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OCT4异构体在人胚胎干细胞和间充质干细胞中的表达
目的 比较OCT4异构体(OCT4A、OCT4 B、OCT4 B1)及其调控因子在人胚胎干细胞(hESC)和人间充质干细胞(hMSC)中的表达.方法 利用RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞分析及体内/外分化实验,鉴定hESC及hMSC的生物学特性;应用real-time PCR、Western blot和流式细胞分析比较OCT4异构体及其转录因子NANOG,SOX2和mRNA结合蛋白LIN28在hESC及hMSC中的表达水平.结果 OCT4异构体mRNA在hESC和hMSC中均有表达,在hESC中的表达显著高于在hMSC中,并以OCT4A的差别为显著(P＜0.01);在蛋白水平,hESC表达OCT4A和OCT4B-256aa,hMSC不表达OCT4异构体蛋白.hESC高表达OCT4的调控因子NANOG、SOX2和LIN28;hMSC低表达SOX2,不表达NANOG和LIN28.结论 NANOG、SOX2和LIN28调控OCT4的表达,OCT4异构体在hESC和hMSC中的表达差异提示其可能是不同发育阶段于细胞自我更新和分化潜能等方面差别的主要因素之一.
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HLA-G 与慢性炎症性疾病的研究进展
非经典人类白细胞抗原G（ human leukocyte an-tigen-G， HLA-G）是机体内重要的免疫耐受分子，经选择性剪切可产生4种膜结合型 HLA-G 蛋白（ mHLA-G，HLA-G1～G4）和3种可溶型HLA-G蛋白（ sHLA-G， HLA-G5～G7）。相对于 HLAⅠ类分子，HLA-G具有有限的基因多态性，且存在多个位点和sHLA-G表达水平显著相关，其中研究多的是14 bp插入／缺失等位基因多态性（14 bp＋／-多态性）。当HLA-G基因为14 bp插入纯合子时，外显子8起始区的一个92 bp片段将被剪切，从而有助于HLA-G mRNA转录水平更稳定。但HLA-G转录水平与蛋白表达存在不均一性，中国汉族人种基因型为14 bp＋／＋人群外周血 sHLA-G 较14 bp＋／-、14 bp-／-人群外周血sHLA-G分泌水平显著降低，进一步提示HLA-G 14 bp＋／-多态性在sHLA-G分泌过程中发挥了至关重要的作用［1］。
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Klotho在CKD-MBD及急性肾损伤中的新认识
Klotho基因是Kuro[1]等于1997年发现的与衰老有关的新基因,并用古希腊神话中纺织生命之线女神的名字命名.Klotho基因被敲除的小鼠(kl-/-小鼠)可出现类似人类衰老的各种表型,如寿命缩短、听力下降、不育症、动脉硬化、软组织钙化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿等.1 klotho基因及蛋白Klotho基因长50kb,由5个外显子和4个内含子组成.其表达的蛋白在人和小鼠中均有膜结合型和分泌型两种形式,分泌型的量明显高于膜结合型,但在大鼠中尚未发现有分泌型klotho蛋白的基因结构.klotho基因5个外显子全部表达则产生由1,012个氨基酸(小鼠)或1,014个氨基酸(人和大鼠)组成的膜结合型klotho蛋白[2].膜结合型klotho蛋白的特点是:胞外段较长、胞内段和跨膜区较短.klotho蛋白胞外区可被解聚素-金属蛋白酶(a disintegrin and metal]oproteinase,ADAM)水解.分泌型蛋白含有549个氨基酸,不含kl 2胞外区、跨膜区和胞内区.循环中的klotho蛋白可以来源于klotho基因选择性转录、mRNA选择性剪切而生成的可溶性型klotho,也可来源于被ADAM水解脱落的膜型klotho蛋白的胞外部分[3].
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血管内皮生长因子分子多样性及其与肿瘤的关系
血管内皮生长因子是肿瘤发生发展过程中起重要作用的一类糖蛋白,其在基因水平存在较多的SNP位点以及在RNA剪切水平上存在选择性剪切.研究表明,这些变异与各种肿瘤的发生、发展、恶性程度有着密切的关系.
关键词： 血管内皮生长因子 单核苷酸多态性(SNP) 选择性剪切 RNA编辑 -
用支持向量机预测人类基因5'/3'选择性剪切位点
选择性剪切是调解基因表达的重要机制.识别选择性剪切位点是后基因组时代的一个重要工作.本文从新的EBI人类基因选择性剪切数据库中,选取5'/3'选择性剪切位点作为正集,选取在剪切位点附近的假剪切位点作为负集,并把所有的选择性剪切位点和假剪切位点随机分成训练集和测试集.本文选用的预测选择性剪切位点的方法是基于位置权重矩阵和离散增量的支持向量机方法.此方法仅基于训练集,以不同位点的单碱基概率和序列片断的三联体频数作为信息参数,利用位置权重矩阵和离散增量算法结合支持向量机,得到了选择性供体位点和受体位点的分类器,并用此分类器对测试集中的选择性供体位点和受体位点进行预测.对独立测试集中的选择性供体位点和选择性受体位点的预测成功率分别为88.74%和90.86%,特异性分别为85.62%和81.19%.本文预测选择性剪切位点的方法成功率高于其它选择性剪切位点预测方法预测成功率,此预测方法进一步提高了对选择性剪切位点的理论预测能力.
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单核细胞向巨噬细胞分化过程中CD44 mRNA表达和黏附功能的变化
目的 探讨单核细胞向巨噬细胞分化过程中CD44 mRNA表达和黏附功能的变化.方法 应用豆蔻佛波醇乙酯(PMA)诱导单核细胞系U937向巨噬细胞分化;应用RT-PCR分析U937细胞CD44 mRNA表达变化,并以β-actin作为内参进行半定量评价,并对主要条带进行测序;应用荧光染料BCECF/AM作为探针,测定黏附于激活的内皮细胞上的U937细胞数目.结果 与对照组比较,PMA诱导的U937细胞CD44 mRNA总体表达显著增加(P=0.01037),异构体/标准CD44比例显著上升(P=0.0005551),测序结果显示PMA刺激后显著增加的是947 bp(V8+V9+V10)和1 208 bp(V7+V8+V9+V10)CD44异构体.同时.PMA刺激后U937细胞黏附功能显著增加(P=0.0029).结论 单核细胞向巨噬细胞分化过程中CD44 mRNA,特别是947bp(V8+V9+V10)和1 208 bp(V7+V8+V9+V10)CD44异构体的表达显著增加,可能与细胞黏附功能的增强相关.
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REST及其剪切变体REST4在肿瘤中的研究进展
抑制元素l-沉默转录因子(repressor element 1-silencing transcription factor,REST)又称为神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor,NRSF),是神经元特异性表达的负向调控因子,存在广泛的选择性剪切现象.REST及其剪切变体REST4在不同类型肿瘤中发挥重要作用,在胶质瘤、髓母细胞瘤等神经性肿瘤中REST可作为致癌因子,而在结肠癌、肺癌、乳腺癌等上皮性肿瘤中REST作为抑癌因子发挥肿瘤抑制作用.本文就REST及其剪切变体REST4在肿瘤中的研究进行综述.
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Fyn诱导Bcl-X选择性剪切调控胰腺癌细胞凋亡的机制研究
目的:明确非受体酪氨酸激酶Fyn在胰腺癌侵袭转移中的作用;探究Fyn是否参与Bcl-X基因的选择性剪切的调控,并阐明其分子机制.方法:对三种侵袭转移能力不同的胰腺癌细胞进行Fyn激酶活性测定,明确Fyn活性与胰腺癌侵袭转移能力之间的关系.将携带激酶活性缺失的KD-Fyn(KinaseDead-Fyn)的腺病毒转染BxPC3胰腺癌细胞,Transwell侵袭实验、TUNEL法分别检测抑制Fyn活性前后BxPC3侵袭能力以及凋亡水平的改变.RT-PCR检测Bcl-X基因两种剪切体比例的变化.结果:转染KD-Fyn以后,Fyn激酶活性明显下降,降低至正常水平的1/2以下.抑制Fyn活性,转染组穿膜细胞数由原来的108± 14降为54±7,明显降低了BxPC3胰腺癌细胞侵袭运动能力,促进凋亡.RT-PCR证实,抑制Fyn活性明显改变了凋亡相关基因Bcl-X的选择性剪切方式.Bcl-X(s)/Bcl-X(L)的剪切比例由0.57±0.08改变为2.12±0.15.在裸鼠成瘤实验中,转染Fyn的裸鼠成瘤能力为100％(12/12),而转染KD-Fyn的裸鼠成瘤能力降低为16.7％ (2/12),抑制Fyn活性可以明显抑制BxPC3胰腺癌细胞在裸鼠中的成瘤能力.结论:抑制Fyn的激酶活性,可以下调胰腺癌细胞的侵袭转移能力,而这种作用是通过影响Bcl-X基因选择性剪切方式改变,进而影响胰腺癌细胞凋亡实现的.
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核内不均一性核糖核蛋白A2/B1在胰腺癌中的表达及其对B细胞淋巴瘤/白血病-X选择性剪切的调控机制
目的 探讨核内不均一性核糖核蛋白(hnRNP) A2/B1作为下游靶蛋白参与Fyn诱导的胰腺癌细胞B细胞淋巴瘤/白血病-X(bcl-X)选择性剪切调控的作用及其机制.方法 通过免疫组织化学方法观察28例胰腺癌标本hnRNP A2/B1的表达,并探讨其与胰腺癌临床病理参数之间的关系.通过RNA-免疫共沉淀技术,探讨受Fyn活性调控的hnRNP A2/B1的下游靶基因.通过改变hnRNP A2/B1的表达,观察对bcl-X选择性剪切的影响.结果 28例胰腺癌组织标本中有23例出现hnRNP A2/B1的表达,表达水平与胰腺癌TNM分期(R =0.854,P＜0.05)、是否发生远处转移(R =0.698,P＜0.05)相关等因素有关.RNA-免疫共沉淀证实,hnRNP A2/B1能够与BxPC3细胞中bcl-X基因的Pre-mRNA结合.hnRNP A2/B1表达水平的改变参与BxPC3胰腺癌细胞中bcl-X两种剪切体比例的调控.结论 hnRNP A2/B1的表达水平与胰腺癌组织侵袭转移能力密切相关;hnRNPA2/B1可以与胰腺癌细胞中bcl-X基因结合,从而影响bcl-X选择性剪切.
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鼻咽癌抑瘤基因NOR1第2外显子选择性剪切异构体在组织和细胞中的分布规律
目的:研究NOR1基因全长及第2外显子选择性剪切异构体在人细胞系和组织中的分布规律以及NOR1蛋白全长及剪切异构体的亚细胞定位模式.方法:以人胎脑cDNA文库质粒为模板,PCR扩增NOR1基因开放阅读框(open reading frame,ORF),酶切后连接pCMV/myc载体.以pCMV/myc-NOR1(isoform 1)质粒为标准品,采用Real-time RT-PCR方法检测NOR1 mRNA在人胚胎组织和成人睾丸组织中的表达.用RT-PCR方法扩增NOR1基因第2外显子两侧序列片段,测序分析NOR1 isoform 1和isoform 2 mRNA在细胞和组织中的分布;PCR方法扩增细胞系NOR1第2外显子基因组序列,测序检测第2外显子gDNA序列.将pCMV/myc-NOR1(isoform 1)和pCMV/myc-NOR1(isoform 2)质粒转染细胞,采用免疫荧光方法观察两种异构体在细胞内定位模式.结果:从人胎脑cDNA文库克隆得到NOR1基因全长ORF(isoform 1)和遗漏第2外显子的剪切异构体(isoform 2).Real-time RT-PCR检测发现成人睾丸组织NOR1 mRNA表达水平高,胚胎鼻咽、气管、脑、肾组织有中等水平表达,其他组织表达较低.RT-PCR结合测序检测发现表明睾丸、鼻咽、气管、肾等16种组织仅表达isoform 2;而脑组织同时检测到NOR1 isoform 1和isoform 2 mRNA,以isoform 2为主.NP69,HNE1等细胞系仅表达遗漏第2外显子的isoform 2,所有检测的细胞系基因组DNA无第2外显子缺失.免疫荧光检测发现NOR1 isoform 1和isoform 2编码蛋白在细胞内定位模式相似.结论:克隆得到NOR1基因全长和遗漏第2外显子的剪切本.Isoform 2是NOR1基因在组织和细胞系中的主要表达形式,NOR1 isoform 1仅表达于脑组织.第2外显子对NOR1蛋白的细胞内定位模式没有影响.
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大鼠耳蜗α1D L-型电压门控钙通道组织特异性异构体的剪切方式及其意义
目的研究α1D L-型电压门控钙通道基因在大鼠耳蜗的剪切( splicing )方式及其意义.方法以显微解剖取材的大鼠耳蜗基底膜为起始材料,利用外显子特异性(exon- specific)引物的RT-PCR扩增和序列测定确定耳蜗表达的α1D L-型电压门控钙通道的剪切方式.结果耳蜗表达的α1D钙通道cDNA剪切部位发生在功能域Ⅰ、Ⅱ之间的细胞内连接区和羧基末端.结论大鼠耳蜗存在α1D钙通道组织特异性的剪切异构体,选择性剪切可能是内耳基因表达调控的重要机制.
关键词： 耳蜗 α1D L-型电压门控钙通道 选择性剪切 RT-PCR 长距离RT-PCR
