0.6ml组在105～110区段峰值高,1.2ml和2.4ml剂量组在110～115区段峰值高.峰面积积分值占8%以上者为高峰带,0.6ml和2.4ml组可见6个高峰,1.2ml组可见5个高峰.以上三项指标与原囊尾蚴和空白对照组均有明显差别.结论灭囊灵对猪囊尾蚴虫体蛋白组分和含量均有明显影响.
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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
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改良PAGE法用于人类珠蛋白多态性研究
目的:探讨人类新生儿HbF中珠蛋白链简便、快速、准确的分离方法.方法:对传统的含Triton X-100的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳法的凝胶系统作了进一步的改进,其中Triton X-100和TEMED等主要物质的浓度作了调整,不同于其它文献报导的.结果:该改良法能使凝胶聚合时间缩短、一次电泳时间从6 h缩短为2 h,HbF中各珠蛋白链得到良好分离,电泳条带清晰,无拖尾现象;结论:该方法操作简便,分离效果好,电泳时间缩短,极大地提高了研究效率.
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三叶木通可溶性蛋白及同工酶分析
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对三叶木通可溶性蛋白及同工酶进行初步研究.结果表明,各样品的蛋白质、同工酶酶谱有共有带,但酶带数量与活性强度有差异;POD同工酶差异明显,可作为品种鉴定的生化指标.
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山东省HIV异源双链泳动分析法分型体系研究
[目的]克隆山东省流行的HIV-1优势亚型的代表毒株的包膜蛋白基因,建立用于山东省HIV-1分型的异源双链泳动分析体系.[方法]2003年11～12月将与山东省HIV-1 B′/C、B′和A/E各亚型共享序列接近的毒株用套式聚合酶链反应(PCR)技术扩增包膜(env)基因,克隆到p GEM-Teasy载体中,构建成用于异源双链泳动分析(HMA)分型的山东标准亚型质粒,并摸索各反应和电泳的佳条件.[结果]共建立HMA的分型标准质粒11株,建立以标准质粒为分型标准、包含3套可供选择的片段扩增策略的HMA体系,与序列分析比较各亚型代表株的检出率(敏感性)分别达到了B′94%、B′/C 90%、A/E 90%.[结论]建立的HMA分型体系经济、方便、易掌握、结果可靠,值得推广.
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聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别女贞子与日本女贞子
目的:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对女贞果实及日本女贞果实进行鉴定.方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对女贞的果实及日本女贞的果实进行分析.结果:实验结果显示出两种果实的明显不同,因此可以确定两者之间有明显差别.结论:该电泳方法可作为女贞和日本女贞优质种质资源的鉴别依据之一.
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科研论文中电泳的应用及其照片发表规范
带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis).电泳现象早在19世纪初就已发现,但电泳技术的广泛应用,则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后,20世纪50年代初相继用支持物进行电泳,如滤纸电泳,醋酸纤维素膜电泳、琼脂电泳,20世纪50年代末又出现淀粉凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等.
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12种《中国药典》对照药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析
植物类中药细胞内普遍含有受遗传基因控制的蛋白质分子,且具有种的特异性和稳定性, 利用这一规律,可鉴别亲缘关系相近的不同种类的药材.本文采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 (PAGE),对12种《中国药典》对照药材进行了分析,旨在为中药材鉴别提供一项新的评价指标,同时为建立中药材电泳鉴别图谱库提供资料.
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不同方法对寡聚甘露糖醛酸铬配合物分子量测定的影响
目的 探讨不同方法对于测定具有抗2型糖尿病活性的海洋寡聚甘露糖醛酸铬配合物(HS203)分子量测定的影响.方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),高效凝胶渗透色谱(HPGPC)及高效凝胶渗透色谱与多角度激光光散射器联用(HPGPC-MALLS)法分别测定HS203的分子量,并考察了不同色谱柱以及不同分子量对照品的选择对于HS203分子量测定结果的影响.结果 PAGE法表明HS203的聚合度为5～20之间,通过计算得出HS203的重均分子量范围在2 400～2 600Da.在HPGPC分析过程中,不同色谱柱对于HS203分子量测定结果影响不大,采用右旋糖酐作为对照品测得分子量为6 000～7 100Da,明显大于PAGE结果,采用结构相似的自制对照品测定结果为2 900～3 100 Da,与PAGE结果较为接近.采用HPGPC-MALLS法测定结果约为3 000 Da,也与PAGE法所测结果相近.结论 不同测定方法测得的HS203分子量结果不同.PAGE法能直观地观察到HS203聚合度的分布情况,并能真实反映分子量大小.HPGPC法应用普遍,操作方面,但对照品的选择对HPGPC法测定分子量十分重要,必须选用与待测样品结构相似的对照品.HPGPC-MALLS法测定糖类化合物分子量无需对照品且结果可靠,但该法需要专用且昂贵的仪器.
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海洋微生物来源吲哚酮纤溶化合物影响纤溶因子构象特性的研究
目的 研究FGFC1对各纤溶因子构象的影响及FGFC1促进纤溶反应的机制.方法 采用圆二色谱法研究FGFC1对各纤溶因子结构的影响,采用发色底物法研究FGFC1对各纤溶因子活性的影响,采用SDS-PAGE电泳法研究FGFC1在纤溶酶原和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂构成的相互活化反应体系中的作用.结果 远紫外区的CD结果表明FGFC1在23～115 μmol·L1的浓度范围内均使各纤溶因子的二级结构发生变化,这变化都导致酶分子柔性增加、更易发生反应;近紫外区的CD结果表明,FGFC1使纤溶酶原在285 nm处的摩尔旋光度增大.CD研究结果表明FGFC1对单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂结构的影响较为微弱,对纤溶酶及纤溶酶原结构的影响复杂而深刻.运用发色底物法检测加入不同浓度FGFC1后各纤溶因子的酶活力,排除了FGFC1对纤溶因子的结构影响而导致的纤溶因子失活的可能性.在体外构筑的纤溶反应体系中,SDS-PAGE的结果显示FGFC1的加入促进FITC-纤维蛋白原的降解,表明FG-FC1加速纤溶酶原和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的相互活化作用.结论 FGFC1作用于纤溶酶原并辅以改变单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的二级结构发挥纤溶促进作用.
