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G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征
近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征.结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型.系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系.可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来.
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肠道病毒71型北京分离株VP4基因序列及蛋白抗原性分析
为探讨肠道病毒71型(EV71)VP4基因序列与手足口病(HFMD)不同临床类型之间的关系,分析重组蛋白EV71 VP4的抗原性,并初步探讨其与柯萨奇病毒A16(CA16)重组蛋白VP4是否存在交叉反应性,对2007～2009年从北京息HFMD儿童标本分离到的10株EV71的VP4基因进行克隆测序,运用生物学软件对测序结果进行比较分析,并选择其中1株与1株同期分离的CA16的VP4分别进行原核表达;用表达产物对189份正常体检的成人及来首都儿科研究所就医的非HFMD患儿血清中的IgG进行Western Blot检测,并分析14份确诊为EV71感染和12份CA16感染患者急性期血清中的IgM抗体.分析表明这10株EV71 VP4基因核苷酸同源性为94.20%～100.00%,所推导的氨基酸序列则完全相同,从重症与轻症患儿分离的毒株之间VP4的核苷酸序列未见一致性的差异,基于EV71 VP4基因核苷酸序列的进化树分析表明2007～2009年北京地区所流行的毒株均属于C4亚型;本研究中EV71和CA16的VP4核苷酸序列的同源性为69.6O%,所推导的氨基酸序列的同源性为78.60%,在运用Western Blot检测189份血清中的VP4特异性IgG时,EV71 VP4的血清阳性率为38.10%,说明其具有良好的抗原性,CA16 VP4的血清阳性率为58.20%,两者差别具有显著统计学意义(x2=15.30,P＜0.01,提示EV71 VP4与CA16 VP4没有交叉反应性;在用表达的VP4检测已确诊为相应病毒的特异性IgM时,两者皆为阴性,提示感染后机体对VP1和VP4产生不同的反应.
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G9型人A组轮状病毒LL52696与LL52727株的主要基因及其编码蛋白特征的分析
人A组轮状病毒(Human rotavirus,HRV)是引起世界范围婴幼儿重症腹泻的主要病原,也是导致发展中国家婴幼儿死亡的主要病因之一[1-3],世界卫生组织统计每年大约引起611 000婴儿和儿童死亡,特别是发展中国家[4].HRV感染广泛,且改善营养状况和卫生条件对HRV发病危险影响不大,因此在发达国家和发展中国家HRV感染率接近.HRV引起的腹泻至今无特效药,发展疫苗对控制HRV感染的作用就显得特别突出.
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引起产科新生儿腹泻暴发的轮状病毒株VP4 VP7编码基因与其毒力关系的探讨
克隆并测定了引起产科新生儿腹泻暴发的P2[6]、G4型轮状病毒(BN株)VP4的VP8片段和VP7编码基因的核苷酸序列,并据此推导出其氨基酸序列.与相应标准株和地方株(包括有毒株和无毒株)比较的结果表明,所测VP8序列与相同型别(P2[6])的标准株M37(无毒株)和ST3(无毒株)、地方株N16(无毒株)和VE7156(有毒株)之间的同源性为92.8%～98.6%,胰酶作用位点各毒株间相同;位于aa49、aa50、aa52、aa53、aa78处的氨基酸在有毒株与无毒株间(包括BN株)不同,但分别保守.VP7基因与同型(G4)标准株ST3(A亚型/无毒株)和VA70(B亚型/有毒株)、意大利地方株PV5249(A亚型/有毒株)和北京地方株CR117(有毒株)、同型猪有毒株Gott之间的同源性为91.4%～97.8%,其中与A亚型的同源性为95.5%～96.3%,而与B亚型的同源性为91.4%,提示VP7为G4A亚型,位于aa38、aa78、aa145、aa238位点的氨基酸在有毒株与无毒株之间不同,但分别保守.分析了虽为P2[6]型却反常地引起新生儿腹泻暴发毒株(BN)的VP8与VP7基因的变异情况,并对轮状病毒毒力与VP4、VP7基因变异的相互关系进行了讨论,为慎重确定轮状病毒疫苗候选毒株提供理论依据.
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人肠道病毒71型VP1和VP4的抗原融合表达及鉴定
目的:构建人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)VP1-VP4重组融合蛋白表达体系.方法:构建EV71 VP1-VP4重组融合蛋白原核表达载体转化大肠杆菌DH5α,诱导表达融合蛋白VP1-VP4,SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定.用融和蛋白包被ELISA板检测41例已知血清.结果:重组片段VP1-VP4测序结果与设计目的片段序列相符,重组载体构建成功;SDS-PAGE显示融合蛋白约42.8 kDa,与预期值一致；Western blot提示该融合蛋白可以和EV71VP1、VP4抗体特异性结合.融合蛋白包被ELISA板能准确检测出41例血清中16例EV71阳性血清,与CA16无交叉反应.结论:表达的EV71 VP1-VP4融合蛋白具有良好的抗原性,可作为EV71感染检测抗原,为EV71诊断试剂和疫苗的研究奠定实验基础.
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轮状病毒外壳蛋白VP4在大肠埃希菌中的表达
目的 克隆表达轮状病毒融合素蛋白VP4.方法 以轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板,经RT-PCR获得VP4全长基因片段cDNA,将其重组于pET-30a(+)表达载体,转化大肠埃希菌BL21(plysS),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并用镍柱纯化.结果 重组载体所含目的基因片段的序列与文献公布序列相符,IPTG诱导表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在;SDS-PAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致,为88 kD,Western blot检测发现目的蛋白所带组氨酸标签可与标签抗体反应;镍柱纯化获得RV SA11 VP4融合素蛋白,纯度达90%.结论 构建了表达载体pET-30a(+)-VP4,经诱导表达、纯化,获得了RV融合素蛋白VP4.
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2010年郑州地区腹泻患儿A组轮状病毒VP4基因型初步研究
目的 研究郑州地区秋冬季婴幼儿腹泻A组轮状病毒的VP4分子基因分型.方法 收集郑州第一人民医院儿科2010年9-12月住院的腹泻患儿的粪便标本80份,采用TRIzol方法抽提大便中的核酸,酶联接免疫吸附剂测定方法(ELISA)检测轮状病毒基因组,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法以及巢式聚合酶链反应法(net-PCR)PCR法进行轮状病毒的VP4基因分型.80份粪便标本中,40份检测到A组轮状病毒RNA基因,阳性率为50%,对40份标本进行VP4基因分型研究,P8型为33例(82.5.%),P6型6例(15%),P8和P6混合感染型1例(2.5%),未发现其他型.结论 郑州地区A组RV以P8型为主要流行基因型,并发现P6和P8混合型.
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人轮状病毒vp4全基因原核穿梭表达质粒的构建及鉴定
目的 构建人轮状病毒( Rotavirus,RV)vp4全基因原核穿梭表达质粒,经大肠杆菌表达验证后转化入双歧杆菌.方法 从pMD19-T simple-vp4质粒中扩增RV vp4全基因,克隆至pBEX载体中,构建重组表达质粒pBEX-vp4,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,电转化法将重组质粒转化人双歧杆菌,提取质粒,进行PCR及双酶切鉴定.结果 重组表达质粒pBEX-vp4经酶切、PCR和测序证明构建正确；在大肠杆菌BL21 (DE3)中可表达相对分子质量约87 000的重组VP4蛋白,表达量较低,以包涵体形式表达,可与羊抗人轮状病毒多克隆抗体特异性结合；经PCR及双酶切鉴定,重组质粒pBEX-vp4已成功转入双歧杆菌中.结论 重组表达质粒pBEX-vp4可在大肠杆菌中表达RV VP4蛋白,并可经电转化法有效地将重组表达质粒转化入双歧杆菌,为下一步在双歧杆菌中进行表达及研制基于双歧杆菌表达系统的RV重组亚单位口服活疫苗奠定了基础.
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人肠道病毒71型VP4多抗的制备及其应用
目的 制备人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP4多抗,并鉴定EV71空心颗粒(empty particle,EP)和实心颗粒(full particle,FP).方法 构建重组表达质粒pGEX-6p-1-VP4,诱导表达并纯化GST-VP4融合蛋白,免疫家兔制备多抗.ELISA法检测抗体效价,免疫荧光试验(immunofluoreseenee assay,IFA)和Western blot法鉴定抗体特异性.应用制备的多抗经Western blot法区分EV71 EP与FP.结果 质粒pGEX-6p-1-VP4经双酶切及测序鉴定证明构建正确,纯化后的GST-VP4融合蛋白相对分子质量约32 000,以包涵体形式存在.免疫家兔后可获得效价达1010的多抗.兔抗EV71 VP4多抗可识别EV71原核表达及天然病毒颗粒中的VP0、VP4.结论 抗EV71 VP4多抗可应用于EV71 EP及FP的鉴定,为EV71的基础研究及疫苗研发提供了新的工具及方法.
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南昌地区儿童手足口病病原型别及其流行特征分析
目的 了解南昌地区儿童手足口病(HFMD)的病原学构成,为该地区HFMD的流行病学防控提供基础.方法 收集2014年4至12月临床送检疑似HFMD患者咽拭子标本,运用荧光定量RT-PCR检测肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CVA16)核酸;每季度按照等距抽样的方法选取一定量的非EV71、非CVA16型的其他EV标本,利用VP4区分型引物进行巢式PCR,产物通过测序和GenBank Blast比对进行分型鉴定.结果 2014年4至12月共检测到EV阳性病例19 059例,其中EV71、CVA16和其他EV检出率分别为23.22％ (4 425/19 059)、11.36％ (2 166/19 059)、65.42％(12 468/19 059).其他EV抽样检测结果显示,第2季度CVA10占比高,为24.39％(10/41),其次是CVA4和CVA6,各占19.51％ (8/41);第3季度CVA6占比高,为73.08％ (95/130),其次是CVA10和CVA4,分别占11.54％(15/130)和6.15％ (8/130);而第4季度CVA6占比94.74％ (36/38),其次是CVA10占5.26％ (2/38).结论 2014年第2至第4季度非EV71、非CVA16型的其他EV检出率高,且CVA6为2014年第3和第4季度南昌地区引起HFMD的优势病毒株.
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VP7、VP4与轮状病毒装配及分子流行病学
A组轮状病毒是全球婴幼儿腹泻的主要病原,其外壳蛋白VP7和VP4在病毒黏附、穿人细胞、血凝及诱导产生中和抗体中具有重要的作用,它们还分别决定血清型G型和P型,VP4又以基因序列不同而分型,称为P[]基因型,而且由其决定的分子病学流行特点不断发生变化.文中对A组轮状病毒VP7和VP4以上几方面的研究加以综述.
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羊轮状病毒LLR VP4单克隆抗体的制备与特性研究
目的 建立抗羊轮状病毒LLR(G10P[12\])VP4特异的单克隆抗体.方法 用纯化羊轮状病毒LLR免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,利用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法单克隆化,Western-blot鉴定单克隆抗体识别的抗原.结果 获得4株稳定分泌抗VP4单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B1、1B8、1F11和1G10,其中1-B1,1-B8,1-G10分泌的抗体为IgM型,1-F11为IgG1亚类;腹水抗体效价均在1×104以上;单克隆抗体均特异性识别羊轮状病毒LLR VP4.结论 1B1、1B8、1F11和1G10分泌的抗体为抗羊轮状病毒LLR VP4特异的单克隆抗体.
关键词： 羊轮状病毒LLR(G10P\[12\]) VP4 单克隆抗体 -
大连市人肠道病毒71型分离株基因特征分析
目的 了解2009年-2011年大连地区肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征,初步探讨VP1、VP4、5'UTR区核苷酸和氨基酸序列变异与不同临床类型的关系.方法 从手足口病例、重症病例的粪便标本中分离获得9株EV71病毒株,RT-PCR扩增VP1、VP4、5'UTR区,并进行序列测定和分析.结果 这9株EV71毒株均属于C4a亚型,其核苷酸之间的同源性为88.7％ ～ 99.9％;氨基酸之间的同源性为96.7％ ～ 100％;9株毒株的VP4氨基酸序列高度一致;对于5'UTR区在第208位核苷酸,重症来源的样品发生了碱基置换(G→A);在第254位核苷酸,重症来源的样品发生了碱基置换(A→G).氨基酸序列未发现一致性改变.结论 (1) 2009年-2011年大连地区分离的9株EV71毒株均属于C4a亚型.(2)基于VP4的基因分型与VP1的基因分型相一致,均为C4a亚型,且VP4序列高度保守.(3)在5'UTR序列上发现了第208位和254位核苷酸的碱基置换,这一结果还有待于进行下一步的研究.
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株外衣壳蛋白VP4的节段克隆表达和免疫学分析
目的 原核表达草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S6基因特定保守区域编码的外衣壳蛋白VP4并探究其免疫原性,为草鱼出血病(GCHD)防治提供新思路.方法 将VP4基因特定保守区域克隆到原核表达质粒pET-32a(+)中,诱导表达并用镍柱进行纯化,用纯化的目的蛋白免疫SD大鼠获取免疫血清;应用ELISA检测实验组(重组蛋白皮下免疫大鼠)和对照组(PBS免疫大鼠)血清IgG抗体滴度及亚类的水平;应用间接免疫荧光实验(IFA)检测rVP4抗血清对病毒的识别情况.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET32a-VP4重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,融合蛋白分子量约为43 kDa,且在37℃、1mmol/L IPTG条件下诱导表达效果优;经亲和层析获得了高纯度蛋白;免疫大鼠6周后血清IgG抗体滴度高达1:819 200,IgG1、IgG2a水平差异无统计学意义(P＞0.05);IFA结果显示抗血清组特异性荧光显著,而对照组未见荧光.结论 GCRV-HZ08 VP4具有良好的免疫原性,可诱导大鼠产生Th1/Th2混合型免疫反应,且rVP4抗血清可识别该病毒,为VP4作为疫苗候选分子提供了依据.
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成都地区婴幼儿腹泻轮状病毒的基因分型研究
目的 了解成都市婴幼儿轮状病毒的基因分型特点,以及流行优势毒株VP4基因核酸序列变异情况.方法 收集2010年3月华西第二医院75份门诊婴幼儿腹泻标本,RT-PCR检测轮状病毒并进行G、P基因分型.据检测结果确定流行优势株,对两株优势株VP4基因进行T-A克隆和测序比对.结果 A组轮状病毒检出率为17.3%(13/75),其中G1型7株,G3型2株,4株未分型;P基因分型结果为P[8]型6株,P[4]型2株,P[10]型、P[6]型、P[9]型各1株,2株未分型;G/P组合结果以G1P[8]型为主,共5株;G1P[4]型,G3P[6]型各1株.VP4测序结果显示,两株优势株均为P[8]基因型,且毒株之间具有高度同源性(97%),与标准株之间同源性也达90%以上.结论 A组轮状病毒是成都地区2010年春季婴幼儿腹泻的重要病原之一,其血清型主要为G1型,流行优势株G/P组合为G1P[8]型.
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河南省柯萨奇病毒A组16型VP4基因特征分析
目的 分析河南省手足口病标本分离柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A 16,CVA16) VP4的基因特征,并比较VP4与VP1遗传进化分析的差异.方法 对分离自河南省手足口病(hand-foot-mouthdisease,HFMD)患儿的8株CVA16,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP4区域扩增并对扩增产物进行测序,用分子生物学软件ATGC进行序列拼接,Bioedit比对剪齐,用MEGA 4.0软件进行同源性分析,并与已报道的CVA16标准株序列构建基因进化树.结果 河南省8株毒株VP4核苷酸同源性为91.3％～98.1％、氨基酸同源性为100.0％,与国际原型株CA16/G10/RSA/1951(A型)比对,VP4核苷酸同源性为79.7％～82.6％,氨基酸同源性为100.0％;与B1a、B1b和B2型代表株核苷酸同源性分别为92.3％～95.7％、92.8％～98.6％、88.9％～91.8％,氨基酸同源性均为100.0％.河南省分离的CVA16毒株均属于B1亚型,有B1a和B1b两个进化支共同存在和循环,但VP4与VP1的进化树分型不完全一致.结论 VP4基因不能作为CVA16病毒基因亚型分型的依据.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 VP4 进化树
