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粉尘螨种群的时空动态及抽样技术研究
目的：了解芜湖地区粉尘螨的种群数量消长动态及其空间分布型。方法2012年11月至2013年10月选择芜湖市某面粉厂，每月5、15、25号定点采集样本，测定并记录温度和相对湿度，鉴定及计数。采用8种聚集度指标和6种回归模型确定粉尘螨种群的空间分布型和理论抽样数，并制定序贯抽样模型。结果粉尘螨种群数量高峰期出现在6月下旬和9月中旬，其空间分布特征为聚集分布，3～11月，其聚集由本身特性与环境因素导致；12月下旬至2月上旬，其聚集由环境因素导致。由各回归模型相关系数r知，兰星平C＇-m模型、张连翔Z-V模型和兰星平La-m模型为粉尘螨的佳模型。适抽样数公式：N＝t2D2[1．863m ＋0．073]，序贯抽样模型：T0（n），T1（n）＝20n ±1．96√37．26n＋29．2。结论粉尘螨在该面粉厂仓库中种群消长曲线呈双峰型，其空间格局是以个体群为基本成分呈聚集分布，且密度越高，聚集度越大。
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粉尘螨滴剂治疗尘螨过敏性支气管哮喘疗效观察
目的：观察粉尘螨滴剂舌下含服进行特异性免疫治疗儿童过敏性支气管哮喘的疗效。方法：选择2012年1月-2013年6月在笔者所在医院儿科过敏门诊诊断为支气管哮喘的患儿49例，粉尘螨过敏的患儿且愿意接受粉尘螨滴剂的患儿为治疗组，给予粉尘螨滴剂舌下含服进行特异性免疫治疗；以另40例儿童过敏性哮喘同时粉尘螨过敏且不愿接受特异性免疫治疗者作为对照组。治疗组与对照组仍按照GINA方案治疗，治疗组同时加用粉尘螨滴剂舌下含服6个月。6个月后对每个患儿治疗前后进行哮喘日间症状及夜间症状评分并进行比较。结果：入组时两组的日夜间评分哮喘症状评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗组在进行舌下含服脱敏治疗6个月后日、夜间症状评分显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：粉尘螨滴剂舌下含服进行特异性免疫治疗儿童粉尘螨过敏性支气管哮喘有明显效果。
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粉尘螨变应原第5组分单克隆抗体的制备与鉴定
本研究制备并鉴定了鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb).将质粒pET28a(+)Der f 5转化ArcticExpress (DE3)感受态细胞,取单个菌落接种培养,加入IPTG诱导表达,经纯化获得Der f 5重组蛋白.利用Der f 5重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏细胞与其骨髓瘤细胞融合.通过间接ELISA法筛选特异性分泌抗体的杂交瘤细胞.用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化.通过间接ELISA、Western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性.终获得3株稳定分泌鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的高效价单克隆抗体.研究分析表明该3株单抗均能识别重组Der f 5蛋白和天然的粉尘螨提取物.本实验成功制备了3株鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der f 5检测及纯化方法奠定了基础.
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粉尘螨Derf2蛋白抑制Foxp3对小鼠弥漫大B细胞淋巴瘤的影响
探讨粉尘螨重组Derf2蛋白对小鼠Treg及特异性标记Foxp3蛋白的干扰作用,从而为粉尘螨抗原治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)提供基础实验支持.通过免疫组化检测Foxp3蛋白在DLBCL患者淋巴结石蜡标本中的表达,利用临床数据对Foxp3蛋白在DLBCL的表达与预后情况进行分析.提取粉尘螨重组Derf2蛋白对A20细胞进行干预,检测A20细胞内Foxp3蛋白表达及对细胞增殖能力的影响.建立小鼠DLBCL成瘤动物模型,对模型鼠注射粉尘螨相关抗原,对比各组动物模型的成瘤时间、成瘤速度及成瘤体积.结果显示,免疫组化检测Foxp3蛋白在DLBCL中的表达,发现瘤组织中Foxp3蛋白表达高于瘤旁组织(P＜0.05),通过与DLBCL患者临床病理学特征之间关系的分析,得出瘤组织内Foxp3蛋白的高表达是患者预后不良的因素.注射了粉尘螨抗原的小鼠成瘤速度及体积明显下降(P＜0.05),瘤内Foxp3蛋白表达较未注射Derf2减少(P＜0.05).这表明Foxp3蛋白在DLBCL患者体内高表达为预后不良因素之一,粉尘螨Derf2对肿瘤Foxp3蛋白的表达能起干扰作用,并抑制体内肿瘤的生长.
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CRTH2+CD4+T细胞在特应性皮炎儿童外周血中的表达和意义
探讨CRTH2+ CD44T细胞在特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)儿童外周血中的比例变化及意义.选取2015年6月至2015年10月间我院皮肤科门诊就诊的AD患儿22例和同龄正常对照组儿童30例,采用流式细胞术检测两组儿童外周血中CRTH2+CD4+T细胞的比例和该细胞分泌的IL-4、IFN-γ水平;采用粉尘螨刺激PBMC,利用CCK 8增殖试验结合流式细胞术检测两组CRTH2+ CD4+T细胞的比例变化.结果显示,AD组儿童外周血中CRTH2+ CD4+T细胞比例明显高于对照组(P＜0.05),且在AD组中这一比例大小与血清IgE浓度呈正相关(r=0.602,P＜0.05);CRTH2+CD4T细胞主要分泌IL-4,基本不分泌IFN-γ;粉尘螨刺激后,PBMC中CRTH2+ CD4+T细胞比例升高,并且AD组的刺激前后细胞比例差值明显高于对照组(P＜0.05),提示CRTH2+ CD4+T细胞参与了儿童特应性皮炎的发病过程.
关键词： 特应性皮炎 CRTH2+CD4+T细胞 粉尘螨 儿童 -
粉尘螨-壳聚糖疫苗经鼻免疫治疗小鼠过敏性哮喘的实验研究
探讨粉尘螨壳聚糖疫苗经鼻粘膜免疫治疗过敏性哮喘的疗效.用粉尘螨(Dermatophagoides farinae,Df)提取液致敏、激发BALB/c小鼠,复制哮喘模型,24只BALB/c小鼠随机分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、粉尘螨对照组(C组)粉尘螨-壳聚糖疫苗治疗组(D组).检测各组气道高反应性;通过HE(haematoxylin and eosin)染色观察小鼠肺部炎症;观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF、脾细胞培养上清的细胞因子和血清中Df特异性的IgE、IgG2a抗体.粉尘螨和粉尘螨-壳聚糖疫苗治疗组肺部变态反应性炎症病理变化较模型组明显减轻,气道高反应性Penh值下降;BALF中的细胞总数、嗜酸粒细胞(EOS)计数、IL-4、血清抗原特异性IgE抗体和脾细胞分泌IL-4均明显低于模型组,而且总体作用粉尘螨壳聚糖疫苗治疗组要强于粉尘螨对照组.粉尘螨-壳聚糖疫苗经鼻腔免疫可以治疗小鼠过敏性哮喘,且作用强于单独应用粉尘螨的对照组.
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变应原皮肤点刺试验在变应性鼻炎中的临床意义
目的:探讨皮肤点刺试验在变应性鼻炎患者中的临床意义.方法:用20种不同的变应原进行皮肤点刺试验,生理盐水为阴性对照,组胺为阳性对照.结果:在200例变应性鼻炎患者中,对粉尘螨和屋尘螨变应原呈阳性反应者分别占50%;对13种变应原的阳性反应分别占2%～10%;对其余5种变应原的反应均阴性.选择对螨变应原阳性的50例患者进行脱敏治疗,疗效满意.结论:皮肤点刺试验为变应性鼻炎的特异性脱敏治疗提供可靠的实验依据,也为治疗后的疗效评定提供客观指标.
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重组粉尘螨变应原第2组分的研究概况
尘螨是常见的室内变应原来源之一,约80％以上尘螨过敏性疾病患者血清螨特异性IgE可与尘螨变应原第2组分结合.粉尘螨变应原第2组分Der f 2为螨体的组织成分,被认为是诱导哮喘与变态反应性疾病的重要变应原之一.近年来,变态反应性疾病的发病率呈现逐年增高的趋势,而重组变应原在过敏性疾病诊断和治疗中具有独特的优势和前景,故正日益成为此领域中研究的热点之一.该文就Der f2的生物学特征、重组变应原的制备、免疫学效果及其在特异性免疫诊治中的应用前景予以综述.
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白细胞介素-33在过敏性哮喘小鼠体内的变化及作用
目的 探讨白细胞介素-33(IL-33)在粉尘螨1类变应原(Der f 1)诱导的过敏性哮喘小鼠中的变化及作用.方法 将40只雌性BALB/c小鼠用随机数字表法分为哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和阴性对照组(PBS组),每组10只.哮喘组、免疫治疗组和抑制剂组分别在第0、7和14天腹腔注射100μ]粉尘螨变应原提取液(含100 μg/ml Der f 1),抑制剂组小鼠同时注射抑制剂(可溶性ST2 100μl,用于抑制IL-33),PBS组注射等量PBS.第21天起,各组小鼠雾化吸入粉尘螨变应原提取液(0.5 μg/ml),30 min/次,1次/d,连续7d.免疫治疗组小鼠第25天起于雾化前0.5 h,分别用200μl的Der f 1蛋白溶液(100 μg/ml)腹腔注射进行免疫治疗,PBS组用PBS代替粉尘螨变应原.第27天雾化吸入后24 h处死小鼠,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和眼球血,并对BALF中嗜酸粒细胞进行计数,制作肺组织病理切片.ELISA法检测BALF中IL-5、IL-13和γ干扰素(IFN-γy)的含量及血清中特异性IgE和IgG2a水平.结果 除PBS组小鼠外,其他组小鼠自第21天开始出现不同程度的哮喘症状.自第25天开始,免疫治疗组小鼠的哮喘症状开始缓解.哮喘组和PBS组小鼠BALF中嗜酸粒细胞总数分别为(4.41±0.36)×105/ml和(0.37±0.08)×105/ml,两组差异有统计学意义(t=24.50,P＜0.01);免疫治疗组和抑制剂组小鼠的嗜酸粒细胞总数分别为(1.43±0.14)×105/ml和(2.73±0.33)×105/ml,均明显低于哮喘组(F=129.72,P＜0.01).ELISA检测结果显示,哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组BALF中IFN-γ的水平分别为(83.06±11.38)、(277.97±22.46)、(175.13±13.41)和(224.77±19.97) pg/ml,免疫治疗组和抑制剂组均明显高于哮喘组(t=17.31,t=11.71,P＜0.01).哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组小鼠BALF中IL-5水平分别为(208.64±11.55)、(106.87±11.39)、(140.71±14.58)和(90.15±9.49) pg/ml,哮喘组的水平明显高于其他各组(F=97.19,P＜0.01).哮喘组和免疫治疗组BALF中IL-13水平分别为(308.37±13.67) pg/ml和(175.66±11.79) pg/ml,两者差异有统计学意义(P＜0.01);抑制剂组小鼠的为(221.12±21.08) pg/ml,明显低于哮喘组(t=16.44,P＜0.01);PBS组为(97.57±18.38) pg/ml.免疫治疗组与哮喘组相比,小鼠肺部炎性症状均减轻,几乎无炎症细胞.抑制剂组小鼠的支气管周围也有嗜酸粒细胞增多症、上皮细胞脱落和支气管上皮细胞肥大,但较哮喘组要减轻许多.血清IgE抗体水平的检测结果显示,哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组分别为(31.97±3.48)、(12.86±2.22)、(18.43±2.30)和(9.68±1.27) IU/ml,免疫治疗组和抑制剂组均低于哮喘组(t=-7.77,P＜0.01).IgG2a抗体水平的变化和IgE相反,哮喘组、免疫治疗组和PBS组分别为(26.94±2.96)、(35.06±2.57)和(10.31±1.48) μg/ml,免疫治疗组高于哮喘组(t=6.55,P＜0.01).结论 ELISA检测结果表明IL-33/ST2信号通路在小鼠过敏性哮喘中发挥着重要的作用.
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粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达
目的 获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒.方法 参考GenBank登录号为AY283295的Der f8部分序列设计并合成引物.以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段.采用5'cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序.根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序.将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coliBL21,异丙基-3-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物.采用生物信息学软件预测Derf 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树.结果 以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600bp;5'RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确.SDS-PAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(Mr)为81 000,与预期大小一致.序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(GenBank登录号为AY283295)同源性为98.49％,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45％)、延伸主链(11.26％)和无规卷曲(43.29％).系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇. 结论 获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒.
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Th17细胞及其细胞因子白细胞介素-17在粉尘螨致敏哮喘小鼠中的变化
目的 探讨Th17细胞及其细胞因子白细胞介素-17 (IL-17)在粉尘螨致敏哮喘小鼠中的变化及其意义. 方法 20只BALB/e小鼠随机均分为哮喘组和健康对照组.哮喘组小鼠于第0、7和14天每鼠腹腔注射200μl致敏液[含粉尘螨粗浸液提取物50μg,Al (OH)32 mg]致敏.末次免疫后1周采用粉尘螨粗浸液提取物连续进行滴鼻激发,每天1次,每次50μg,激发7次,健康对照组给予等体积的PBS[含Al (OH)3 2 mg]处理.末次激发后24 h内处死小鼠,取血清和肺泡灌洗液,无菌取脾脏.ELISA检测血清中IgG1、IgE和肺泡灌洗液中IL-17的含量;流式细胞仪检测脾脏中Th17细胞百分率. 结果 哮喘组小鼠血清中IgG1和IgE水平分别为(0.10±0.01) pg/ml和(1.15±0.10) pg/ml,高于健康对照组的(0.06±-0.01) pg/ml和(0.04±0.01)pg/ml (P＜0.05);哮喘组小鼠肺泡灌洗液IL-17水平(85.13±2.36) pg/ml高于健康对照组(48.27±4.14) pg/ml (P＜0.01);哮喘组小鼠脾脏Th17细胞百分率(5.19±0.68)％高于健康对照组(0.95±0.19)％(P＜0.01),且脾脏Th17细胞百分率与肺泡灌洗液中IL-17水平呈正相关(r=0.851,P＜0.01). 结论 粉尘螨致敏哮喘小鼠较健康小鼠肺泡灌洗液IL-17水平和脾脏Th17细胞数量均升高.
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粉尘螨Ⅲ类重组变应原对哮喘小鼠免疫治疗的效果
目的 探讨粉尘螨Ⅲ类重组变应原(rDer f3)对过敏性哮喘小鼠的免疫治疗效果. 方法 随机将40只BALB/c小鼠均分为4组,哮喘组、免疫治疗组、卵清蛋白(OVA)组和PBS组,分别在第0、第7和第14天哮喘组和免疫治疗组每鼠经腹腔注射100 μl致敏液(含rDerf 3 10 μg);卵清蛋白组每鼠经腹腔注射100 μl致敏液(含OVA 10 μg);PBS组则以PBS代替致敏液.第21天起,哮喘组和免疫治疗组小鼠用rDerf3进行滴鼻激发试验,连续7d,免疫治疗组小鼠在第25 ～27天滴鼻激发前30 min,用100 μg rDerf3纯化蛋白皮下注射进行特异性免疫治疗.PBS组和卵清蛋白组则分别用PBS和OVA进行滴鼻激发和腹腔注射,后1次滴鼻激发24 h后脱臼处死小鼠.收集各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞和嗜酸粒细胞计数;对肺组织病理切片进行HE染色,镜下观察肺组织炎症细胞浸润情况.ELISA检测BALF和脾细胞培养上清(SSCS)中白细胞介素-5(IL-5)和y干扰素(IFN-y)及血清中变应原特异性IgE、IgG2a抗体水平. 结果 肺组织病理切片结果显示,免疫治疗组小鼠炎症反应明显减轻.小鼠BALF中白细胞总数在免疫治疗组、卵清蛋白组和哮喘组分别为(7.03±1.38)×108/ml、(22.11±3.70)×108/ml和(22.75±3.24)×108/ml,免疫治疗组低于卵清蛋白组和哮喘组(P＜0.01),嗜酸粒细胞的变化趋势与白细胞类似.免疫治疗组、卵清蛋白组和哮喘组BALF中IL-5的水平分别为(108.20±11.02) pg/ml、(182.04±13.94) pg/ml和(19533±1533) pg/1ml,SSCS中IL-5的水平分别为(98.34±13.06) pg/ml、(208.26±10.63) pg/ml和(179.54±13.65) pg/ml,免疫治疗组均明显低于卵清蛋白组和哮喘组(P＜0.01).而IFN-y含量则高于卵清蛋白组和哮喘组(P＜0.01).IgE水平免疫治疗组、卵清蛋白组和哮喘组分别为(9.12±3.78) IU/ml、(26.87±4.30) IU/ml和(35.25±8.84) IU/ml,与卵清蛋白组和哮喘组相比,免疫治疗组明显降低(P＜0.01),而IgG2a水平(38.52±6.33) μml则显著升高(P＜0.01). 结论 粉尘螨Ⅲ类变应原可逆转哮喘小鼠的变态反应性气道及肺部炎症.
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粉尘螨变应原Der f 1 mRNA对小鼠特异性免疫治疗的实验研究
目的 探讨粉尘螨变应原Derf1mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果.方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组(10只/组),分别为PBS组、Derf1变应原致敏组、Derf1变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Derf1 mRNA免疫治疗组.分别于第0、第7和第14天,PBS组小鼠腹腔注射PBS,其余4组小鼠则腹腔注射10 μgDer f 1进行致敏,建立小鼠哮喘模型.自第21天起,除PBS组小鼠雾化吸入PBS,其他4组小鼠均雾化吸入100 μg/mlDerf1变应原,30 min/次,1次/d,连续7d,观察并记录小鼠哮喘发作情况.5组小鼠于后1次雾化吸入致敏2周后,背部皮下分别注射100 μl PBS、1μg Derf1(维持致敏)、10 μg Derf1(免疫治疗)、2μg β-actin mRNA和2μg Derf1mRNA,1次/周,连续3周.后1次皮下注射后2周处死小鼠.收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)和白介素13 (IL-13)水平,并计数嗜酸粒细胞(EOS);收集各组小鼠脾组织,分离脾细胞,除PBS组外,其他4组均加入10 μg/ml Der f 1培养72 h,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-13水平;取各组小鼠眼球血,ELISA法检测血清中总IgE以及变应原特异性IgE (sIgE)、IgG1(sIgG1)和IgG2a (sIgG2a)抗体水平.HE染色观察各组小鼠肺组织切片. 结果 除PBS组外,其他4组小鼠雾化吸入致敏后,均出现急性哮喘发作症状.小鼠BALF中,Derf 1 mRNA免疫治疗组和Derf 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(897.56±105.73)和(864.48±70.62) pg/ml,均明显高于Derf 1变应原致敏组[(209.05±52.28) pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(219.47±64.72) pg/ml](P＜0.01);两者IL-13水平分别为(241.64±31.41)和(321.94±41.07) pg/ml,则明显低于Derf1变应原致敏组[(520.62±43.77) pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(507.22±42.26) pg/ml] (P＜0.01);两者EOS数量分别为(1.33±0.44) ×105和(1.48±0.39) ×105个/ml,均明显低于Derf1变应原致敏组[(3.54±0.52) ×105个/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(2.98±0.53)×105 个/ml](P＜0.01).脾细胞培养上清的ELISA检测结果显示,Derf 1 mRNA免疫治疗组和Derf 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(420.91±69.92)和(334.92±43.72) pg/ml,明显高于Derf1变应原致敏组[(123.75±15.48) pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(128.84±59.00) pg/ml](P＜0.01);两者IL-13水平[(268.51±40.42)和[(285.26±62.21) pg/ml]则显著低于Derf1变应原致敏组[(613.89.±.51.54) pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(524.05±39.12) pg/ml] (P＜0.01).血清中抗体水平的ELISA检测结果显示,Derf 1 mRNA免疫治疗组的总IgE、sIgE和sIgG1抗体水平分别为(33.72±9.78)、(22.76±8.09)和(17.87±7.59) ng/ml,均显著低于Derf1变应原致敏组[(94.34±11.66)、(65.67±9.47)和(75.18±9.52)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(86.48±10.26)、(62.36±8.35)和(69.51±8.98) ng/ml] (P＜0.01);其sIgG2a抗体水平为(7.74±0.88) ng/ml,则明显高于Derf1变应原致敏组[(2.81±1.17) ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(1.06±0.11) ng/ml](P＜0.01).肺组织切片HE染色镜检结果显示,与Derf1变应原致敏组相比,Derf1 mRNA免疫治疗组小鼠的气道上皮和肺泡上皮细胞结构基本完整,炎症细胞浸润明显减少.结论 Derf1mRNA疫苗可有效纠正Th1/Tn2失衡.
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粉尘螨第7类变应原(Der f 7)基因的克隆表达及免疫学特性鉴定
目的 克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性. 方法 提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RT-PCR)克隆Der f 7基因.将测序正确的目的片段克隆至pET-32a表达载体,得到的重组质粒pET-32a-Der f 7在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,蛋白质印迹(Western Blotting)分析重组蛋白的免疫原性. 结果 RT-PCR结果显示,Der f 7基因片段大小约为650 bp.测序结果表明,Der f 7基因片段与已发表的粉尘螨Der f 7基因(登录号为FJ436108)同源性为99％.SDS-PAGE结果显示,重组质粒pET32a-Der f 7在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为23000.Western Blotting分析结果表明,Der f 7重组蛋白可被尘螨过敏患者血清识别. 结论 成功构建了粉尘螨第7类变应原的原核表达载体,并获得具有免疫原性的Derf7重组蛋白.
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他克莫司滴鼻治疗过敏性哮喘小鼠的实验研究
目的 探讨免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)滴鼻疗法对过敏性哮喘小鼠的治疗效果和机制. 方法 将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,分别为阴性对照组(A组)、模型对照组(B组)、低剂量治疗组(C组)和高剂量治疗组(D组).除A组外,其他各组在第0、7和14天分别用50 μg粉尘螨变应原提取液+2 mg氢氧化铝腹腔注射小鼠致敏,A组腹腔注射等量生理盐水.自第28天开始,乙醚麻醉小鼠后,A、B、C和D组分别用100μl生理盐水、PBS、0.01％他克莫司和0.1％他克莫司滴鼻治疗,连续治疗7 d,1次/d,每次治疗同时用50μl(1 mg/ml)粉尘螨变应原滴鼻激发1次.末次激发后24h,检测小鼠的气道高反应性;末次激发后48h,处死小鼠,行支气管肺泡灌洗,无菌摘取肺组织和脾脏.记录支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸粒细胞数.ELISA法检测BALF和脾细胞培养上清的白介素4(IL-4)、IL-5和γ干扰素(IFN-γ)水平.通过苏木素-伊红染色(HE)和阿尔辛蓝(AB)染色观察小鼠肺部炎症和杯状细胞黏液分泌情况. 结果 与B组相比,D组气道高反应性显著降低(P＜0.05),肺部病理改变(炎症细胞浸润和黏液分泌)明显减轻.D组的BALF中细胞总数[(29.9±5.2)×104/ml] (P＜0.05)和嗜酸粒细胞数[(4.3±0.8)x104/ml] (P＜0.01)均比B组[分别为(59.3 ±6.0)×104/ml和(22.7±5.7) x104/ml]显著减少.D组BALF中IL-4[ (22.49±4.96) pg/ml] (P＜0.05)、IL-5[ (43.90±13.15) pg/ml] (P＜0.01)和IFN-γ[ (10.17±1.09) pg/ml] (P＜0.05)均显著低于B组[分别为(57.02±7.38)、(133.49±15.63)和(15.32±3.23) pg/ml].D组的脾细胞培养上清中IL-4[(22.54±4.58) pg/ml]、IL-5[ (36.31±20.85) pg/ml]和IFN-γ[(11.28±1.79) pg/ml]亦显著低于B组[分别为(56.34±6.21)、(72.32±6.23)和(18.82±1.88) pg/ml](均P＜0.05).整个实验中,C组与B组均无明显差异. 结论 他克莫司对粉尘螨致敏小鼠具有一定免疫治疗作用,可能与其抑制T淋巴细胞因子分泌有关.
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两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定
目的 原核表达尘螨1类变应原(粉尘螨1类变应原Derfl和户尘螨1类变应原Derpl基因)的嵌合基因R8,并检测其生物活性. 方法 以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板,用Derfl的特异性引物进行PCR扩增,产物经酶切后与载体pET28a(+)连接,连接产物转入大肠埃希菌(E.coli) BL21感受态细胞,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测；纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清(IgE)的结合能力,同时以重组rDerf 1和rDerp 1蛋白作为对照.为检验嵌合蛋白R8的免疫原性,将75只BALB/c小鼠随机均分为5组,分别为PBS组(阴性对照组)、rDerf1组、rDerp 1组、R8组和哮喘组(阳性对照组).除PBS组外,其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射(0.1μ/μl)粉尘螨注射液100μl,第21～27天每鼠每天雾化吸入0.5μg/ml粉尘螨注射液悬浊液,30 min/d.rDerf1组、rDerp 1组和R8组于第25～27天雾化前30 min,分别腹腔注射100μg/ml的rDerf1、rDerp 1和R8蛋白各200 μl进行特异性免疫治疗,PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸入.所有小鼠于第27天雾化吸入后24 h气管切开,用1 ml PBS进行肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液(BALF),检测γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的水平. 结果 SDS-PAGE结果显示,R8表达产物的蛋白相对分子质量(Mr)约为35000.ELISA检测结果显示,嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为(37.03±12.46) μg/ml,显著低于rDerf1[ (80.44±15.50) μg/ml]和rDerp 1[(90.79±10.38) μg/ml](P＜0.01).动物实验结果显示,R8组IFN-γ水平[(343.43±38.79) pg/ml]与rDerf1组[(322.98±30.36) pg/ml]和rDer p 1组[(314.97±33.89) pg/ml]的相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)；与PBS组[(393.93±50.68) pg/ml]和哮喘组[(208.44±46.11) pg/ml]相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).R8组IL-4水平显著低于其他各组水平(P＜0.05或0.01). 结论 表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8.
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粉尘螨壳聚糖纳米疫苗舌下含服对哮喘小鼠的治疗作用
目的 制备粉尘螨(Dermatophagoides farinae)壳聚糖纳米疫苗,并观察其免疫治疗哮喘小鼠的效果.方法 采用离子凝胶法制备粉尘螨壳聚糖纳米疫苗.30只BALB/c小鼠随机均分为5组,阴性对照组(A组)用生理盐水处理,其余组用50μg粉尘螨粗提液+2mg氢氧化铝腹腔注射致敏,第28天开始分别用PBS(B组,模型组)、空白壳聚糖(C组)、粉尘螨变应原(Der f)组(D组,1mg/次)和粉尘螨壳聚糖纳米疫苗(DCN)(E组,负荷1 mg Der f的DCN/次)舌下含服免疫18次,每次间隔1 d,末次免疫后1周用50μg粉尘螨变应原滴鼻激发,每天1次,连续7次.末次激发后24 h检测小鼠的气道高反应性;末次激发后48 h处死小鼠,取血,行肺泡灌洗,无菌摘取肺组织和脾脏;计数小鼠肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸粒细胞数,观察BALF和脾细胞上清中IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子水平,血清中IgE、IgA和IgG2a抗体水平;运用HE染色观察肺部炎症细胞的浸润程度,运用MTT法检测脾细胞的淋巴细胞增殖反应,计算刺激指数(SI).结果 与B组相比,D、E组气道高反应性和肺部病理改变减轻.D组(36.50×104/ml,3.72×104/ml)和E组(34.25×104ml,2.25×104/ml)的BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞数显著少于B组(61.67×104/ml,14.17×104/ml)(P＜0.05).与B组(IgE:0.39,IgA:0.79)相比,D组和E组血清中抗原特异性IgE抗体水平(D:0.22,E:0.22)显著降低,而IgA抗体水平(D:0.88,E:1.03)显著升高.D组和E组的BALF中IL-4水平(D:28.49 pg/ml,E:20.93 pg/ml)和脾细胞分泌的IL-4(D:27.82pg/ml,E:20.80pg/ml)水平均显著低于B组(56.33pg/ml,45.84pg/ml)(P＜0.05).而BALF中的IFN-γ(D:18.80 pg/ml,E:37.32 pg/ml)、IL-10(D:118.90pg/ml,E:129.15 pg/ml)水平显著高于B组(13.60 pg/ml,29.61 pg/ml)(P＜0.05);脾细胞分泌的IFN-γ(D:20.68 pg/ml,E:42.42 pg/ml)、IL-10(D:36.31 pg/ml,E:161.37 pg/ml)水平亦显著高于B组(13.50 pg/ml,22.52 pg/ml)(P＜0.05).与B组(SI:0.23)相比,D组(SI:0.14)和E组(SI:0.13)的淋巴细胞增殖反应明显抑制.而C组(SI:0.22)对致敏小鼠无明显疗效.结论 粉尘螨壳聚糖纳米疫苗对致敏小鼠具有免疫治疗作用.
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粉尘螨3类变应原基因的克隆、表达、纯化与变应原性鉴定
目的 克隆表达粉尘螨3类变应原(Derf3)基因,并鉴定纯化蛋白的变应原性.方法 取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨(约500只)提取总RNA,经RT-PCR扩增Derf3基因.将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质pET-Derf3.大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,表达Derf3目的蛋白.重组rDerf3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,蛋白质印迹法(Western blotting)分析该纯化Derf3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE反应性,以鉴定重组Derf3的变应原性.结果 以粉尘螨总RNA为模板克隆出Derf3基因,该基因与GenBank(D63858)公布的Derf3比较有4个核苷酸差异,但同源性为99.5%.E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后高效表达Derf3重组蛋白,主要以包涵体形式存在.经Western blotting分析该重组蛋白Derf3能与粉尘螨过敏患者血清的IgE反应,而不与健康者血清IgE反应.结论 构建了华南地区粉尘螨3类变应原的原核表达载体,并高效表达和纯化出具变应原性的Derf3重组蛋白.
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粉尘螨6类变应原(Der f6)的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定
目的 构建粉尘螨6类变应原(Dermatophagoides farinae,Der f6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析.方法 根据Der f6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli Top10),经PCR和酶切鉴定并测序.将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,经纯化后连接并转化至E.coli Top10.构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至E.coli BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白.结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6.SDS-PAGE结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(Mr)为31 000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带.该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性.结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6.
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上海市居室尘螨变应原浓度初步检测
目的检测上海市居室尘螨变应原浓度.方法 应用层析介质及蛋白质沉淀技术从螨代谢分泌物中分离、纯化粉尘螨变应原Dff F3及国际公认的变应原Der fⅢ,经临床检测和放射性变应原吸附实验(RAST)鉴定其变应原性.制备抗Dff F3和Der fⅢ IgG,从室内收集尘埃,分离尘螨抗原,夹心ELISA测定尘螨变应原Dff F3和Der fⅢ浓度.结果 Dff F3和Der fⅢ呈现强致变应性,均能与尘螨过敏哮喘患者血清IgE结合.检测200份家庭尘埃样品尘螨变应原,结果显示,Dff F3浓度>10 μg/g的家庭占57.0%,2～10 μg/g的家庭占29.5%,<2 μg/g的家庭占13.5%.Der fⅢ浓度>10 μg/g的家庭占53.5%,2～10 μg/g的家庭占32.0%,<2 μg/g的家庭占14.5%.结论 上海市部分居室尘螨变应原浓度偏高.粉尘螨Dff F3有较强的变应原性.
