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hTERT短发夹状RNA抑制前列腺癌细胞生长的研究
目的 研究靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹状RNA(shRNA)基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用.方法 在脂质体介导下将针对hTERT基因的shRNA表达载体psilencer-TRT转染前列腺癌细胞PC-3m,得到稳定细胞株PC-3m/shRNA-TRT.采用RT-PCR检测hTERT基因表达情况,western blot分析各组细胞hTERT及c-myc蛋白表达变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 重组质粒psilencer-TRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调,抑制率约为89.02%;同时实验组细胞hTERT及c-myc蛋白水平较对照组有明显下降,细胞的生长增殖能力也显著降低(P＜0.05),生长速率明显变慢,部分细胞呈现凋亡形态学改变,凋亡率为(19.69±4.75)%.结论 hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长,诱导PC-3m细胞凋亡,可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法.
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靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达
目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠埃希菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,采用Real-time PCR检测GSK-3β mRNA被抑制情况.选取抑制效应强的重组质粒和阴性质粒转染的PANC-1细胞,经G418筛选后,建立稳定表达GSK-3β-shRNA的PANC-1细胞株(实验组)和稳定表达control-shRNA的PANC-1细胞株(阴性对照组).分别采用荧光显微镜和流式细胞术观察细胞的转染情况;Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的表达.结果 ①经测序证实,成功构建GSK-3β-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致;②重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后,GSK-3β mRNA明显下调(P＜0.05),其中以2号重组质粒效应强;③重组质粒稳定转染后检测PANC-1细胞中GSK-3β的表达,Real-time PCR和Western blot结果均提示:与未转染的阴性对照组和载体对照组比较,实验组中GSK-3β mRNA和蛋白的表达均显著降低(均P＜0.05).结论 成功构建了携带以GSK-3β为靶向的shRNA的重组质粒.经脂质体途径稳定转染PANC-1细胞,该shRNA能够显著抑制GSK-3β的表达.
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靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响
目的 设计以髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)为靶点的短发夹状RNA(shRNA).构建携带此shRNA的重组质粒,探讨脂质体转染该重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响.方法 设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hHlneo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,通过RT-PeR及Western blot方法检测转染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达情况,筛选能高效抑制Mcl-1基因表达的shRNA重组质粒并应用MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3.经测序证实.插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1重组质粒下调效应强.MTT检测显示pMclsi-1可明显抑制HepG2细胞增殖,流式细胞仪测定转染后24 h细胞凋亡率为6.5%,48 h细胞凋亡率为15.6%,显著高于对照组(3.9%,P<0.05).结论 采用RNAi技术可特异阻断Mcl-1基因的表达,Mcl-1基因有促进细胞增生及抑制凋亡的作用.
关键词： 髓细胞白血病基因-1 短发夹状RNA 细胞增殖 细胞凋亡 -
Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞增殖及凋亡的影响
目的 构建Survivin的shRNA表达质粒并将其导入白血病细胞株HL-60细胞以探讨PNA干扰对HL-60细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成两对针对survivin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的裁体质粒pSINsi-Hu6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2.pSIN/shRNA1转染HL60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 酶切分析和测序证实pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2构建成功.MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shRNA1入HL-60细胞48、72和96 h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组组比较,差异有显著性(P＜0.05).流式细胞仪分析pSIN/shRNA1组胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%.结论 成功地构建了survivin基因RNAi真核表达栽体,且pSIN/shRNA1可序列特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,为白血病的基因治疗奠定基础.
关键词： Survivin基因 RNA干扰 短发夹状RNA 白血病 HL60细胞 -
ShRNA抑制gankyrin基因在肝癌细胞中表达的研究
目的构建靶向癌基因gankyrin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2中对gankyrin基因表达的抑制作用.方法设计、合成三对针对gankyrin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pGenesil-1中,构建重组质粒pGenesil-1-Gankyrin1、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3,稳定转染HepG2细胞,采用RT-PCR及Western blot 检测对gankyrin表达的抑制效果.结果酶切分析和测序证实pGenesil-1-Gankyrin1、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3构建成功;其中pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3对gankyrin的表达有明显的抑制作用.结论构建的pGenesil-1-Gankyrin重组质粒能有效抑制gankyrin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达.
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靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默
目的:设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响.方法:将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine 2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出有效的shRNA.此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况.结果:经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为为有效的shRNA.重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达.结论:慢病毒介导的shRNA 干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础.
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靶向GPR48的shRNA抑制人宫颈癌HeLa细胞的侵袭转移
背景与目的:GPR48受体偶联Gs蛋白介导细胞内信号转导通路,通过调节微管聚合状态和基质金属蛋白酶活性,影响肿瘤细胞的侵袭转移.本研究探讨靶向GPR48的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人宫颈癌细胞株HeLa体外侵袭能力及在体转移能力的影响.方法:以人GPR48 mRNA编码区中两条不同序列作为RNA干扰靶点,构建靶向GPR48的shRNA真核表达质粒,同时构建不针对任何已知mRNA的阴性shRNA真核表达质粒,分别转染至HeLa细胞.新霉索抗性筛选稳定表达siRNA的转化克隆.采用RT-PCR和Western blot检测GPR48的表达变化.通过Boyden小室实验以穿过人工基底膜的细胞数量评估HeLa细胞体外侵袭能力的变化;分别将转染和未转染GPR48 shRNA的HeLa细胞接种于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况及肺部转移情况.结果:RNA干扰使HeLa细胞GPR48表达下调80%;与阴性对照组比较,转染靶向GPR48重组质粒的实验组穿膜细胞数显著减少(28.3±1.5和17.6±1.5 vs.94.4±15.7,P<0.01).裸鼠在体肺转移实验中,与阴性对照组比较,转染靶向GPR48重组质粒的实验组肺转移结节数显著减少(1.3±0.2和1.5±0.4 vs.7.8±1.8,P<0.01).结论:shRNA真核表达载体能明显抑制HeLa细胞的GPR48表达.有效抑制HeLa细胞的体外侵袭和在体转移.
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shRNA沉默COX-2基因表达对人肝癌细胞生物学特性的影响
背景与目的:环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在肝癌组织中呈高表达,参与肝癌的发生发展.本研究探讨COX-2短发夹状RNA(shrt hairpin RNA,shRNA)对人肝癌细胞株HepG2中COX-2表达及细胞粘附侵袭力的影响.方法:以人COX-2 mRNA编码区中两条不同序列作为RNA干扰靶点,分别构建两个以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体转染HepG2细胞,分别观察转染后24 h、48 h、72 h和96 h COX-2 mRNA和蛋白表达的变化,检测抑制效果.MTT法观察HepG2细胞与Matrigel胶粘附性的变化.Transwell小室实验以穿过人工基底膜的细胞数量评估HepG2细胞体外侵袭力的变化.结果:质粒在HepG2细胞的转染率约为60%.质粒WBH1导人细胞24 h、48 h、72 h和96 h后,COX-2mRNA表达抑制率分别为18.5%、88.6%、52.8%和42.4%(P＜0.01),蛋白表达抑制率分别为10.3%、80.5%、45.3%和39.0%(P＜0.01).转染WBH2质粒的HepG2细胞COX-2表达无明显变化(P＞0.05).转染后48 h,转染WBH1质粒的HepG2细胞与Matrigel胶的粘附率为(6.0±0.4)%,与空白对照组(11.4±0.2)%相比明显下降(P＜0.01),抑制率为47.4%.转染WBH1质粒的细胞穿膜数为(8.2±1.5),与空白对照组(22.8±1.7)相比有显著性差异(P＜0.01),抑制率为63.7%.转染WBH2质粒的HepG2细胞粘附率和穿膜细胞数均无明显变化(P＞0.05).结论:shRNA真核表达载体明显干扰HepG2细胞的COX-2表达,能有效抑制HepG2细胞的体外粘附侵袭力.
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bcl-xL短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡
背景与目的:实验证明bcl-xL在鼻咽癌细胞株CNE-2Z中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用.本研究拟探讨bcl-xL短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)诱导CNE-2Z细胞凋亡的作用.方法:把表达bcl-xLshRNA的重组质粒pmU6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测bcl-xL、bcl-2、survivin 和caspase-3的mRNA表达水平;用Western blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平.结果:流式细胞术检测发现,pmU6-RNAi重组质粒作用24 h后,细胞出现明显的凋亡峰;Hoechst 33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR分析pmU6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的mRNA表达水平,对survivin的mRNA表达水平无影响;Western blot分析pmU6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平.结论:bcl-xL shRNA可诱导CNE-2Z细胞凋亡;CNE-2Z细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA为开发鼻咽癌的基因治疗药物提供实验依据.
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慢病毒介导靶向survivin基因的shRNA抑制子宫内膜在裸鼠腹腔种植生长
目的：研究慢病毒介导生存素(survivin)基因特异性短发夹状RNA(shRNA)对人子宫内膜在裸鼠腹腔种植生长的影响。方法将45只裸鼠随机分为实验组、阴性对照组及空白对照组，每组15只，将子宫内膜异位症患者在位内膜注射入裸鼠腹腔，同时将survivin-shRNA慢病毒、空载慢病毒及磷酸盐缓冲液分别注射至3组裸鼠腹腔内，2周后观察各组子宫内膜种植成功率，光镜下观察异位病灶的形态学特点，免疫组化方法检测各组病灶中survivin的表达水平。结果实验组子宫内膜种植成功率（26.67%）明显低于阴性对照组（73.33%）及空白对照组（80%，P<0.01）；实验组成活的异位内膜腺体发育不良，间质伴有不同程度的坏死；该组病灶中survivin蛋白表达亦明显下降，与两对照组比较差异有显著性（P<0.001）。结论慢病毒介导survivin基因特异性shRNA能够通过靶向沉默survivin基因明显抑制人子宫内膜在裸鼠腹腔中的种植生长。
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慢病毒介导shRNA沉默survivin基因对鸡胚绒毛尿囊膜子宫内膜异位症模型的影响
目的 研究慢病毒介导生存素基因特异性短发夹状RNA(shRNA)对子官内膜异位症异位内膜生长及新生血管形成的影响.方法 建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)子宫内膜异位症模型,随机分成单纯接种组、shRNA慢病毒组、空载慢病毒组和空白载体组,每组30只.通过Image-proplus软件测量新生血管面积与鸡胚尿囊膜面积比(VA/CAM)评价沉默survivin基因对CAM血管生成的影响,TUNEL检测异位内膜细胞凋亡,组织病理学观察异位内膜病灶生长行为.结果 shRNA慢病毒处理组种植内膜存活率低,该组VA/CAM明显低于单纯接种组、空载慢病毒组和空白载体组(P＜0.001),后3组间比较无显著性差异(P＞0.05).shRNA慢病毒处理组种植内膜细胞凋亡率明显高于其他3组(P＜0.05),另3组间比较无显著性差异(P＞005).shRNA慢病毒处理组病灶在光镜下可见腺体结构不完整,间质伴有不同程度的坏死.结论 慢病毒介导survivin基因特异性shRNA能够显著抑制人子宫内膜异位症种植CAM模型的新生血管形成,抑制子官内膜在CAM上的种植生长.
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shRNA转染对异位内膜细胞survivin基因的靶点抑制作用
目的 构建靶向人survivin基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对异位内膜细胞survivin基因的抑制作用.方法 设计干扰人survivin基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pGCL-GFP载体,PCR鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提,在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和survivin基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度.感染人异位子宫内膜细胞,采用RT-PCR测定细胞中survivin mRNA的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果 慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×10 8U/ml.Survivin shRNA慢病毒载体感染人异位内膜细胞后,Survivin mRNA水平为0.15±0.03,明显低于阴性对照组0.42±0.06和空白对照组0.48±0.08(P<0.01);而阴性对照组与空白对照组相比无统计学差异.结论 成功构建针对survivin基因的shRNA慢病毒载体,体外感染人异位内膜细胞后可有效抑制survivin基因的表达,为研究子宫内膜异位症分子病冈和基因治疗提供了新的平台.
关键词： Survivin基因 短发夹状RNA 慢病毒 异位内膜细胞 子宫内膜异位症 -
靶向shRNA抑制survivin基因对子宫内膜异位症裸鼠模型异位内膜caspase-3表达的影响
目的:利用慢病毒介导特异性短发夹状RNA(LV-shRNA) 靶向沉默生存素基因,观察其对子宫内膜异位症裸鼠模型异位病灶中caspase-3表达的影响.方法:建立人子宫内膜裸鼠皮下种植模型,将LV-shRNA、空载慢病毒及磷酸盐缓冲液分别注射至裸鼠皮下异位病灶,观察病灶生长情况.分别采用RT-PCR及免疫组化检测异位病灶中生存素、caspase-3 mRNA及蛋白的表达.结果:LV-shRNA处理组病灶体积、重量明显低于两对照组.与两对照组相比,LV-shRNA处理组生存素 mRNA及蛋白的表达量明显降低,caspase-3的表达量明显升高,而生存素及caspase-3的表达在两对照组之间相比,差异均无统计学意义.结论:LV-shRNA可明显抑制裸鼠异位子宫内膜病灶的生长,其机制可能与其通过下调生存素蛋白、激活下游的caspase-3诱导细胞凋亡有关.
关键词： 子宫内膜异位症 生存素 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3 短发夹状RNA 裸鼠 -
RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用
目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果.方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8 shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8 shRNA的细胞系.实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U 6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8 shRNA的RK3E细胞系.经脂多糖孵育12 h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和Real time PCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性.结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P＜0.01).结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生.
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人SR-BI基因表达抑制慢病毒载体构建及其稳定细胞株的筛选
目的 建立SR-BI表达抑制的肝癌细胞系,以作为研究SR-BI基因突变对HCV感染性影响的细胞模型.方法 构建SR-BI短发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒重组质粒Lv-SR-BI-shRNA,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK2973T细胞,包装SR-BI shRNA慢病毒并进行病毒滴度测定.SR-BI shRNA慢病毒感染人肝癌细胞株Huh7和Huh7.5.1细胞,嘌呤霉素筛选,Real-time PCR和Western blot法检测SR-BI mRNA转录和蛋白表达.结果 测序结果证实Lv-SR-BI-shRNA慢病毒载体构建成功并获得HEK293T细胞中包装的慢病毒,Lv-SR-BI-shRNA重组慢病毒感染Huh7和Huh7.5.1细胞,感染组SR-BI mRNA转录降低,蛋白表达降低.结论 建立了SR-BI表达抑制的人肝癌细胞株Huh7-siSR-BI和Huh7.5.1-siSR-BI稳定细胞系.
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短发夹状RNA干扰窖蛋白-1表达对人肝细胞增殖的影响
目的 探讨体外下调窖蛋白-1(Cav-1)的表达对人肝细胞增殖的影响.方法 构建Cav-1特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载体psiRNA-CAV1,转染人正常肝细胞系(CHL),抗菌素Zeocin筛选单克隆细胞株,建立Cav-1低表达的人肝细胞模型(CAV7).四甲基偶氮唑盐法检测Cav-1下调对肝细胞增殖的影响,Western blot检测Erk1/2和Akt等增殖生长相关信号蛋白表达和活性的变化. 结果 正常肝细胞有高水平的Cav-1表达,稳定转染psiRNA-CAV1后,Cav-1表达减少约70%;Cav-1表达下调后,肝细胞的增殖先变快(24 h和72 h,P＜0.05;96 h,P＜0.01),后减慢;增殖相关蛋白p-Akt和p-Erk1/2的表达减少,即Akt和Erk1/2两条通路受到抑制. 结论 Cav-1可能在正常肝细胞的增殖中起重要作用.
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短发夹状RNA抑制survivin基因在肝癌细胞中的表达
目的构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721中对survivin基因表达的抑制作用. 方法设计、合成两对survivin编码基因的反向重复序列,中间分别间隔4和8个nt,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建pshRNA-survivin 1和pshRNA-survivin 2重组质粒,与表达survivin基因的质粒pEGFP-C1-survivin共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721,荧光显微镜下观察融合蛋白中GFP的表达以分析pshRNA-survivin对survivin基因表达的抑制作用. 结果酶切分析和测序证实pshRNA-survivin 1和pshRNA-survivin 2构建成功;两组shRNA对survivin的表达均有明显的抑制作用,抑制率达80%以上;两重组质粒在HepG2和SMMC-7721两种细胞中抑制目的基因的作用无明显差异;反向重复序列中间隔4或8个nt构建的shRNA,对抑制目的基因的表达无显著差异. 结论构建的pshRNA-survivin重组质粒能有效抑制survivin 基因在肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721中的表达.
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shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达
目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)的短发夹状RNA(shRNA),观察其在哺乳动物细胞中抑制外源GFP的表达.方法:设计、合成含GFP编码基因片段,中间被4个bp间隔的反向重复序列,与转录载体pTZU6+1连接,构建pshRNA-GFP重组质粒,与pEGFP-C1共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721,检测其对GFP表达的影响.结果:pshRNA-GFP对共转染的pEGFP-C1中的绿色荧光蛋白有明显的抑制作用,抑制率达70%～85%.结论:构建的pshRNA-GFP重组质粒能有效地抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达.
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RNA干扰Hsp70基因表达抑制胃癌细胞增殖
目的 构建Hsp70的短发夹状RNA(shRNA),检测其在胃癌细胞株SGC-7901中对Hsp70基因表达的抑制作用以及对肿瘤细胞增殖的影响.方法 根据Hsp70编码基因,设计并合成2对反向重复序列,同时设计1对与目的 基因不相匹配的重复序列作为对照组分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建重组质粒phspl-siRNA,phsp2-siRNA及对照组质粒phsp3-siRNA,分别转染胃癌细胞株SGC-7901,采用RT-PCR和Western blot检测phsp-siRNA对Hsp70基因表达的抑制作用.利用AlamarBlue法检测转染后对胃癌细胞生长的影响.结果 酶切电泳分析和DNA测序证实重组质粒phsp-siRNA构建成功;证实phsp1-siRNA和phsp2-siRNA对内源性Hsp70基因的表达有明显的抑制作用,同时phsp1-siRNA和phsp2-siRNA转染组细胞的生长较对照组受到明显抑制.结论 构建的重组质粒phsp1-siRNA和phsp2-siRNA能特异而有效抑制内源性Hsp70基凶在SGC-7901细胞中的表达,并对细胞生长有明显抑制作用.
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shRNA沉默VEGF基因表达对大肠癌细胞生物学特性的影响
目的观察Pavu6+27-VEGF siRNA重组体在细胞体内表达的VEGF短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.方法将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到大肠癌HCT116细胞株中,以空质粒Pavu6+27转染为对照,经G418筛选出稳定表达shRNA细胞,行RT-PCR检测VEGF-mRNA表达的改变,Western blot检测VEGF蛋白表达,流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果成功转染重组体的HCT116细胞中VEGF-mRNA表达明显下降,约降低为对照组的61.2%(P＜0.05).VEGF蛋白表达明显下降,光密度分析比较差异有显著性(P＜0.05).G0/G1期细胞比例增高,另一方面S期和G2/M期细胞比例降低,细胞的增殖指数明显降低,实验组细胞增殖指数为(25.63±4.54)%,对照组细胞的增殖指数为(31.90±2.19)%(P＜0.05).结论Pavu6+27-VEGF siRNA重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能有效抑制人大肠癌细胞VEGF-mRNA和VEGF蛋白表达,细胞增殖能力减弱,为质粒介导的RNAi技术运用于大肠癌的基因治疗提供一定的实验依据.
