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一种同时检测急性髓系白血病FLT3-ITD和NPM1基因突变的快速和简便方法
目的 建立用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)同时快速检测正常核型急性髓细胞白血病(cytogenetically normal acute myeloid leukemia,CN-AML)患者FLT3-ITD 和NPM1基因突变的方法.方法 在多重PCR基础上,用毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)和PAGE凝胶电泳法同时检测117例初发CN-AML患者的FLT3-ITD和NPM1基因突变.结果 突变型双链DNA分子,如突变型FLT3和NPM1的长度均比野生型长(FLT3 -mut:420 bp＞FLT3-wt:327～332 bp,NPM1 -mut:172 bp＞ NPM1 -wt:168 bp),因此,在PAGE凝胶电泳中突变双链DNA比未突变的DNA移动得慢,从而可将突变检出.117例CN-AML患者均通过CE检测得到验证,其结果与PAGE凝胶电泳结果完全一致(FLT3-ITD +/NPM1-患者18例,占15.4％; FLT3 ITD +/NPM1+患者19例,占16.2％；FLT3-ITD -/NPM1+患者25例,占21.4％；FLT3-ITD -/NPM1-患者55例,占47.0％).结论 两种电泳法均可快速、简便地同时检测CN-AML患者FLT3- ITD和NPM1基因突变.CE检测敏感,图像清晰；PAGE凝胶电泳法则操作简单,成本低,结果可靠,更适于在基层医院开展初步筛查.
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斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原分析及其应用
目的探索斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原(ES-Ag)的诊断价值.方法采用SDS-PAGE和EITB分析斯氏狸殖吸虫幼虫ES-Ag,以幼虫ES-Ag Dot-ELISA检测人血清抗体.结果幼虫ES-Ag在20kD～60kD间可显示4条蛋白区带,主带24kD抗原蛋白对人体斯氏狸殖吸虫感染具有诊断价值.幼虫ES-Ag Dot-ELISA检测28例肺吸虫病人血清抗体均为阳性,低阳性反应滴度为1:320,滴度倒数几何均数为1 1 60.6份日本血吸虫病人血清、4份华支睾吸虫病人血清、20份健康人血清皆呈阴性反应.结论斯氏狸殖吸虫幼虫ES-AgDot-ELISA为诊断肺吸虫病敏感、特异的诊断方法.
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唾液富组蛋白的分离纯化及抗菌活性观察
目的:探索用电泳技术分离纯化腮腺唾液富组蛋白(HRPs),并观察其抗菌活性.方法:采用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE),从健康成人刺激性腮腺唾液中分离纯化3种主要富组蛋白(HRP-1、HRP-3、HRP-5);通过琼脂糖弥散抗菌实验,观察它们对变形链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的抗菌活性.结果:分离纯化出的3种主要HRPs经AU-PAGE及Tricine-SDS-PAGE分析,均为单一的蛋白区带,分子量3～5 kD.3种主要HRPs对变形链球菌和金黄色葡萄球菌均有抗菌活性;HRP-3和HRP-5对大肠杆菌和绿脓杆菌有明显抗菌活性.结论:采用制备性AU-PAGE来分离HRPs,具有分辨率高、操作简便、纯化效果好等特点.HRPs为一组内源性广谱抗菌活性多肽,对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌,包括一些抗生素耐药菌株,都有抗菌作用,可能是口腔抗微生物感染的重要分子,与口腔乃至全身健康密切相关.
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Tricine-SDS-PAGE法分析腮腺唾液蛋白
多种口腔疾病或系统性疾病的发生、发展过程中,唾液成分的质和量都可能发生改变[1].唾液蛋白作为唾液的主要有机成分,与唾液的多种生理功能密切相关[2].因此研究唾液蛋白对于了解机体的生理及病理状况具有重要意义.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是常用的唾液蛋白的分离方法.传统的SDS-PAGE系统由Laemmli建立,该系统对分子量在20 kD以下的蛋白分离欠佳[3],需通过繁琐的操作制备梯度凝胶.而腮腺唾液的主要成分富脯蛋白和富组蛋白的分子量为10～40 kD和3～5 kD,故分析腮腺唾液蛋白需要对Laemmli的方法进行改进.既往研究发现经SDS-PAGE电泳后,唾液富脯蛋白难以着色.但可去除乙酸脱色液中的其他有机溶剂成分,使富脯蛋白发生变色效应呈紫红色,与其它蛋白区分[4].
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高效毛细管电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测基因点突变的比较
目的 比较高效毛细管电泳(HPCE)技术和传统聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测结肠癌DNA是否存在p53基因点突变的方法.方法 分别采用HPCE与PAGE作单链构象多态性(SCP)分析,检测结肠癌肿瘤标本p53基因第7外显子PCR扩增产物,DNA测序检测其准确性.结果 利用HPCE技术和PAGE结合银染技术从22例结肠癌标本中分别检测出5例和4例突变,测序证实点突变的确存在.结论 HPCE技术较PAGE更为快速、简便和准确,对临床筛查基因点突变有较高的应用价值.
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析壳寡糖
目的 研究一种快速准确的分析壳寡糖组成的定性测定方法.方法 通过连续电泳和不连续电泳对比实验确定壳寡糖的佳分析条件.结果 浓缩胶浓度为3%,分离胶浓度为17.5%,上样量为10 μl,恒定电流为40 mA,电泳时间50 min条件下,获得佳壳寡糖分析图谱. 结论 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析壳寡糖组成的方法的确是一种简单快速有效地定性检测方法.
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钩端螺旋体种特异性抗原的提取
钩端螺旋体病(简称钩体病)是流行广泛的自然疫源性人兽共患病.由于其群(型)复杂,流行菌株众多,且有地区性即有许多地方株的存在,预防效果不佳,危害极大.目前主要用钩体疫苗进行预防,现已发展到第三代,第一代是全细胞死菌苗,虽有一定效果,但存在免疫力低下,副作用大等缺陷.第二代是钩体外膜菌苗[1]、脂多糖疫苗[2]、红细胞致敏物菌苗[3]及核糖体提取物疫苗[4],与全细胞菌苗相比,具有化学成份单纯,免疫效果好,毒性较小等优点,但仍属群(型)特异性疫苗,故需制备多价疫苗用于预防,为此许多学者正致力于钩体属(种)特异性疫苗的研制[5].近年有研究者发现[6],分子量为39KD的疏水外膜蛋白为问号状钩体所独有,是其稳定的抗原分子,有种特异性.本实验主要目的是想通过一系列实验建立一种在普通实验室条件下提取39KD钩体外膜蛋白的方法,为其进一步应用提供实验技术路线.现报告如下:
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免疫印迹法凝胶问题解析
免疫印迹法是检测蛋白质特性、表达和分布的一种常用的方法,正确掌握该法有助于分子生物学研究的开展,但是在凝胶过程中常出现各种问题,针对具体问题进行解析.
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尿蛋白电泳评估肾损伤临床价值的探讨
目的 通过分析不同类型肾损伤患者尿蛋白的特点,探讨尿蛋白电泳在评估肾损伤方面的临床价值.方法 选取196例不同类型肾损伤患者,将其分为单纯糖尿病组49例,糖尿病并发高血压组42例,单纯高血压组48例,IgA肾病组22例,狼疮性肾炎组14例和原发性肾病综合征组21例,同时选取34例健康对照组,收集随机尿,应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术进行尿蛋白成分分析,并检测尿微量清蛋白(MAU),同时检测病例组和健康对照组的血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),对数据进行统计学分析.结果 根据SDS-PAGE结果,将尿蛋白电泳类型分为未检出蛋白组、生理性蛋白尿组和病理性蛋白尿组,病理性蛋白尿组根据蛋白质分子量大小又分为混合14kD组、混合27kD组、肾小管性蛋白尿组、肾小球性蛋白尿组;单纯糖尿病组、单纯高血压组以肾小管性蛋白尿居多(分别占约22.4％和27.1％),糖尿病并发高血压组、IgA肾病组、狼疮性肾炎组均以混合14kD组蛋白尿为主(分别占约31.0％,36.4％,35.7％),原发性肾病综合征(PNS)组以肾小球性蛋白尿为主(占33.3％),健康对照组仅有4例在66kDa处有条带,且条带淡染,其余未检出任何条带.对各组尿MAU,SCr和BUN进行统计学分析,混合14kD组与27kD组MAU检测差异无统计学意义(P>0.05),与其他各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);混合14kD组SCr和BUN与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 尿蛋白电泳能够在MAU,SCr和BUN出现异常之前检测出蛋白条带,比MAU,SCr和BUN等实验指标能够更早更全面地反映肾损伤程度及部位,对判断肾损伤具有重要的临床价值.
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聚丙烯酰胺凝胶的快速考马斯蓝染色和脱色方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是一项常用的分析技术,它常以考马斯蓝、甲醇和乙酸作为染色和脱色剂,传统的染色和脱色时间分别为3～6 h和10～48 h.本文介绍一种快速的高温染色和漂洗脱色的方法,该法简便、快速、经济、有效.染色和脱色时间均可缩短至0.5～1.0 h.
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PAGE银染法显示变形链球菌AP-PCR指纹图的可行性研究
目的:探讨PAGE银染法显示变形链球菌的AP-PCR指纹图的可行性.方法:将200个临床分离株的AP-PCR扩增产物分别进行PAGE银染和琼脂糖凝胶电泳EB染色,比较2种图象的清晰度和对基因型的分辨能力,计算结果一致性的Kappa值.结果:结果一致性的Kappa值为1,表明PAGE银染和琼脂糖凝胶电泳EB染色一样可显示变形链球菌的AP-PCR指纹.而且PAGE由于可显示多个细小的条带,较琼脂糖凝胶电泳EB染色有更高的清晰度,可更为清晰地显示出变形链球菌的AP-PCR指纹图.结论:PAGE银染法可以显示变形链球菌的AP-PCR指纹图.
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全唾液中蛋白质含量检测及其等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
目的:探讨唾液成分的变化,观察其与疾病发生、发展的关系.方法:收集无口腔疾患的健康人103例、牙周炎患者26例、口腔颌面部恶性肿瘤患者41例全唾液标本,采用Lowry法、等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶(SDS PAGE)电泳方法进行分析.结果:①正常人组、牙周炎和肿瘤组全唾液中蛋白质含量(mg/ml)分别为1.09±0.24、1.11±0.09和1.05±0.05(P＞0.05),牙周炎组及肿瘤组与正常人组相差不显著.②肿瘤组蛋白质等电点区带较正常人组数量略有增加,但其区带的分布与正常人组未见明显差异;正常人组和牙周炎组蛋白质的等电点区带总数分别为30条和39条,其等电点区带与正常人在数量和区带分布上均不相同.当pH偏酸或偏碱的情况下,其数量均相应发生变化,其中pH偏碱时表现更为显著,少量增加表现在pH偏酸区域.③正常人与肿瘤全唾液的SDS-PAGE样本区带数量分别为6.4和6.24,其区别主要在于50 000～52 000、77 000、38 000等不同相对分子质量区域以及30 000以下相对分子质量附近区域可见新的区带分布.结论:牙周炎状态以及肿瘤发生时,唾液蛋白质总含量虽变化不显著,但SDS-PAGE、IEF图谱蛋白质区带的等电点及相对分子质量的分布区域发生改变,表明唾液分泌蛋白质的种类增加,唾液成分代谢产物发生改变.
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小鼠釉丛蛋白在大肠杆菌中的表达,纯化及抗血清的制备
目的:以大肠杆菌为工程菌制备釉丛蛋白,纯化并免疫制备抗血清.方法:用酶切、连接的方法将已克隆至pBluescript KS+载体中的Tuftelin cDNA片段(编码365个氨基酸)用T4 DNA连接酶连入载体pPRoEXTMHTc中,转化大肠杆菌,IPTG 诱导.收集菌体,裂解后SDS-PAGE 电泳,表达出分子量Mr 42×103的融合蛋白.割胶后免疫新西兰大白兔,制备抗体.结果:表达出分子量Mr 42×103的融合蛋白与预期一致.8周以后,Western检测抗原抗体特异性及抗体效价达1:100 000.结论:认为成功的表达出釉丛蛋白并制备出了高效价多克隆抗体.
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决明子降脂蛋白质的初步鉴定
目的对具有降脂作用的决明子蛋白质进行初步鉴定.方法用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及毛细管等电聚焦(CIEF)测定决明子降脂蛋白质的分子量和等电点.结果 SDS-PAGE结果表明,降脂蛋白质由分子量分别为42 000,40 000和38 000的3种蛋白质组成;CIEF也表明,降脂蛋白质由等电点分别为5.88,5.61和1.95的3种蛋白质组成.结论降脂蛋白质为非均一蛋白质,尚需以降脂活性评价为导向,进行进一步的分离.
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MVR-PCR检测中国汉族人群D16S309基因座遗传多态性
0 引言 D16S309(MS205)基因座位于16p13.3(AE006466)[1],表现出高度的多态性. 核心序列为45～54 bp,重复次数8～87次[2]. 研究采用小卫星变异重复单位聚合酶链反应(minisatellite variant repeat-PCR,MVR-PCR)技术,选择3′侧翼区引物(公共引物)205B(X68405)与MVR特异性引物205-TAG-A和205-TAG-T匹配进行PCR扩增,联合聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法对106名中国河北汉族无关个体进行调查,并对家系样品进行分析,揭示了河北汉族人群D16S309基因座3'端遗传多态性.
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法国梧桐花粉的部分纯化及其主要变应原免疫活性分析
目的对法国梧桐花粉变应原进行部分纯化并对其主要变应原免疫活性进行分析.方法采用凝胶层析法分离纯化法国梧桐花粉变应原,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的主要峰段的蛋白质分子质量,并对7例法国梧桐花粉过敏支气管哮喘患者血清进行免疫印迹分析.结果法国梧桐花粉变应原粗制液经 Sephadex G-100层析柱洗脱得两个洗脱峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白;收集各段进行SDS-PAGE电泳,第一峰升段、峰段、降段电泳图相似,主要含分子质量为22～71ku之蛋白质,第二峰升段以分子质量为14～16ku之蛋白质为主.电泳结果清晰显示6条蛋白区带,分子质量分别为71、50、35、39、22、16ku.免疫印迹分析可见4条sIgG反应带,分子质量为50、39、22、16ku.结论法国梧桐花粉变应原含6种主要蛋白成分,第一峰蛋白质含量高,为主要致敏组分;第二峰蛋白质含量少,为次要致敏组分.
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慢性乙肝患者HBV核心蛋白启动子变异的初步研究
目的通过对乙型肝炎病毒(HBV)基本核心基因启动子(BCP)变异的研究,阐明HBV准种在慢性感染者中存在的意义.方法以中国株HBV基因序列为依据,设计特异性多聚酶链反应(PCR)引物,自40例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV的BCP基因,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术展示缺失突变,DNA测序确定病毒的变异程度.结果聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,60%(24/40)患者血清中可见2～3条扩增条带;测序结果发现BCP区存在多种突变形式:点突变中以140 nt(T→C)为常见,缺失突变多见于TA1,TA2及TA3,多表现为8 bp和20 bp的缺失.结论 HBV BCP区内有一缺失高变区,并在患者体内存有多种变异形式;TA1,TA2和TA3的变异可能影响e抗原的表达.HBV慢性携带者体内有HBV准种共存.
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应用微机处理聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色图像结果
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是核酸研究中的重要实验技术.以PAGE为基础的聚合酶链反应结合单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术已成为筛查基因突变的基本方法[1-3],特别是以硝酸银染色显示结果的非同位素PCR-SSCP技术受到国内科研工作者的喜爱[4,5].银染色使凝胶中的DNA条带肉眼可见,因此银染凝胶片是重要的原始资料,常用吸水纸[4]将凝胶制成干胶片后保存,拍照记录结果,但较为麻烦.近我们在采用银染色PCR-SSCP技术筛检胃癌组织p53基因突变时,直接应用微机对PAGE银染色图象结果进行处理和保存,简便易行,特介绍如下.
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SIgA分泌片分离、纯化研究
为了研究SIgA分泌片(Secretory component,SC)分离、纯化及鉴定方法,以SC存在游离和结合两种形式,本研究应用凝胶过滤和盐析法直接从初乳中分离纯化游离SC,并进行鉴定.分离纯化获得蛋白溶液12.4ml,蛋白含量0.85 mg/ml,免疫双扩仅与抗SC多克隆抗体(PcAb)反应,分子量约75 kD,免疫印迹实验与抗SC单克隆抗体(McAb)和PcAb特异反应,表明纯化蛋白为SC.该SC的分离纯化和鉴定处于不断完善之中,其方法的改进有利于获得更纯的SC,值得粘膜免疫研究者借鉴.
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琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测肠道菌群基因扩增产物的方法学比较研究
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis, AGE))和聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖凝胶电泳的有效分离范围是0.1～2kb,聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5～500 bp)效果好,分辨力极高,测序的聚丙烯酰胺凝胶可分离相差lbp的DNA片段.
