首页 > 文献资料
-
表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验
构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果.本研究将编码PCV2-Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap.将被限制性内切酶PacⅠ线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap；以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5.病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右；一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响.RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2-Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达.以107TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强.对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础.
-
表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原.本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3'UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJ M-TRS表达载体.将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap.将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJ M-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap.基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2 Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒2型 反向遗传 重组病毒 -
表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组脑心肌炎病毒的构建与鉴定
以脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)作为病毒载体,寻找基因组里理想的外源基因插入位点,为构建多价疫苗奠定基础.猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病.脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主谱广,能够天然感染多种哺乳动物.本研究采用EMCV NJ08毒株cDNA感染性克隆,将PCV2 ORF2基因插入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氨基酸之间,拯救获得重组EMCV rNJ08/Cap,拯救病毒含有分子遗传标记.Western Blot和IFA结果显示,该重组病毒成功表达Cap蛋白.重组病毒rNJ08/Cap在BHK-21细胞上生长曲线和病毒蚀斑大小与亲本病毒NJ08相似,证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体,为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础.
-
猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达
目的 表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持.方法 根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/L IPTG诱导.结果 表达产物以包涵体的形式存在.经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性.表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础.
-
安徽省猪圆环病毒2型感染的流行病学调查
目的 了解安徽地区猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)的感染状况.方法 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对采自安徽省14个地(市)的468份血清样品进行PCV2抗体检测,并运用PCR技术同步进行PCV2核酸检测.结果 PCV2抗体检测的平均阳性率为74.36%,且阳性率随猪的日龄增长而升高,皖南地区的阳性检出率明显高于淮北和江淮两个地区,PCR与ELISA检测结果的符合率为99.37%.结论 安徽省猪群中普遍存在PCV2的感染,病毒血症与抗体共存现象显著.
-
安徽省猪圆环病毒2型毒株的分离与鉴定
目的 从病原学角度了解安徽省猪群中PCV2的感染情况.方法 PCR检测临床疑似PCV2感染的病料,阳性病料接种于PK15细胞中进行PCV2的分离和增殖,再经PCR检测、间接免疫荧光试验、电镜观察,以及ORF2基因序列分析等鉴定.结果 9份临床病料中均扩增出630 bp的PCV2特异性DNA片段,分离鉴定获得5株PCV2,分离毒株之间及其与27株国内外参考毒株之间的ORF2基因序列同源性在87.3%～99.8%.结论 首次从病原学角度证实安徽省猪群中PCV2感染的普遍存在,分离毒株与国内外参考毒株的同源性均较高.
-
猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达
目的 乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位.方法 按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2ORF2及PRRSV ORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒pNZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12％SDS-PAGE分析.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确.嵌合蛋白相对分子质量约25 000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96％以上,浓度约1 mg/mL,产量可达60 mg/L细菌培养物.结论 PCV2ORF2与PRRSV ORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达.
关键词： 猪圆环病毒2型 猪繁殖及呼吸综合征病毒 嵌合抗原表位 乳酸乳球菌 -
重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及其免疫特性分析
目的 利用重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,并分析该蛋白的免疫特性.方法 将PCV2 Cap基因克隆至转移载体pFastBac Ⅰ,转化感受态E.coli DH10Bac细胞,获得重组杆粒rBacmid-Cap,转染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测重组杆状病毒,并于High Five(H5)细胞中进行高效表达.将小鼠随机分为PBS对照组、杆状病毒组、重组杆状病毒组及疫苗对照组,均经小鼠肌内注射,100 μL/只,分别于第0和14天进行免疫,于首免后第21、28、35及42天经小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清,ELISA法进行检测.结果 PCR和测序分析结果表明,重组转移质粒和重组杆粒构建正确.重组PCV2 Cap蛋白的相对分子质量约28 000,可与抗His标签单克隆抗体及抗PCV2 Cap多克隆抗体发生特异性结合.重组杆状病毒按MOI=5及1感染H5细胞约72 h,PCV2 Cap蛋白表达量高,表达产量约150 μg/mL.首免后第21、28、35及42天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于PBS对照组及杆状病毒组(P＜0.001);首免后第21、28、35天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于疫苗对照组(P＜0.05),首免后第42天,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功利用杆状病毒表达系统高效表达了PCV2 Cap,重组蛋白可诱导小鼠产生较高水平抗体,本研究为PCV疫苗的研制奠定了基础.
-
猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
目的 在毕赤酵母中分泌表达猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白.方法 将PCV2-Cap蛋白基因(GenBank登录号:KC620508.1)按毕赤酵母偏好密码子优化后,插入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,重组质粒pPICZαA-Cap经Sac Ⅰ线性化,通过电击转化整合至毕赤酵母GS115菌株的基因组中,构建pPICZαA-Cap-GS115重组酵母菌.经甲醇诱导表达重组Cap蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法进行鉴定.结果 重组表达质粒pPICZαA-Cap经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌pPICZαA-Cap-GS1 15经菌落PCR鉴定,可扩增出1 001 bp的目的基因片段;表达的重组Cap蛋白相对分子质量约49 000,可与猪圆环2型阳性血清和小鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应.结论 成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为PCV2亚单位疫苗和ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础.
-
N-末端核定位序列对猪圆环病毒衣壳蛋白病毒样颗粒在汉逊酵母中组装的影响
目的 探讨N-末端核定位序列(nuclear localization signal,NLS)对猪圆环病毒2型(porcine circovims type 2,PCV2)衣壳蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)中组装的影响.方法 分别构建表达PCV2ORF2全长及NLS截短型重组表达质粒pMOXZ-full和pMOXZ-△N40,电转至HP,构建重组酵母表达菌株full-HP和△N40-HP,获得的两种表达产物经蔗糖密度梯度超速离心及超滤后,Western blot法检测两种表达产物的单体蛋白表达和VLP组装效率,透射电子显微镜观察VLP形态,小鼠免疫试验检测VLP的免疫原性,地高辛标记DNA杂交法检测VLP的DNA结合能力.结果 与全长ORF2表达产物PCV2-VLP(full)比较,NLS截短型表达产物PCV2-VLP(△N40)的单体表达量略有提高,但VLP组装效率及DNA结合能力均降低.两种VLP颗粒形态相近,直径约20 nm;两种VLP免疫小鼠血清的抗体几何平均滴度(GMT)差异无统计学意义(P＞0.05).结论 去除NLS可提高PCV2衣壳蛋白VLP单体的表达水平,但不是VLP组装所必须的,且可使VLP的组装率略有降低.本研究为PCV2-VLP结构和疫苗的研究奠定了基础.
-
猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立基于TaqMan探针的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)荧光定量PCR检测方法.方法 根据PCV2ORF2的相对保守序列,设计两对特异性引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品；优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性；用建立的方法对50份临床样本进行检测,并与普通PCR检测结果进行比较.结果 重组质粒标准品经PCR及测序鉴定构建正确；建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.993 85；该方法的敏感性为6×101拷贝/μl,比普通PCR高2个数量级；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟兔化弱毒均无扩增曲线；检测3份PCV2阳性模板的变异系数在0.07％～0.50％之间；临床样本的阳性检出率(64％)明显高于普通PCR(44％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 建立的PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和重复性,适用于临床样本中微量PCV2的快速检测及其组织亲嗜性、细胞培养特性的研究.
-
乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证
目的 建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用.方法 参照GenBank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化.将PCR扩增产物分别与pMD 18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析.对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2.结果 确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10 μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol/L.扩增的目的基因测序结果与GenBank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100％.建立的PCR方法低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带.用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2.结论 成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测.
-
猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查
根据GenBank上发表的PRRSV ORF7、PPV VP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法.应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52.3%;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26.9%.另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7.5%.由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍.
关键词： 猪圆环病毒2型 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪细小病毒 混合感染 -
PMWS病猪猪圆环病毒2型全基因组序列分析
根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法直接从5省病料中分别扩增出5个PCV2毒株的全基因组,分别命名为FujianPCV、GuangxiPCV、HainanPCV、HunanPCV和ShandongPCV.将扩增片段克隆于pMD 18-T载体,进行序列测定,结果表明,除FujianPCV株核苷酸长度为1768bp,其余四株均为1767 bp.应用DNAstar序列分析软件分析表明,本实验的5个PCV2分离株与世界上其它地区的PCV2分离株密切相关,核苷酸序列同源性达93%～98.8%,与PCV1毒株的序列同源性只有68.4%～70%.其中ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为98.1%～99.4%和88%～99.1%.
-
感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆
本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV-2)的全基因组(1 768bp),克隆入pcDNA3载体的EcoRI酶切应点,获得含有PCV-2全基因组的重组质粒,命名为pcDNApcv2.将重组质粒大量扩增后,用EcoRI切出1 768bp的PCV-2全基因组,在体外用T4 DNA连接酶使其连接环化.用脂质体法将体外连接产物转染无PCV污染的PK-15细胞,经4次连续传代,用间接免疫荧光实验(IFA)及电镜观察证实已获得复制能力的PCV-2病毒.由此可见,本试验构建的环化的PCV-2全基因组DNA具有感染性.
-
猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速检测
呼吸道疾病是猪场常见的疾病之一,严重影响猪群的健康,已经给世界养猪业造成了巨大的经济损失[1,2].呼吸道疾病的病原复杂多变,不同的猪场病因可能完全不同,从而给疾病的诊断与防治带来了很大的困难.多年的研究表明,呼吸道疾病的病因可能包括猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪流感病毒、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MH)、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus, PCV2)及猪链球菌或沙门氏菌等[3～8].其中PRRSV与PCV2为近几年新发现的猪重要的传染性病原,且呈不断的蔓延趋势,在呼吸道疾病发生过程中所起的作用日益增强[9,10].
关键词： 猪圆环病毒2型 猪繁殖与呼吸综合症病毒 共感染 检测 -
猪PCV2 ORF2蛋白I-ELISA检测方法的建立及猪场血清抗体检测分析
目的 用猪PCV2ORF2蛋白建立ELISA检测方法,有效区分猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2),并进行大规模化样本检测.方法 以猪PCV2ORF2蛋白作为包被抗原,以抗PCV2阳性血清为一抗,羊抗猪酶标物为二抗,通过预试验确定诱导温度、诱导时间、摇动转速、IPTG浓度以及反应板种类等参数,从而建立间接酶联免疫吸附方法(I-ELISA)以检测抗PCV2猪血清抗体滴度.结果 采用本研究建立的ELISA方法测定山东省内4个猪场送检的316份猪血清,检出PCV2阳性率处于较高水平,表明猪群携带病毒比例很高.结论 本试验建立的间接ELISA检测方法敏感度高、特异性强,可用于临床PCV2血清抗体的检测,为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PCV2感染的快速诊断方法提供了科学依据.
