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姜黄素通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ预防大鼠大肠癌变的实验研究
目的 探讨姜黄素对二甲基肼(DMH)诱导的大鼠大肠癌发生的防治作用及其机制.方法 Wistar大鼠按随机数字表法分为模型组(20只)和姜黄素组(20只),同时设正常对照组(10只).应用DMH 20 mg/kg皮下注射诱导制备大鼠大肠癌模型.计算各组大鼠大肠肿瘤的诱癌率及抑制率;利用免疫组化和Western blot方法观察姜黄素对大鼠大肠黏膜组织过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPARγ)表达的影响.培养人结肠癌HT 29细胞株,分为正常对照组、姜黄素加2-氯-5-硝基-N-苯基苯酰胺(GW9662)干预组和姜黄素组.采用MTT法检测不同浓度姜黄素对人结肠癌HT 29细胞株生长的抑制作用,Western blot方法检测姜黄素对人结肠癌HT 29细胞株PPARγ表达的影响.结果 模型组大鼠诱癌率为80.00％(12/15),明显高于姜黄素组58.82％(10/17)(P＜0.05),姜黄素对DMH诱导的大鼠大肠癌的抑制率达26.46％.与正常对照组比较,模型组和姜黄素组PPARγ表达均明显增强(P＜0.01);与模型组同期比较,姜黄素组PPARγ表达亦明显增强(P＜0.05).MTT实验表明姜黄素可以抑制体外培养人结肠癌细胞株HT 29的增殖,且呈剂量和时间依赖性.与对照组比较,GW9662干预组及姜素组PPARγ表达均增强(P＜0.01);与GW9662干预组比较,姜黄素组PPARγ表达亦增强(P＜0.05).结论 姜黄素可抑制DMH诱导的大鼠大肠癌的形成,抑制体外培养的大肠癌细胞增殖,这种作用可能是通过激活PPARγ途径实现.
关键词： 姜黄素 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 大肠癌 结肠癌细胞株 HT29 -
串珠素小干扰RNA对结直肠癌细胞增殖的影响
目的 评估串珠素小干扰RNA(siRNA)对肿瘤细胞增殖的影响.方法 体外培养HCT15和HT29结直肠癌细胞,将构建好的串珠素siRNA载体转染培养细胞中,荧光显微镜下观察转染效率,qRT-PCR法检测串珠素mRNA表达,Westernblot法检测串珠素蛋白表达,MTS法检测串珠素siRNA对肿瘤细胞增殖的影响.结果 串珠素siRNA转染肿瘤细胞48 h后,肿瘤细胞串珠素mRNA、蛋白水平均出现降低(P＜0.05).串珠素siRNA对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.01).结论 串珠素siRNA对结直肠癌肿瘤细胞增殖具有显著的抑制效果.
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肠复康诱导人大肠癌HT29裸小鼠移植瘤细胞分化的研究
目的探讨肠复康诱导人大肠癌HT29裸小鼠移植瘤细胞分化的作用. 方法建立人大肠癌HT29裸小鼠皮下移植瘤模型, 用电子天平测量移植瘤的质量, 苏木精-伊红染色观察瘤组织细胞的形态结构, 结合图像分析系统半定量检测瘤细胞核分裂数及其形态计量学改变, 并使用逐步引入剔出模型进行多元线性回归分析. 结果与模型组比, 肠复康组和西药组均使移植瘤瘤体质量明显减轻(P＜0.05或0.001), 瘤组织细胞异型性降低, 核分裂数、核仁面积/核面积明显减少(P＜0.001), 且肠复康组的作用比西药组更为明显(P＜0.001); 同时, 肠复康组瘤细胞核平均灰度明显降低(P＜0.001), 细胞核形状因子增高(P＜0.05), 西药组以上改变不明显(P＞0.05). 回归分析结果, 移植瘤质量与瘤细胞核平均灰度和核分裂数呈明显正相关. 结论肠复康能抑制人大肠癌HT29裸小鼠移植瘤的增殖, 其机制之一可能是逆转瘤细胞的异型性, 诱导瘤细胞的重新分化.
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不同药物对HT29细胞及其体外肿瘤移植模型作用
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其术后5年生存率小于40％[1].表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体.研究显示,人类多种肿瘤细胞存在EGFR的异常激活,使其正常功能失控[2].结肠癌细胞过表达EGFR,抗EGFR抗体成为治疗结肠癌的重要生物治疗方法[3].西妥昔单抗是抗EGFR人/鼠嵌合单克隆抗体,它选择性地与EGFR结合,已被证实它对包括结肠癌在内的多种肿瘤有效[4].帕尼单抗可选择性地与肿瘤细胞表面表皮生长因子受体特异性结合而发挥抗瘤效果[5].本研究体外和体内实验观察帕尼单抗与西妥昔单抗对HT29细胞及其体外肿瘤移植模型治疗效果,以便在临床用药做出更好选择.
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大蒜素联合5-FU对结肠癌HT-29细胞凋亡的影响及机制
目的 探讨大蒜素与5-FU联合应用治疗结肠癌的作用机制.方法 利用HT-29细胞模拟结肠癌,设置空白对照组、大蒜素组(15μg/mL)、5-FU组(15μg/mL)和大蒜素+5-FU组(各15μg/mL)共4组,采用CCK-8法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术观察细胞凋亡情况,Real-time PCR检测mTOR、PTEN、Bcl-2与Bax mRNA表达情况.结果CCK-8检测结果显示,与空白对照组比较,各用药组均可以抑制HT-29细胞的增殖(P<0.05).其中大蒜素+5-FU组的抑制作用为显著;流式细胞术检测结果显示,各用药组凋亡细胞显著多于空白对照组,大蒜素+5-FU组凋亡细胞为显著;Real-time PCR结果显示,与空白对照组比较,各用药组Bcl-2、mTOR的mRNA表达量显著降低而Bax、PTEN的mR-NA表达量显著升高,大蒜素+5-FU组变化为显著.结论 大蒜素与5-FU联合应用可以抑制HT29细胞的增殖,促进凋亡,并且大蒜素具有增强5-FU诱导结肠癌细胞凋亡的能力.
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新型酪氨酸激酶抑制剂BSSD-1对斑马鱼血管生成及大肠癌HT29裸鼠肿瘤的抑制作用
目的 探讨化合物BSSD-1对斑马鱼新生血管的影响以及对大肠癌HT29裸鼠肿瘤的抑制作用.方法 采用24hpf (hours post fertilization)健康TG(VEGFR2:GFP)系血管荧光转基因斑马鱼作为实验动物模型,加入不同剂量BSSD-1与胚胎共同孵育24 h,在荧光显微镜下观察背部节间血管(intersegmental vessels,ISV)生成情况,并计数评价抑制程度;进而建立人大肠癌HT29细胞裸小鼠模型,观察BSSD-1不同剂量作用下对裸鼠肿瘤的抑制作用,根据瘤体积及瘤重,计算相对肿瘤增殖率和肿瘤生长抑制率.结果 化合物BSSD-1在0.25～25.0 mg·L-1范围抑制斑马鱼背部节间血管生成具有剂量相关性,12.5 mg·L-1抑制率可达98.8%;裸鼠肿瘤抑制试验中,大、中、小剂量组肿瘤生长抑制率试验结果分别为31.1%、40.0%和40.0%,统计学处理3组差异均有显著性.结论 BSSD-1可以抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长,该作用与抑制肿瘤新生血管生成有关.
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EP4在结肠癌细胞株 HT29增殖中的作用
目的：探讨PGE2诱导结肠癌细胞株HT29增殖和凋亡的机制，明确以EP4为靶点治疗结肠癌的作用途径。方法将EP4抑制剂L161982按不同浓度作用于结肠癌细胞系HT29，用MTT（四甲基偶氮唑蓝比色法）法分别于作用12、24、48、72 h时检测细胞增殖状态；流式细胞仪检测细胞凋亡情况，进一步采用Western Blot法检测Caspase-3的表达。结果 EP4抑制剂L161982对结肠癌细胞系HT29呈时间、剂量依赖性方式抑制细胞增殖；流式细胞仪检测结果显示，随着L161982剂量增加，HT29细胞凋亡增强；凋亡蛋白Caspase-3表达水平随L161982剂量增加而升高。结论PGE2可能通过EP4受体作用于结肠癌细胞，通过Caspase-3途径影响结肠癌细胞HT29的增殖与凋亡，这可能是结肠癌细胞增殖的分子机制。
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槲皮素对人结肠癌细胞HT29的增殖抑制及诱导凋亡的体外实验研究
目的 研究槲皮素( quercetin,Que)对人结肠癌细胞株HT29的增殖抑制作用及凋亡诱导效应,并通过Fas、Caspase-3蛋白的表达变化对其分子作用机制进行探讨.方法 常规培养结肠癌HT29细胞,分别用40、80、120 μmol·L-1 Que(Que1、Que2、Que3组)、4.02 mmol·L-1苦参碱(Mat组,为阳性对照)作用于细胞,以未加药组为对照组.采用MTT法检测细胞的增殖抑制率,透射电镜观察细胞的超微结构,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率,Western Blot法检测细胞Fas和Caspase-3蛋白的表达.结果 Que能显著增加细胞增殖的抑制率(P＜0.01),并呈剂量依赖关系;且Que2、Que3组的抑制率随着培养时间的延长而升高,呈时间依赖关系.电镜下Que 各组均呈现不同程度的凋亡特征形态变化:核固缩、染色质边集、并见核碎裂,凋亡小体出现.Que能明显增加细胞的凋亡率(P＜0.01)、能显著增加Fas和Caspase-3的表达(P＜0.01),并均呈剂量依赖关系.结论 Que对HT29细胞具有增殖抑制作用,并能诱导其凋亡,其作用机制可能与激活死亡受体Fas介导的Fas-Caspase-3凋亡信号通路有关.
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STAT3活化途径阻断对结直肠癌细胞HT29生长的影响
目的:探讨诱骗寡核苷酸技术靶向阻断STAT3活化途径对结直肠癌细胞HT29生长的影响,为结直肠癌的基因治疗提供实验依据.方法:利用decoy ODN体外转染结直肠癌细胞HT29,靶向阻断STAT3活化途径,荧光显微镜下观察及流式细胞术检测转染情况及效率,MTT法检测细胞的生长抑制情况,Realtime RT-PCR及Western blotting检测细胞内STAT3、Bcl-xl及Caspase3的mRNA及蛋白表达量.结果:STAT3 decoy ODN能够高效率的转染入结直肠癌细胞内,并定位于细胞核内.STAT3decoy ODN组HT29细胞生长抑制率显著增高,细胞内STAT3及Bcl-xl的mRNA及蛋白表达量显著降低(P＜0.05),Caspase3显著增加(P＜0.05).结论:Decoy ODN靶向阻断STAT3活化途径后,能够有效下调结直肠癌细胞HT29内STAT3基因的表达,抑制其细胞生长,其机制可能与降低STAT3、Bcl-xl及Caspase3的表达有关.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷联合苯丁酸钠对人结肠癌细胞HT29的抑制作用
日的:探讨DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dC)联合组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(SPB)的抗肿瘤效应及其机制.方法:将HT29细胞分为:对照组、SPB(1 mmol/L)处理组、5-aza-2dC(10 μmol/L)处理组、5-aza-2dC(10 μmol/L)+SPB(1 mmol/L)处理组.MTT法测定各处理组细胞的生存曲线,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期.结果:生长曲线结果提示:5-aza-2dC和SPB均能抑制HT29细胞的生长增殖,但差异不明显,联合应用后,细胞增殖得到明显抑制;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:SPB、5-aza-2dC、SPB+5-aza-2dC处理HT29后,细胞凋亡率分别为11.32%、20.25%和42.37%,三者比较有统计学差异(P<0.05);细胞周期分布检测显示:与对照组相比,单用SPB处理细胞,细胞周期分布变化不明显,5-aza-2dC处理细胞后,59.02%的细胞周期阻滞在G1期,而SPB联合5-aza-2dC后,S期细胞比例明显减少,G1期细胞比例可达73.7%,4组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:5-杂氮-2'-脱氧胞苷联合苯丁酸钠可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用.
关键词： DNA甲基化 HT29 苯丁酸钠 5-杂氮-2'-脱氧胞苷 -
Muc2基因沉默可降低益生菌抑制大肠杆菌黏附和侵袭的能力
目的：建立抑制肠上皮细胞基因组中Muc2基因表达的CRISPR/Cas9系统并探索粘蛋白Muc2在鼠李糖乳杆菌GG株（LGG）抑制大肠杆菌K1（Escherichia coli, E.coli k1）株E44黏附和侵袭肠上皮中的作用机制。方法设计2个长20~25 bp的sgRNA分别靶向Muc2，合成sgRNA寡核苷酸序列并构建CRISPR表达载体，转染野生型人结肠癌Ht29细胞，蛋白免疫印迹法检测抑制效率及通过MTT法检测其细胞活力及生长情况后，竞争性排斥分析验证粘蛋白Muc2在益生菌抑制E44黏附侵袭肠上皮中的作用。结果目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的lenticrisprv2质粒载体中且序列正确；稳定抑制Muc2表达的细胞株筛选成功；Muc2基因沉默后，与空白对照组相比，其表达水平明显降低，抑制率可达81%（P<0.01）；黏附侵袭实验中E44相对黏附率为72.23%（P<0.01），相对侵袭率为81.49%（P<0.01），益生菌LGG的抑制E44黏附和侵袭作用明显下调。结论Muc2基因下调明显降低益生菌抑制E44黏附和侵袭肠上皮细胞的能力，提示益生菌刺激Muc2表达上调可能是其强化加固肠粘膜屏障和拮抗致病菌功能的关键性机制之一，并可为肠道细菌性感染疾病的预防治疗提供了一个新手段。
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Hath1基因抑制结肠癌细胞的增殖
目的 研究Hath1基因对结肠癌细胞增殖的影响.方法 将重组质粒pcDNA3.1(+)-Hath1转化至HT29结肠癌细胞中,随机挑选3个过表达Hath1的HT29细胞克隆,通过定量实时RT-PCR方法 检测Ham1 mRNA、Muc2 mRNA的表达:Western blotting检测Hath1、Muc2、cyclinD1和p27表达;通过软琼脂克隆形成实验和裸鼠移植实验,观察Hath1基因对HT29细胞增殖能力的影响.结果 Hath1基因可上调p27和下调cyclinD1的表达,抑制HT29细胞的增殖.结论 Hath1基因可能在结肠癌的发病中扮演抗癌基因的作用.
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T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1过表达对人结直肠癌细胞生物学特性的影响
目的：应用已构建稳定过表达T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（T lymphoma invasion and metastasis， Tiam1）的人结直肠癌细胞株，探讨Tiam1对人结直肠癌细胞生物学特性的影响。方法：考马斯亮蓝染色以及扫描电镜观察Tiam1基因转染前后细胞形态学改变；细胞周期、MTT法、平板克隆形成实验、Transwell小室检测细胞体外增殖、迁移及侵袭能力；裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内增殖能力。结果：相对于HT29/mock细胞，HT29/Tiam1细胞多呈梭形，伪足增多、纤长；HT29/Tiam1细胞处于S期的细胞比例更高（t＝19．546， P＝0．000），细胞增殖能力增强（F＝177．125，P＝0．000），克隆形成率增高（t＝3．222，P＝0．032），HT29/Tiam1细胞穿过微孔膜（t＝4．832，P＝0．001）和Matrigel（t＝3．779，P＝0．005）的细胞数均增加，差异具有显著性；HT29/Tiam1和HT29/mock两组细胞的裸鼠体内生长差异从第15天开始出现，到第30天时，HT29/Tiam1细胞组的肿瘤体积是HT29/mock细胞组的2．3倍，差异具有统计学意义（F＝53．040，P＝0．002）。结论：Tiam1稳定过表达能够促进结直肠癌细胞的增殖、运动及侵袭能力，提示Tiam1在结直肠癌的发生、发展中发挥着重要作用，有望为结直肠癌的临床治疗提供新的靶点。
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NDRG2调控HGF/c-MET通路抑制结肠癌细胞的增殖
目的:探讨抑癌基因NDRG2通过调节HGF/c-MET信号通路,抑制结肠癌HT29细胞增殖的机制.方法:建立NDRG2过表达细胞株HT29-NDRG2及对照组HT29-Cherry,并于第1、2、3、4、5天以MTT法检测细胞增殖;以不同浓度的HGF(0ng/ml、1 ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、10ng/ml)刺激HT29亲本细胞,并于第1、2、3天以MTT法检测HT29细胞的增殖;采用qPCR法检测NDRG2过表达细胞株HT29-NDRG2与对照组HT29-Cherry两组细胞中HGF的表达水平;Western blot检测HT29-Cherry和HT29-NDRG2两组细胞以及添加HGF(10ng/ml)刺激HT29亲本细胞后各组细胞中HGF/c-MET通路中关键分子的表达.结果:过表达NDRG2以及HGF刺激均可以显著抑制HT29细胞的增殖能力;NDRG2的高表达可以上调HGF的转录水平;HGF可以刺激c-MET和p-ERK1/2,并上调p21和p 27,抑制HT29细胞的增殖;过表达NDRG2明显上调c-MET、p-ERK1/2,并诱导p21和p 27的高表达,从而抑制HT29细胞的增殖.结论:NDRG2可以通过调节HGF/c-MET信号通路从而抑制结肠癌细胞HT29细胞的增殖能力.
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结肠癌皮下移植瘤模型方法的优化
目的：通过分组筛选建立结肠癌皮下移植瘤模型的优条件，并以此为瘤源建立结肠癌皮下移植瘤模型。方法根据细胞介质和注射部位的不同，将人结肠癌细胞株 HT29分别用 PBS 和无血清培养基重悬后注射在 BALB／c 小鼠腋下和颈部皮下，建立第1代皮下移植瘤模型。以此为移植瘤源，利用插块法、酶解法及匀浆法，建立第2代皮下移植瘤模型，选择筛选后优选的方法建立第3代皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长及转移等情况，采用组织病理学、免疫组织化学、流式细胞技术对移植瘤进行检测。结果成功筛选建立了具有可操作性、高重复性的人结肠癌皮下移植瘤模型。移植瘤组织切片观察显示肿瘤为腺癌 I～Ⅱ级，免疫组化显示 CK19和 P53呈阳性至强阳性表达，流式细胞术检查分析 DNA 倍体为异倍体。结论本实验利用人结肠癌细胞株 HT29成功筛选并建立了合适的结肠癌皮下移植瘤模型，该模型为结肠癌转移的下一步生物学研究提供了一个良好的技术平台。
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肠复康抑制人结肠癌HT29裸鼠移植瘤血管发生的研究
目的探讨肠复康抑制人结肠癌HT29裸鼠移植瘤血管发生的作用和机制.方法建立人结肠癌HT29癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,采用随机数字表法随机分成3组,模型组8只,肠复康组7只,西药组8只.免疫组化染色结合图像分析系统半定量检测移植瘤微血管密度(MVD)、血管内皮前体细胞(EPC)数及血管内皮生长因子(VEGF)的积分光密度(IOD),并使用逐步引入剔出模型进行多元线性回归分析.结果与模型相比,肠复康组可使移植瘤MVD和EPC数目明显减少(P＜0.01～0.001),同时能显著降低瘤细胞VEGF含量(P＜0.001),西药组可明显降低瘤细胞VEGF含量(P＜0.01),但不能使移植瘤MVD和EPC数目减少(P＞0.05);回归分析结果,移植瘤MVD与EPC和瘤细胞VEGF含量呈明显正相关(前者r=0.388,P＜0.05;后者r=0.705,P＜0.001).结论肠复康能抑制人结肠癌HT29裸鼠移植瘤血管发生,其机制可能是降低瘤细胞VEGF含量,导致EPC数量减少.
