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沉默LIMK1促进DADS抑制SW480细胞迁移与侵袭
目的 探讨LIMK1沉默对DADS抑制SW480细胞迁移与侵袭的影响.方法 RNA干扰技术建立稳定LIMK1-miRNA/SW480细胞株;免疫组化和Western blot检测DADS对沉默LIMK1结肠癌SW480细胞LIMK1和磷酸化LIMK1蛋白表达的影响.划痕实验和侵袭实验检测LIMK1 RNA沉默与DADS对SW480细胞迁移与侵袭的影响.结果 RT-PCR与Western blot显示,LIMK1-miR/SW480细胞LIMK1mNRA与蛋白表达明显下调,表明成功构建稳定沉默LIMK1基因的SW480细胞株.免疫组化和Western blot显示,45 mg· L-1 DADS处理和沉默LIMK1组较未转染组与空载体组SW480细胞LIMK1蛋白和磷酸化LIMK1明显下调 (P<0.05).划痕实验和侵袭实验发现,沉默LIMK1或DADS处理SW480细胞的迁移与侵袭能力较未转染组与空载体组明显抑制 (P<0.05).而DADS处理沉默组抑制SW480细胞迁移和侵袭能力更为明显 (P<0.05).结论 沉默LIMK1基因可抑制SW480细胞迁移与侵袭,增强DADS抑制SW480细胞迁移与侵袭作用.
关键词： 二烯丙基二硫 结肠癌SW480细胞 LIMK1 RNA干扰 迁移与侵袭 -
二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响
目的 研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响.方法 流式细胞术检测细胞周期改变;Northern blot、Western blot与免疫细胞化学检测DADS 处理MGC803细胞的Chk1与Chk2表达.结果 流式细胞术分析显示,30 mg·L-1 DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞在G2/M期 (P<0.05);Northern blot检测表明,DADS不同时间作用MGC803细胞后,Chk1与Chk2 mRNA表达与未处理组差异无显著性 (P>0.05);免疫细胞化学发现Chk1与Chk2表达与未处理组无明显改变(P>0.05);Western blot DADS在不同时间对MGC803细胞Chk1 与Chk2总蛋白表达无改变(P>0.05),而磷酸化的Chk1表达呈时间依赖性增加(P<0.05),但磷酸化的Chk2无明显改变(P>0.05).结论 DADS阻滞MGC803细胞G2/M期与磷酸化Chk1有关.
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二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞分化的差异蛋白质分析
目的 研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞分化过程中蛋白质的差异表达.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离DADS处理前后人胃癌MGC803细胞总蛋白,凝胶经过银染后用PDQuest软件进行分析,差异蛋白质点经胶内原位酶解,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定肽质量指纹图(PMF),将所得的数据进行生物信息学处理.结果 DADS处理MGC803细胞前后的总蛋白质的双向电泳银染图谱,经扫描成像及PDQuest软件分析,对照组与处理组蛋白质点与平均匹配率分别为(576±14)个和(583±4)个与76%和70%,421个匹配,200个未被匹配.经相关数据库查询,在初步鉴定的差异蛋白质点中,发现24个与细胞分化、肿瘤转移、细胞凋亡、细胞周期、细胞免疫及代谢等相关的蛋白质,如gastric mucin、nM23、CDC2、uPAR、LIMK、RORα、MHC DR-beta-1 chain、TCR等,这些蛋白质可能在胃癌的发生发展中起着潜在的作用.结论 DADS可能通过多种途径诱导MGC803细胞分化.蛋白质组差异表达的初步分析为进一步研究胃癌分化的相关蛋白质及标记物奠定一定基础.
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二烯丙基二硫抑制人胃癌SGC7901细胞侵袭及相关机制
目的 探讨二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌SGC7901细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制.方法 划痕愈合和侵袭实验检测DADS对SGC7901细胞迁移与侵袭能力的影响;RT-PCR、Western blot检测DADS作用SGC7901细胞后MMP-9和TIMP-3表达.结果 划痕实验结果显示,15 mg* L-1 DADS处理SGC7901细胞12 h、24 h后,较未处理组划痕距离明显增加(P<0.05),表明DADS可抑制SGC7901细胞迁移.Transwell实验结果显示,15 mg*L-1 DADS处理SGC7901细胞12 h与24 h后,穿膜细胞数分别为(31.9±0.46)、(23.5±0.52)个,较未处理组的(51.6±0.68)、(41.3±0.72)个明显减少(P<0.05),表明DADS可抑制SGC7901细胞侵袭能力.RT-PCR结果显示,15 mg* L-1 DADS处理SGC7901细胞12 h与24 h后,MMP-9 mRNA表达明显下调(P<0.05),而TIMP-3 mRNA表达明显上调(P<0.05).Western blot结果显示,15 mg*L-1 DADS处理SGC7901细胞12 h、24 h、48 h后,MMP-9蛋白表达明显降低(P<0.05),而TIMP-3蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 DADS可抑制人胃癌SGC7901细胞迁移与侵袭能力,其机制可能与下调MMP-9和上调TIMP-3有关.
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二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭
目的 研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞迁移侵袭及LIMK1表达的影响.方法 MTT、划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对MGC803细胞增殖、迁移与侵袭能力的作用;RT-PCR、Western blot与免疫细胞化学检测LIMK1表达.结果 MTT显示,30 mg· L-1 DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后,增殖抑制率分别为31.8%、66.1%、83.6%、89.2%,呈明显的时间依赖关系(P<0.05).划痕实验显示,10、20、30、40、50 mg·L-1 DADS分别作用 MGC803 细胞,划痕愈合明显慢于对照组,呈剂量依赖关系(P<0.05).侵袭实验显示,10、20、30、40、50 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞24 h后,穿过基质胶的细胞数分别为(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)个,较对照组(39.5±2.99)个数明显减少,呈剂量依赖性(P<0.05).RT-PCR显示,30 mg·L-1 DADS与MGC803细胞作用48 h后,LIMIK1 mRNA明显下调(P<0.05).Western blot与免疫细胞化学检测显示,30 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞6、12、24、48 h后,LIMK1蛋白的表达水平呈时间依赖性下降(P<0.05).结论 DADS可抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力,其机制可能与下调LIMK1有关.
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二烯丙基二硫上调p21、STAT1和CAMTA1诱导人白血病HL-60细胞分化
目的 应用抑制性消减杂交(SSH)研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病HL-60细胞分化的分子机制.方法 在前期工作中,我们成功地构建了具有高消减效率的DADS诱导白血病分化的cDNA文库,本实验通过挑取文库中的30个克隆制备质粒并酶切分析、测序和同源性检索.结果 18个克隆均具有100～600 bp左右的插入片段,测序分析发现10个差异表达基因,分别与细胞周期、信号转导、代谢、RNA结合等有关.RT-PCR验证其中上调的3个基因:p21、STAT1和CAMTA1,结果与SSH相符.结论 p21、STAT1和CAMTA1表达上调与DADS诱导白血病分化密切相关.
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DADS诱导人胃癌细胞周期阻滞相关基因的差异表达
目的 研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS) 诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞相关基因表达的变化.方法 MTT法、流式细胞术分别分析DADS对MGC803细胞的抑制作用与细胞周期分布的影响;功能基因芯片检测周期相关差异表达基因;Western blot、RT-PCR验证周期相关基因的表达.结果 MTT法、流式细胞术证明DADS可明显抑制MGC803细胞增殖并诱导G2/M期阻滞.基因芯片结果显示,30 mg·L-1DADS作用MGC803细胞4 h后,表达上调的基因有CDC45L、CDK5R1、p21、CUL4A、GADD45α、RAD17、TP53,下调的基因是ANAPC5、ATR、BRCA1、CCNA2、CCNB2、CCNE1、CCNE2、CDC16、CDC6、CDK5RAP1、GTF2H1、MCM5、RAD9A、RGC32.RT-PCR显示30 mg·L-1 DADS处理MGC803细胞4、8、12 h后,p21、GADD45α时间依赖性的表达增强(P<0.05),CyclinB1呈时间依赖性的表达降低(P<0.05).TP53在4、8、12 h后与对照组比较表达明显增强(P<0.05).Western blot结果表明,30 mg·L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24 h后,p53、GADD45α、p21蛋白表达上调,CyclinB1蛋白表达下调(P<0.01).结论 DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞是由多基因协同作用的结果,可能通过两种途径共同调节完成的.
关键词： 二烯丙基二硫 人胃癌MGC803细胞 周期阻滞 基因芯片 -
二烯丙基二硫抑制SW480细胞系生长增殖的相关蛋白质分子鉴定
目的 应用前期比较蛋白质组学筛出的部分差异表达蛋白质分子,进行进一步分析与鉴定.方法 采用MTT法,观察不同浓度和作用时间DADS对SW480细胞的生长抑制作用;使用流式细胞仪,分析50 mg·L-1 DADS对SW480细胞的周期分布的影响;运用Western blot方法,分析50 mg·L-1 DADS处理SW480细胞系后泛肽和FKBP的表达水平.结果 MTT法显示,DADS能明显抑制SW480细胞系生长增殖,呈浓度和时间依赖性,SW480细胞系经不同浓度DADS处理后,生长增殖速度明显减慢.流式细胞仪分析结果显示,50 mg·L-1 DADS将SW480细胞阻滞在G2/M期.应用Western blot分析结果显示,50 mg·L-1 DADS处理SW480细胞48 h,泛肽表达较对照组增强,而FKBP的表达明显降低,差异均为2倍以上.结果 DADS抑制SW480细胞系生长增殖,可能与泛肽表达上调,FKBP表达下调,将细胞阻滞在G2/M期有关.
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DADS诱导人结肠癌细胞双向电泳图谱的差异分析
目的近年来,蛋白质组学技术已广泛应用于肿瘤研究领域,但对结肠癌的研究较少.该实验旨在研究二烯丙基二硫(DADS)体外诱导人结肠癌SW480细胞蛋白质组差异表达的相关分子机制.方法采用蛋白质组学相关技术,如二维电泳、图像分析、质谱技术等方法,获得DADS体外培养的人结肠癌SW480细胞蛋白质组的肽质量指纹图,将所得的数据进行生物信息学处理.结果在相同条件下,对DADS处理前后SW480细胞两种样品的总蛋白质进行双向电泳,经PDQuest软件分析,结果显示,其中167个匹配的蛋白质点存在表达量上的差异,与对照组相比,处理组蛋白质表达量下调的有69个,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对其中8个表达明显下调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得相应的肽质量指纹图谱(PMF),通过数据库搜索,初步确定这8个蛋白质分别是:细胞角蛋白19(Cytokeratin-19)、肌动蛋白解聚因子(Actin-depolymerizing factor)、V-1蛋白(V-1 protein)、果糖二磷酸醛缩酶(Fructose bisphosphate aldolase,FBA)、FK506结合蛋白(FK506-binding protein,FKBP)、成帽蛋白(Capping protein)、硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase)和敏感性转化蛋白(Transformation-sensitive protein).结论这些差异蛋白质涉及细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡及细胞分裂增殖等众多事件,从而说明,DADS可能具有抑制结肠癌细胞生长,阻滞细胞周期,诱导细胞分化及凋亡的作用.
关键词： 二烯丙基二硫 结肠癌 双向凝胶电泳 MALDI-TOF-MS 蛋白质组学 -
DADS体内诱导人胃癌细胞分化作用中组蛋白乙酰化的变化
目的观察二烯丙基二硫(DADS)在体内诱导胃癌细胞分化的作用及对人胃癌细胞移植瘤组蛋白乙酰化的影响.方法裸鼠皮下注入人胃癌细胞MGC803建立人胃癌异种移植模型,采用光学显微镜观察移植瘤细胞形态变化,流式细胞光度术和Western blot分析DADS对MGC803细胞移植瘤细胞周期分布的影响及瘤组织中p21WAF1蛋白、组蛋白H3、H4乙酰化的表达情况.结果腹腔注射DADS剂量为100、200 mg·kg-1时对移植瘤有明显生长抑制作用;光学显微镜显示经DADS处理后瘤细胞密度及异型性明显减小.流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将移植瘤细胞阻滞在G2/M期.DADS浓度为100 mg·kg-1和200 mg·kg-1作用瘤细胞后,与对照组相比分别可使G2/M期细胞增加2.22和3.37倍.Western blot分析表明在G2/M期阻滞同时有组蛋白H3乙酰化表达增加,但组蛋白H4乙酰化表达水平不受DADS作用的影响;瘤组织中的p21WAF1蛋白表达量也随DADS浓度升高而上升.结论 DADS对胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长有明显抑制和诱导分化作用,这种抑制可能与其阻滞移植瘤细胞周期、上调瘤细胞组蛋白乙酰化及p21WAF1蛋白水平有关.
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二烯丙基二硫对人结肠癌HT-29细胞G1期的阻滞作用
目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人结肠癌HT-29 细胞G1期的阻滞作用及分子机制.方法采用MTT、细胞计数法、流式细胞术和免疫细胞化学方法分析DADS对体外培养的HT-29 细胞增殖抑制作用、细胞周期分布及细胞周期相关蛋白表达的影响.结果 MTT 法显示,60、120 μmol·L-1 DADS 作用HT-29 细胞24 h 后,生长抑制率分别达23.1 %、45.6%.细胞计数法表明,常规培养HT-29 细胞群体倍增时间为22.58 h ,60 μmol·L-1 DADS 作用HT-29 细胞后,其细胞群体倍增时间延长到31.20 h.流式细胞仪分析结果显示,60 μmol·L-1 DADS 阻滞HT-29 细胞在G1 期,与对照组相比,可使G1期细胞增加约2倍,而120 μmol·L-1 DADS 显著地将细胞阻滞在G2/M期.免疫细胞化学分析表明在G1期阻滞同时有p21Waf1蛋白表达上调,Cyclin E、C-myc 蛋白表达下降.结论低剂量DADS对HT-29 细胞的抑制增殖作用可能与G1 期阻滞有关,DADS 对HT-29 细胞G1期阻滞的分子机制可能与调节p21Waf1、 Cyclin E、C-myc表达相关.
关键词： 二烯丙基二硫 结肠癌 HT-29细胞 细胞周期 Cyclin E蛋白 -
二烯丙基二硫诱导人白血病HL-60细胞分化差异表达cDNA文库的构建
目的应用抑制性消减杂交技术构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide ,DADS)诱导人白血病细胞分化的消减杂交cDNA文库,以期克隆DADS诱导人白血病HL-60细胞分化的相关基因.方法用DADS诱导人白血病HL-60细胞分化,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与两种不同的接头连接,再与未处理的白血病细胞cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR产物与pGEM-T线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定.结果成功地构建了具有高消减效率的DADS诱导白血病细胞分化的cDNA文库,随机挑取消200个克隆制备质粒并酶切分析,其中84.5%的克隆均具有100～600 bp左右的插入片段,说明每一克隆中均含有特异性的目的片段,从而为大批量筛选、克隆DADS诱导人白血病细胞分化的相关未知新基因奠定了基础.结论 DADS能诱导人白血病HL-60细胞分化,并引起相关的基因发生改变,而抑制性消减杂交技术能有效地分离差异表达的基因.
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二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究
目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞凋亡和对细胞周期的影响.方法采用MTT法、丫啶橙染色、流式细胞仪等方法检测DADS对MGC803的增殖抑制,诱导凋亡以及细胞周期分布的影响.结果 MTT法显示,DADS对MGC803细胞有明显的抑制增殖作用,20、30、40 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞72 h后,生长抑制率分别达25.7%、58.6%、69%;经30 mg·L-1 DA DS作用MGC803细胞48 h后,用丫啶橙染色法观察到不同阶段的凋亡细胞形态学改变;流式细胞仪分析结果显示, DADS对MGC803细胞有明显的G2/M期阻滞作用, 30 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞24 h,与对照组相比,可使G2/M期细胞增加到4倍多,且DADS呈时间依赖性诱导MGC803细胞凋亡,30 mg·L-1 DADS作用MGC803细胞48 h,凋亡率从对照组的3.5%升高到39.5%.结论 DADS引起MGC803细胞G2/M期阻滞并诱导凋亡可能是其抗肿瘤的机制之一.
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二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞差异表达基因cDNA文库的建立
目的建立二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌细胞MGC803细胞差异表达基因的cDNA文库.方法采用抑制消减杂交技术,筛选DADS处理人胃癌细胞MGC803细胞后差异表达的相关基因.经过抑制消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增,获得富集的差异表达的cDNA文库,PCR检测插入片断的阳性克隆.结果建立DADS诱导人胃癌MGC803细胞差异表达基因的cDNA文库,并从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选个阳性克隆,发现插入片断为100～600bp.结论应用抑制消减杂交方法可有效筛选DADS处理人胃癌细胞MGC803细胞后差异表达的相关基因,其消减cDNA文库的建立,为进一步寻找胃癌发生相关新基因,深入揭示DADS对肿瘤细胞的作用机制提供了新的重要线索.
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二烯丙基二硫诱导人白血病细胞系HL-60细胞分化的实验研究
目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞增殖抑制及诱导分化作用的影响.方法采用MTT法检测对细胞增殖的影响,通过观察细胞形态、硝基四氮唑蓝(NBT)还原反应、流式细胞仪测定鉴定细胞分化.结果 HL-60细胞经DADS处理后,细胞增殖受抑,呈剂量效应关系.0.625～1.25 mg*L-1时NBT还原反应增强(P<0.01或<0.05),流式细胞术显示可诱导表面分化抗原CD11b表达升高及细胞周期阻滞于G1期.结论小剂量DADS长时间作用对HL-60细胞具有诱导分化作用,其作用相当于全反式维甲酸,对于白血病的治疗具有潜在的应用价值.
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DADS诱导人胃癌细胞分化作用中ERK/AP-1通路的改变
目的探讨ERK/AP-1通路在二烯丙基二硫 (DADS)诱导人胃癌细胞分化中的作用,阐明DADS诱导人胃癌细胞分化的分子机制.方法采用免疫细胞化学、图像分析及Western Blot等方法,观察DADS作用于体外培养的人胃癌MGC803细胞前后AP-1成员c-fos与c-jun表达的改变以及ERK MAPK激酶的变化.结果免疫细胞化学及图像分析结果显示,对照组c-fos、c-jun表达呈强阳性,而处理组呈阴性或弱阳性,阳性率明显降低,处理组光密度值较对照组明显低 (P<0.05).Western Blot结果显示:从20、25、30到35 mg*L-1 DADS处理癌细胞,DADS呈浓度依赖性抑制人胃癌细胞中ERK的活化(P<0.05);并且DADS+MEK抑制剂PD98059能完全阻断ERK活化(P<0.05);时间效应上,在DADS刺激后15～30 min抑制作用强,2 h左右恢复至接近正常(P<0.05).结论 ERK/AP-1通路抑制是DADS诱导人胃癌细胞分化的重要分子机制.
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二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G2/M期的阻滞作用
目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期的阻滞作用及分子机制.方法体外培养MGC803细胞,采用MTT比色实验、细胞计数法,流式细胞光度术和Western blot分析DADS对MGC803细胞的抑制增殖作用,细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白的表达.结果 MTT法显示,20 mg*L-1 DADS、30 mg*L-1 DADS作用MGC803细胞72 h后,生长抑制率分别达25.7%、58.6%.细胞计数法表明常规培养MGC803细胞群体倍增时间为29.92 h,30 mg*L-1 DADS作用MGC803细胞后,其细胞群体倍增时间延长到55.58 h.流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将MGC803细胞阻滞在G2/M期.30 mg*L-1 DADS作用MGC803细胞36 h,与对照组相比,可使G2/M期细胞增加到4倍多.Western blot分析表明在G2/M期阻滞同时有Cdc25C蛋白表达下降,但CDK1蛋白表达不受DADS作用的影响.结论 DADS对MGC803细胞的抑制增殖作用与G2/M期阻滞有关,DADS对MGC803细胞G2/M期阻滞的分子机制可能与降低Cdc25C蛋白水平有关.
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二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞G2/M期阻滞中p-CDK1、cyclin B1和p21WAF1蛋白的表达
二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)是大蒜中提取的一种低分子量的脂溶性成分,也是大蒜中的主要有效成分,对结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌和白血病等多种肿瘤均有明显的抑制作用.本实验室以前研究表明[1],DADS对人类白血病细胞HL60有诱导分化作用,对体外[2]和体内[3]的人胃癌MGC803细胞均有生长抑制作用、G2/M期阻滞作用.对体内的人胃癌细胞有诱导分化作用[3],对体外的人胃癌细胞有诱导凋亡作用[4].
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小剂量二烯丙基二硫联合全反式维甲酸对HL-60细胞的生长抑制和诱导分化作用研究
二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)具有抑制肿瘤细胞增殖,调控细胞周期依赖素激酶、信号转导,诱导肿瘤细胞分化、凋亡及影响癌基因与抑癌基因表达的作用.小剂量DADS(1.25 mg·L-1)可以抑制JAK1/STAT3信号通路,将HL-60细胞阻滞在G0/G1期,诱导HL-60细胞向粒系分化,其作用与全反式维甲酸(ATRA)相当[1～3].本实验将探讨小剂量DADS与ATRA联合应用对HL-60细胞的生长抑制及诱导分化效应.
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二烯丙基二硫对人白血病HL-60细胞体外抑制机制的初步研究
大蒜及其烯丙基硫化物抗肿瘤活性的研究是抗癌药物研究的一个新领域.二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS,C6H10S2)是用来研究大蒜抗癌疗效适当的一种油溶性烯丙基硫化物[1].目前,有关DADS抑制人肿瘤细胞的报道尚少,本研究拟在探讨DADS对体外培养的人白血病HL-60细胞的抑制作用及其机制,为进一步探讨DADS的抗肿瘤作用提供理论基础.
