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Wnt3a对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究
目的 探讨Wnt3a对人骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法 采用成骨诱导培养基联合Wnt3a蛋白(10 ng/mL)诱导人骨髓间充质干细胞分化,通过镜下形态学和茜素红染色评价成骨分化水平.采用实时PCR及Western blotting法检测Wnt3a干预下骨髓间充质干细胞分化过程中第1、5、10、15和20天RUNX2、β-catenin及BSP的表达情况.结果 Wnt3a干预下充质干细胞向成骨细胞分化程度明显高于对照组.Wnt3a能提高RUNX2、β-catenin及BSP mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05),表达于干预第10天时达到高峰,随后呈轻度下降趋势.结论 Wnt3a通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控人骨髓间充质干细胞成骨分化.
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人骨髓间充质干细胞L型钙离子通道的研究
目的:研究分离培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)膜表面L型钙离子通道的表达.方法:采用密度梯度离心、贴壁筛选及单克隆培养法获得hMSCs,利用流式细胞分析、免疫荧光法鉴定,应用全细胞膜片钳技术记录hMSCs膜表面L钙离子通道的变化.结果:体外分离、培养出高度同源性的具有独特细胞免疫学表型hMSCs;40%的hMSCs表达钙离子电流,峰值电流(ICa-Peak)在+20～+30 mV为(102.67±19.06)pA,此电流可被Cd2+(20 μmol/L)阻断.结论:在未分化的hMSCs上L型钙离子通道表达较少,说明L型钙离子通道表达的增多可能是hMSCs定向分化的条件之一,调节hMSCs膜表面L型钙离子通道的表达将有助于促进其定向分化.
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FN和Col对VEGF诱导hMSCs体外内皮分化的影响
目的:探讨细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)FN(Fibronectin)和Col(I type Collagen)对VEGF诱导人骨髓间充质干细胞hMSCs体外内皮分化的影响.方法:采用生长因子VEGF165与纤维连接蛋白FN或Ⅰ型胶原Col,联合对hMSCs进行内皮诱导分化.通过免疫细胞化学和流式细胞分析对分化后细胞群检测.结果:分化后细胞群形态没有明显改变;FN和Col可引起内皮分化早期标志KDR和CD34增强,FN效应较为明显;两种基质蛋白也引起β1整合素表达增强.结论:hMSCs诱导后具备内皮分化趋势;ECM-整合素受体和VEGF165相互作用调控hMSCs分化;β1整合素的改变参与hMSCs的内皮分化.
关键词： 人骨髓间充质干细胞 血管内皮细胞生长因子 纤维连接蛋白 Ⅰ型胶原 β1整合素 -
绿色荧光蛋白基因转染人骨髓间充质干细胞体外成脂肪诱导分化的研究
目的 以逆病毒为载体将绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染人骨髓间充质干细胞(hMSC),研究对其成脂肪诱导分化的影响.方法 以逆病毒为载体将EGFP基因转染hMSC,流式细胞仪检测转染后hMSC的表面标记,并对转染EGFP的hMSC进行成脂肪诱导分化培养.结果 转EGFP基因的hMSC/EGFP细胞与未转基因的hMSC在细胞形态及生长特点上无差异.转基因的hMSC细胞仍高表达CD29、CD44、CD105 抗原,传代培养后可诱导形成脂肪细胞.结论 转染EGFP基因对hMSC在体外成脂肪诱导能力无明显影响,EGF可以作为研究hMSC多向分化潜能机制的一个有效示踪工具.
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人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构
目的:培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据.方法:体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs.用5-氮杂胞苷(5-Aza,10 μmol·L-1)体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构.结果:流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs.hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin.透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、租面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接.结论:体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特件的心肌样细胞.
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低剂量辐射诱导人骨髓间充质干细胞分子在P38MAPK通路的信号机制
目的:探讨低剂量辐射(LDR)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)的增殖作用及相关信号传导机制.方法:将培养的人骨髓MSCs及K562细胞分别分成3组:对照组、照射组和SB203580组.3组照射剂量均为75 mGy,观察照射后24 h总P38MAPK、P53、P21表达水平及增殖指数(P1)的变化,同时观察K562及MSCs细胞75 mGy照射后即刻和4、12及24 h磷酸化P38MAPK(p-P38MAPK)表达.SB203580组根据培养液量将SB203580调节成5μmol·L-1终浓度,于实验前1 h加入.结果:人骨髓MSCs细胞p-P38MAPK表达以75 mGy照射后12 h达高峰;照射后24-h P53和P21蛋白表达水平下降.PI增高,但总P38MAPK无变化,SB203580抑制P38MAPK激酶活性后,P53、P21表达上调,PI下降; K562细胞p-P38MAPK、P53、P21、总P38MAPK表达水平及PI在75mGy照射后24 h均无任何改变,加SB203580后Pl略有下降,P21蛋白表达略有上升.结论:LDR可诱导人骨髓MSCs增殖兴奋性反应,这种反应是通过P38MAPK信号通路介导的,且与P21下降有关,这种P21下降存在P53依赖性的.
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体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化
目的:研究在体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向心肌细胞(CM)的分化.方法:体外分离培养扩增hMSCs,进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型CD34、CD44和CD45,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组;同时原代培养SD乳鼠的CM以模拟体外心肌微环境.选用生长良好、纯度达到95%的第5代hMSCs,与乳鼠原代培养的CM共培养,并进行心肌特异性标志cTnI的免疫组化鉴定.结果:体外分离纯化培养扩增出的hMSCs,不表达CD34及CD45,高表达CD44,其CD44阳性率平均为(93.26±2.48)%,与平行对照组[(3.42±1.09)%]比较差异有显著性(P＜0.01).hMSCs与CM共培养后,其形态逐渐向CM形态过渡,并表达心肌特异性抗体cTnI.结论:hMSCs在体外模拟的心肌微环境中可分化为CM,干细胞的分化具有环境依赖性.
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尿酸影响人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中BMP-2表达
目的:探讨在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化过程中,不同浓度尿酸(UA)对骨形态形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响.方法:以全骨髓贴壁培养法分离hBMSCs,将生长状态良好的第3代hBMSCs分为5组,分别为空白对照组(加入完全培养基)和成骨诱导组(加入成骨诱导液及含0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L尿酸的完全培养基).连续干预诱导14d后,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,通过观察茜素红染色情况及检测碱性磷酸酶(ALP)活性进行成骨情况的检测.RT-PCR技术检测各组细胞BMP-2 mRNA的表达情况.结果:第3代hBMSCs大多为形态单一的长梭形,呈旋涡状生长;干预诱导后的细胞逐渐变成不规则的立方形,局部形成团块状结节,以含尿酸浓度为0.8 mmol/L的成骨诱导培养基为显著.连续干预14d后,空白对照组茜素红染色为阴性,而各成骨诱导组细胞茜素红染色结果为阳性,提示干预诱导后的细胞为成骨细胞.碱性磷酸酶活性随尿酸浓度的增加和干预时间的延长而增强(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,空白对照组无BMP-2 mRNA的表达.成骨诱导组随培养基中尿酸浓度的增加,BMP-2 mRNA表达逐渐增强,呈浓度依赖性(P＜0.05).结论:尿酸上调hBMSCs向成骨细胞分化过程中BMP-2 mRNA的表达.
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软骨细胞上清液诱导冻存复苏后人骨髓间充质干细胞的研究
目的:探讨人软骨细胞培养上清诱导冻存人骨髓充质干细胞向软骨细胞分化的可行性.方法:取进行全髋关节置换术老年患者的骨髓和软骨组织,利用密度梯度离心法、全骨髓培养法分别培养骨髓间充质干细胞,冻存备用.培养软骨细胞,观察细胞生长,收集软骨细胞培养上清.复苏冻存的人骨髓间充质干细胞,观察复苏后细胞生长状态.利用收集的软骨细胞培养上清对复苏间充质干细胞进行定向诱导,诱导培养2周,观察细胞外观表型变化,Ⅱ型胶原免疫组化检测诱导后人骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达.结果:密度梯度离心法与全骨髓培养法均可分离获得人骨髓间充质干细胞,原代生长前者优于后者.复苏细胞仍进行可传代,与正常生长骨髓间充质细胞无明显差异,均可传至第8代.软骨细胞培养上清诱导2周后,细胞形状向圆形,多角形转变,冻存骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性.结论:老年人骨髓间充质干细胞仍具有向软骨细胞转化的能力,冻存不影响其转化能力.
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氯化锂对人骨髓间充质干细胞迁移的影响
目的:探究氯化锂(Lithium chlorid,LiCl)对人骨髓间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)迁移的影响.方法:采用划痕试验、Transwell chamber等方法,在梯度浓度LiCl作用下,观察对hMSCs迁移效果的影响并进行分析.结果:①划痕试验显示hMSCs在梯度浓度LiCl作用下,细胞迁移距离逐渐减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).②Transwell chamber实验显示hMSCs在梯度浓度LiCl作用下,穿梭至小室下方的细胞逐渐减少,锂剂作用组迁移细胞数差异与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).结论:LiCl可抑制hMSCs的迁移且呈浓度依赖性.
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20S蛋白酶体β5亚单位基因沉默对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响
目的:应用基因沉默技术,观察下调20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖能力的影响及其潜在机制,寻求调节干细胞活力的关键靶点.方法:构建PSMB5-shRNA慢病毒载体感染早期hBMSCs,根据感染条件不同将细胞分为绿色荧光蛋白(GFP)对照组和shRNA组.倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫印迹检测PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性;BrdU掺入实验观察PSMB5基因沉默对早期hBMSCs增殖潜能的影响,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹检测细胞周期相关蛋白1(cyclin D1)及其激酶CDK4的表达变化.结果:慢病毒感染早期hBMSCs 72 h可见约95％以上细胞表达绿色荧光蛋白.shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平较GFP对照组分别降低93.31％±0.59％和56.83％±13.31％,且蛋白酶体活性较对照组降低37.47％±0.41％.此外,shRNA组BrdU阳性率26.14％±8.13％较对照组49.53％±11.18％显著降低,G1期细胞较GFP对照组增多,而S期和G2/M期细胞却较对照组减少,Cyclin D1和CDK4的表达水平分别下降54.55％±7.76％和63.26％±15.76％.结论:PSMB5基因沉默能够下调Cyclin D1和CDK4的表达,导致细胞G1/S转换停滞,影响hBMSCs增殖潜能.
关键词： 人骨髓间充质干细胞 20S蛋白酶体β5亚单位 基因沉默 增殖 -
体外冲击波通过三磷酸腺苷诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化
目的 研究体外冲击波是否通过三磷酸腺苷(ATP)激活P2X7受体,诱导入骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)向成骨细胞分化.方法 培养hMSCs细胞,检测冲击波是否引起其向外释放ATP;通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素表达和钙结节形成,判断骨化形成和钙质沉积;用实时定量PCR检测P2X7受体的mRNA表达;用ATP水解酶、P2X7受体的siRNA以及P2受体的抑制剂评估ATP释放和P2X7受体在冲击波诱导hMSCs成骨分化中的作用.结果 冲击波可引起细胞内ATP向外释放,冲击波和细胞外ATP能够诱导hM-SCs向成骨分化,采用ATP水解酶、P2X7受体的siRNA和抑制剂能够抑制冲击波引起的hMSCs成骨化作用.结论 冲击波通过引起细胞内ATP向外释放,激活P2X7受体传导信号通路,促进hMSCs向成骨细胞分化.本研究结果为冲击波促进骨折愈合和治疗骨不连疗法提供了理论依据.
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灌注型生物反应器中流速对人骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响
目的 探讨在灌注型生物反应器中,大段磷酸三钙(β-TCP)载体内不同流速对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 利用灌注型生物反应器对复合了hMSCs的大段β-TCP载体分别以3、6、9 mL/min的流速培养15 d,通过葡萄糖消耗量、细胞活力(MTT比色法)以及扫描电镜(SEM)观测细胞在载体内的增殖情况;以Real-time PCR检测成骨分化相关基因的表达.结果 各组葡萄糖的日消耗量随培养时间的延长而增加,初期9 mL/min组细胞增殖明显快于3、6 mL/min组(P＜0.001),但是灌注培养后期6 mL/min组的细胞增殖快于9、3 mL/min组(P＜0.05).灌注培养15 d后,6 mL/min组细胞活力显著高于3、9 mL/min组(P ＜0.001).SEM观察发现3组β-TCP载体内均形成复合细胞层,3 mL/min组细胞层呈疏松的簇状,6 mL/min组复合细胞层部分呈膜片状,9 mL/min组复合细胞层多数呈膜片状.在进行成骨诱导灌注培养15 d后,6、9 mL/min组碱性磷酸酶(ALP)及骨桥蛋白(OP)的表达均显著高于3 mL/min组(P＜0.01);3、6 mL/min组骨钙素(OC)的表达基本相同(P＞0.05),而9 mL/min组OC的表达量则显著高于另外两组(P ＜0.001).结论 在利用灌注型生物反应器对hMSCs进行灌注培养的早期,9 mL/min的流速有利于hMSCs的增殖,而晚期6 mL/min的流速有利于hMSCs的增殖.β-TCP载体内流体剪切应力(flow shear stress,FSS)随灌注流速的增加而增加,适当的FSS可促进细胞外基质的合成和分布,并增加成骨相关基因的表达.
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骨髓间充质干细胞的体外培养及定向诱导分化
目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养生长特性及其在体外定向分化为神经样细胞的条件.方法:采用Ficoll-paque(1.077g/ml)分离液密度梯度分离hMSCs,显微镜下观察其生长特性,测定生长曲线;取传至3～6代的hMSCs,用阿魏酸钠对其进行诱导培养,并以β-巯基乙醇作对照观察诱导培养后细胞的形态变化,分别在6h、1d、3d和7d通过免疫荧光细胞化学染色方法测定诱导后细胞的神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP),进行定量分析.结果:体外培养条件下hMSCs呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞倍增时间约为72h.阿魏酸钠诱导培养后6h可见细胞形态明显变化,NSE和GFAP表达阳性.24h后诱导细胞表现为典型的神经细胞样形态.第3天,NSE和GFAP表达高,分别为67±3.5%和39±1.8%.结论:人骨髓间充质干细胞在体外具有自我更新能力及多分化潜能;阿魏酸钠具有诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.
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人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的L型钙通道研究
目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)诱导分化为心肌样细胞的电生理特征,L型钙离子通道的电流强度. 方法:体外分离培养hMSCs,以5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞.分别以体外分离培养的原代搏动的SD乳鼠心肌细胞(CMS)和同代次的hMSCs为阳性对照和阴性对照,利用膜片钳技术观察诱导分化为心肌样细胞的电生理特征L型钙离子通道的电流强度. 结果:在20个心肌样细胞中,有6个细胞可记录到对硝苯地平敏感的内向钙电流,其大内向峰值电流(Ica-Peak)在0 mV为(112.60±8.26)pA;而hMSCs和乳鼠的CMs的Ica-Peak分别为(96.67±13.50)pA和(263.86±39.01)pA(n=6),将诱导的心肌样细胞与未经诱导的hMSCs的Ica -Peak进行比较,P<0.05具有统计学意义. 结论:hMSCs经5-氮胞苷诱导后,其L型钙离子通道的钙电流增加,在电生理特性上具有向CMS分化的潜能.
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利拉鲁肽在人骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞中的作用
目的 观察利拉鲁肽在入骨髓间充质干细胞( hBM-MSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)方向分化诱导中的作用.方法 采用高糖、尼克酰胺和利拉鲁肽3阶段诱导方案对hBM-MSCs进行定向诱导分化,倒置显微镜下观察诱导过程中细胞的形态学变化,双硫腙染色法鉴定诱导后细胞,Western印迹法检测细胞胰腺十二指肠同源盒基因1( PDX-1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、葡萄糖激酶(GK)、胰岛素的蛋白表达,ELISA检测细胞的胰岛素分泌水平.结果 添加10 nmol/L利拉鲁肽作用7d后诱导效率明显增加.诱导过程中细胞形态由长梭形逐渐变为圆形,并聚集生长,至诱导末出现大量圆形葡萄状聚集生长的胰岛样细胞团；双硫腙染色阳性细胞量、细胞PDX-1、GLUT2、GK、胰岛素的蛋白表达、细胞的基础和葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平均逐渐增加(均P＜0.05).结论 在体外,高糖、尼克酰胺联合利拉鲁肽可使hBM -MSCs定向诱导分化为IPCs.
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bFGF对hBMSCs增殖及成软骨能力影响的实验研究
目的 探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成软骨能力的影响,并确定适用于hBMSCs体外软骨构建的细胞代次.方法 获取hBMSCs,分别用DMEM和DMEM+bFGF培养基进行培养.两组细胞均传代至第4代,比较两组各代次hBMSCs的形态变化、细胞得率;取第3代细胞,用pellet法体外成软骨诱导培养3周,观察两组pellet大体观并进行Ⅱ型胶原染色.在上述实验基础上,取hBMSCs用DMEM+bFGF培养基进行培养,1:3传代培养至第8代,观察各代次细胞的形态变化;对各代次pellet体外成软骨诱导培养3周后,行大体观察并进行Ⅱ型胶原染色.结果 DMEM+bFGF培养体系下的细胞形态、 细胞得率及成软骨能力等方面均优于DMEM组.DMEM+bFGF培养体系下,按照1:3传代的细胞传至第6代仍能维持较好的细胞形态;第1~4代细胞均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,第5及后续代次的细胞成软骨能力较差.结论 bFGF可明显促进hBMSCs增殖,并可更好地维持hBMSCs的成软骨能力,在该培养体系下的第1~4代细胞适用于体外软骨构建.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 人骨髓间充质干细胞 细胞代次 软骨再生 -
高糖对人骨髓间充质干细胞成骨能力影响的体外研究
目的:体外模拟糖尿病病人高血糖状态,观察高糖对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成骨能力的影响.方法:将使用不同含糖量培养液体外培养的hMSCs分为5.5mmol/L生理糖浓度组、25 mmol/L高糖组、44 mmol/L高糖组.CCK-8试剂盒检测各组hMSCs的增殖速度;骨诱导7、14、21 d时分别观察高糖对hMSCs骨向分化相关基因骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Runx相关因子2(Runx-2)的表达,碱性磷酸酶(ALP)活性,钙沉积量的影响.结果:两个高糖组相对生理糖组,有抑制hMSCs的增殖能力(P<0.05),且抑制ALP活性及细胞外钙基质沉积,下调了骨向分化相关基因OCN、OPN、Runx-2表达水平(P<0.01),该抑制作用随糖的浓度升高而加强.结论:高糖显著抑制了hMSCs生物矿化过程,并以浓度依赖的方式降低hMSCs的增殖及成骨能力.
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人骨髓间充质干细胞脑内移植对大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用
目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)移植对缺氧缺血性脑损伤幼年大鼠脑功能影响及其在脑组织中的迁移、分化过程,探讨hMSCs移植对缺氧缺血性脑损伤的保护作用,为后续研究奠定基础.方法:大鼠随机分为hMSCs移植组(n=18)、移植对照组(n=18)、模型组(n=6)和假手术组(n=6).前3组均建立幼年Wistar大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,3 d后hMSCs移植组缓慢注射约5×105 个hMSCs至大鼠的左背侧海马,移植对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液,假手术组和模型组未移植.其中hMSCs移植组和移植对照组又随机分为5组,分别于移植后0 d、3 d、1周、2周(均n=3)和4周(n=6)处死.模型组与假手术组均于造模后31 d(即移植后4周)处死.大鼠处死前均行交替电刺激Y迷宫行为学实验,处死后取脑组织行H-E染色观察病理变化;hMSCs移植组和移植对照组大鼠同时还行免疫组化染色检测hMSCs在脑内的分布.结果:免疫组化结果显示hMSCs移植后1周主要沿脑室系统迁移,部分沿胼胝体向对侧迁移,移植后4周细胞沿脑室向周围实质迁移,广泛分布于脑组织.Y迷宫实验显示hMSCs移植组总错误次数(TE)明显少于移植对照组(5.00±2.82 vs 12.67±3.72),差异有统计学意义(P<0.05),提示hMSCs移植组大鼠空间记忆能力显著优于移植对照组.H-E染色结果显示hMSCs移植组大鼠脑组织损伤较移植对照组及模型组轻.结论:hMSCs脑内移植后可在大鼠中枢神经系统内存活并迁移,且hMSCs移植能在一定程度上促进损伤脑组织和脑功能的恢复,值得进一步研究.
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小分子抗菌肽KR-12-a5促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用
目的·验证抗菌肽KR-12的类似物KR-12-a5对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,HBMSCs)成骨分化功能的影响.方法·使用HBMSCs进行成骨分化相关实验,使用KR-12-a5作为成骨诱导条件下的附加刺激,并通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色实验、ALP定量实验、茜素红染色和洗脱定量分析以及成骨相关基因实时荧光定量PCR检测,验证KR-12-a5对HBMSCs成骨分化功能的影响.结果·随着KR-12-a5刺激浓度的增加,ALP和茜素红的染色强度也随之增加;在高浓度(50 μg/mL)的KR-12-a5刺激下显示了强的染色效果,定量测试也显示出类似的结果.在KR-12-a5刺激3d后,RUNX2的mRNA水平以药物浓度依赖的方式增加;在第7日,KR-12-a5处理组中的ALP、COL1A1、BSP和BMP2的表达水平表现出明显的变化;到第14日,OS、OCN和OPN水平显著增加.结论·KR-12-a5能以药物浓度依赖的方式促进HBMSCs的成骨分化功能.
