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纳米雄黄混悬液诱导Siha细胞凋亡及对HPV16E6/E7表达的影响
目的:探讨纳米雄黄混悬液对人宫颈癌Siha细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用及其对HPV16E6和E7致瘤基因的影响.方法:采用微射流法制备纳米雄黄混悬液,应用不同质量浓度(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)的纳米雄黄混悬液作用于Siha细胞不同时间(12,24,48,72 h),光镜和透射电镜观察实验组(不同质量浓度的纳米雄黄混悬液处理组)和对照组(不加药物的细胞)细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA Ladder形成;MTT比色法测定细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期改变;RT-PCR方法检测HPV16E6和E7的表达.结果:纳米雄黄混悬液25～50 mg·L-1处理Siha细胞48,72 h后,细胞存活率降低,凋亡增加,作用呈时间-剂量依赖关系.电镜显示细胞呈典型的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA Ladder形成;流式细胞术检测证实细胞凋亡率与纳米雄黄混悬液作用浓度呈明显相关,与对照组相比,差异有极显著意义(P<0.01),且细胞呈G0-G1期阻滞.RT-PCR检测显示随着纳米雄黄混悬液作用浓度的增加,HPV16E6和E7的表达不同程度地受到抑制.结论:纳米雄黄混悬液对于Siha细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用,其机制可能与其抑制HPV16E6和E7致瘤基因的表达有关.
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子宫颈鳞状细胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表达及病理学分析
目的 探讨子宫颈鳞状细胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表达及病理学情况.方法 分析2013年2月~2015年4月浙江省湖州市德清县中医院病理科收集的手术切除宫颈新鲜标本90例的病理学情况,依据宫颈病变分级标准进行分组:正常组(20例)、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ组(20例)、CINⅡ组(15例)、CINⅢ组(15例)、宫颈鳞癌组(20例).采用免疫组化法检测Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表达情况;观察并比较Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈不同病变、临床分期、病理情况的宫颈组织中的表达;观察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白与宫颈鳞癌病理分期的相关性.结果 鳞癌组Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于正常组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组,差异均有统计学意义(均P<0.05).Ⅱa~Ⅱb期宫颈鳞癌组织中Au-rora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于Ⅰa~Ⅰb期宫颈鳞癌组织,低分化宫颈鳞癌组织中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于高分化、中分化宫颈鳞癌组织,差异均有统计学意义(均P<0.05).Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均与宫颈鳞癌病理分期呈正相关(r=0.305、0.306、0.304,均P<0.05).结论 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈癌、癌前病变中具有重要的意义,各蛋白联合检测可以为宫颈癌诊断及预后评价提供可靠的理论依据.
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HPV16E7基因沉默对宫颈癌细胞系CaSki细胞增殖的影响
[目的]探讨脂质体转染HPV16E7 siRNA对人宫颈癌CaSki细胞增殖的影响.[方法]人工合成抑制HPV16E7基因的siRNA片段,通过脂质体转染到CaSki细胞内,显微镜下观察其形态学变化；流式细胞术检测各组细胞周期变化；RT-PCR检测HPV16E7 mRNA的表达;Western blot检测HPV16E7蛋白表达.[结果]转染siRNA后的CaSki细胞,细胞增殖受到显著抑制,HPV16E7 mRNA表达显著下降,HPV16E7蛋白水平显著下降.[结论]应用RNA干扰靶向抑制HPV16E7基因可以显著抑制CaSki细胞增殖.
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HPV16 E7、RB 和 MCM7蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及意义
目的：探讨HPV16型感染对RB和MCM7蛋白表达调控的影响在乳腺癌发生机制中的作用及意义。方法采用免疫组化EnVision法检测30例正常乳腺组织、30例乳腺腺病、30例乳腺不典型导管上皮增生（ADH）和68例浸润性导管癌（IDC）组织中HPV16E7、RB和MCM7蛋白的表达。结果 IDC中HPV16E7蛋白阳性表达率高于正常乳腺组织、乳腺腺病和ADH，差异有统计学意义（ P＜0.05）。在乳腺腺病、ADH和IDC 中HPV16E7阳性表达与RB蛋白表达之间呈负相关（r＝-0.460，P＜0.02；r＝-0.680，P＜0.01；r＝-0.832，P＜0.000），而与MCM7蛋白表达呈正相关（r＝0.504，P＜0.01；r＝0.710，P＜0.01；r＝0.774，P＜0.000）。 HPV16E7、RB和MCM7蛋白的阳性表达与IDC组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关（ P＜0.05），而与患者年龄和肿块大径无关（P＞0.05）。结论高危型HPV16感染通过其E7对RB和MCM7蛋白表达调控的影响可能在乳腺癌的发生、发展进程中起到重要的作用。
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宫颈癌前病变中△NP63与HPV16 E7表达的研究
目的:研究宫颈上皮内瘤变中△NP63和HPV16 E7 mRNA的表达情况,寻找用于临床评估CIN病变进展趋势的生物学标志物.方法:收集临床71例薄层液基细胞标本,采用SP免疫组化法检测细胞中△NP63的蛋白表达,RT-PCR法检测残留标本中HPV16 E7的mRNA转录情况.结果:1.△NP63定位于异常鳞状上皮细胞和腺细胞,在CIN中表达高于炎症组(P＜0.05);2.HPV16 E7在CIN中表达明显高于炎症组(P＜0.05);3.CIN中△NP63与HPV16 E7的检测结果具有较好的一致性.结论:△NP63可作为CIN的生物学标志物辅助细胞学筛查;△NP63可间接反映HPV16 E7的转录情况,有利于临床评估高危型病毒HPV16的致瘤能力.
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HPV16E7基因的原核克隆及表达
目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.
关键词： HPV16E7 原核表达 SDS-PAGE Western blot -
人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建
目的构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16E7)的逆 转录病毒载体.方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段,并用酶切、连接 等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上,然后再用酶切、测序进行鉴定.通过Ge nbank 的数据库分析软件对HPV16E7进行同源性分析.结果经酶切分析、测序证明,从HPV16 cDNA克隆的300 bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组,HPV 16E7基因片段与数据库中的原HPV16 cDNA的E7有高度的同源性.结论构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础.
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两株宫颈癌细胞株中HPV16E6/E7蛋白的表达
目的:探索及检测宫颈癌细胞株Caski、SiHa细胞内HPV16(16型人乳头瘤病毒)E6/E7蛋白含量,筛选宫颈癌基因治疗研究的合适细胞株.方法:用间接免疫荧光染色及流式细胞术检测Caski、SiHa宫颈癌细胞株中HPV16E6、HPV16E7蛋白含量(荧光强度值).结果:Caski细胞中HPV16E6、HPV16E7蛋白含量分别为:20.72±6.35、56.80±4.30;SiHa细胞中HPV16E6、E7蛋白含量分别为:1.77±0.75、49.27±8.06.2细胞株间HPV16E7蛋白表达量无明显差异(P＞0.05).结论:Caski、SiHa宫颈癌细胞株中HPV16E6、E7蛋白的表达是不平行的.Caski细胞适用于以HPV16E6,HPV16E7蛋白为观察对象的研究,SiHa细胞可用于HPV16E7蛋白的研究,但不适宜用于以HPV16E6蛋白为观察对象的研究.
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siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究
目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.
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载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达
目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.
关键词： HPV16E7 小干扰RNA表达载体 宫颈癌 CasKi细胞 RNA干扰 -
人乳头瘤病毒16型E7疫苗的研究进展
自从1977年Zur Hauisen氏提出人乳头瘤病毒(Huamn Papillomavirus,HPV)是妇女宫颈癌病因的假说以来,几十年来对HPV的基因及蛋自等结构和功能的研究表明,HPV16型是引发官颈癌等多种肿瘤的主要病毒.
