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  • RI-1对MSH2缺陷结直肠癌细胞系的杀伤作用

    作者:孔祥玉;王爽;王彦;徐畅;王芹;刘强;杜利清

    目的探讨RAD51抑制剂RI-1对MSH2缺陷结直肠癌细胞系的杀伤作用及可能的作用机制.方法Western blot法筛选MSH2差异表达的结直肠癌细胞系,MTT法检测不同结直肠癌细胞系对RI-1(10、20、30、40 或50 μmol/L)的敏感性;构建针对MSH2基因的重组shRNA慢病毒表达载体并感染HT29细胞.RI-1(40 μmol/L)处理细胞,流式细胞术检测细胞凋亡的变化;单细胞凝胶电泳实验分析细胞内DNA损伤情况;细胞免疫荧光法检测γ-H2AX foci的形成.结果与对照组相比MSH2缺陷的HCT8细胞有明显细胞凋亡现象(P<0.01);HCT8细胞和HT29 Shmsh2细胞尾部DNA含量、尾长和尾距均较对照组明显增加(P<0.05);HCT8细胞和HT29 Shmsh2细胞内γ-H2AX foci的形成数量较对照组明显增加(P<0.01).结论RAD51抑制剂RI-1可能通过增加细胞内DNA损伤参与RI-1对MSH2缺陷肿瘤的杀伤作用.

  • 表观遗传学干预对结直肠癌细胞株p33ING1b基因表达及生物学特性影响

    作者:钟武;李天煜;张磊昌;钟世彪;何纯刚;陈利生

    目的 通过表观遗传学干预,研究p331NG1b启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态、基因和蛋白的表达及其细胞增殖能力的改变,探讨结直肠癌中p33ING1b转录抑制的表观遗传机制.方法 通过曲古抑菌素A及5-氮-2'-脱氧胞苷,对结直肠癌细胞株HT29、LOVO、HCT116和COLO205行恢复乙酰化和去甲基化干预,分单独用药组和联合用药组.RT-PCR结合Rea1-time qPCR方法检测其p33ING1b mRNA表达的变化,nMSP法分析其p33ING1b启动子甲基化状态的改变,ChIP法检测其p33ING1b乙酰化状态的改变,蛋白质印迹法检测p33ING1b蛋白的表达,MTT法检测细胞的增殖能力.结果 曲古抑菌素A及5-氮-2 '-脱氧胞苷可逆转结直肠癌细胞株的甲基化及乙酰化状况.2种药物干预后,4种结直肠癌细胞株各组间p33ING1bmRNA表达,差异有统计学意义,HCT116:F=1 690.446,P<0.001;HT29:F=284.474,P<0.001;LOVO:F=2 930.284,P<0.001;COLO205:F=33.540,P<0.001;p33ING1bmRNA蛋白表达差异有统计学意义,HCT116:F=32.606,P<0.001; HT29:F=33.422,P<0.001;LOVO:F=13.975,P<0.01;COLO205:F=7.119,P<0.05,细胞增殖能力差异有统计学意义,HCT116:F=7.327,P<0.05; HT29:F=17.642,P<0.001;LOVO:F=7.035,P<0.05; COLO205:F=9.008,P<0.01.联合使用两种药物对p33ING1bmRNA的表达具有协同作用.结论 p33ING1b基因甲基化和去乙酰化可抑制抑癌基因p33ING1b转录,使用甲基化抑制剂及去乙酰化抑制剂可逆转这一效应,且两者具有协同作用,这为表观基因治疗提供了新的思路.

  • 西妥昔单抗对125Ⅰ粒子照射结直肠癌细胞DNA修复能力和信号传导通路的影响

    作者:刘敬佳;王俊杰;赵勇;王皓;曲昂;李金娜

    目的 探讨西妥昔单抗(C225)对125Ⅰ粒子照射下结直肠癌CL187细胞DNA损伤修复和信号传导通路的影响.方法 实验分为空白对照组,100 nmol/L C225处理组,单独125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组和C225联合125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组.在吸收剂量达4 Gy后48 h,经细胞免疫荧光检测各组细胞中γH2AX聚集点数量以及γH2AX聚集点阳性细胞比例.提取细胞内总蛋白,Western blot检测DNA修复蛋白的变化.在吸收剂量达4 Gy后即刻提取总蛋白,Western blot分析在照射过程中C225对EGFR下游信号通路中蛋白分子的影响.结果 与单独125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组细胞相比,C225联合125Ⅰ持续低剂量率照射组细胞内残余的γH2AX聚集点数量和γH2AX聚集点阳性的细胞比例均高(t=8.0和6.8,P<0.05),并且细胞中DNA修复蛋白Ku70和DNA-PKcs的含量偏低(t=6.6和5.7,P<0.05).Western blot结果显示,在125Ⅰ粒子持续低剂量率照射过程中,C225能够降低细胞内EGFR的水平(t=4.9,P<0.05),抑制Akt的活化(t=5.5,P<0.05).结论 在125Ⅰ放射性粒子持续低剂量率照射下,C225可以降低细胞内Ku70和DNA-PKcs的含量,并抑制Akt活化,减弱CL187细胞的DNA损伤修复能力.

  • 西妥昔单抗增加结直肠癌细胞对125I粒子持续低剂量率照射的敏感性

    作者:刘敬佳;王皓;曲昂;李金娜;赵勇;王俊杰

    目的 探讨在125I放射性粒子持续低剂量率照射下,西妥昔单抗对结直肠癌细胞CL187放射敏感性的影响及可能的机制.方法 实验将直肠癌细胞CL187分为空白对照组、单纯100 nmol/L C225处理组、单纯125I-CLDR照射组和C225联合125I-CLDR组.克隆形成实验检测C225是否影响人结直肠癌CL187细胞对125I放射性粒子持续低剂量率照射的放射敏感性.流式细胞仪检测C225对125I-CLDR照射诱导的细胞凋亡的影响.细胞周期检测C225对细胞周期的调节.瑞氏姬姆萨染色检测有丝分裂指数.Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2的水平.结果 100 nmol/LC225的放射增敏比为1.4,并能够增加125I-CLDR照射诱导的细胞凋亡(=6.6,P<0.05),增加Bax/Bcl-2比值.与空白对照组相比,单独C225处理可使CL187细胞G1期阻滞(t=3.0,P<0.05),单纯125I-CLDR照射组细胞也存在G1期阻滞(t=8.5,P<0.01),两者联合时的G1期阻滞效应与125I-CLDR单独处理时相比,差异无统计学意义(t=0.8,P>0.05).有丝分裂指数检测结果显示,各实验组与对照组相比差异无统计学意义.结论 C225可增加结直肠癌细胞CL187对125I-CLDR照射的放射敏感性,机制可能是C225增加细胞内Bax/Bcl-2比值,增加125I-CLDR诱导的细胞凋亡,与细胞周期阻滞和细胞周期检查点功能无关.

  • Survivin靶向siRNA抑制结直肠癌细胞增殖作用的研究

    作者:李加生;房修椢

    目的 分析Survivin靶向siRNA抑制结直肠癌细胞增殖的作用.方法 将结直肠癌Lovo细胞株进行培养及转染,采用Western blot法、RT-PCR法对Survivin的表达进行检测,应用MTT法对siRNA抑制细胞增殖的作用进行检测.结果 Survivin靶向小干扰RNA抑制结直肠癌SW480细胞株mRNA的构成比为37.1%,抑制结直肠癌SW480细胞株蛋白表达的构成比为45.3%,12h对结直肠癌SW480细胞的抑制率为23.8%,24 h对结直肠癌SW480细胞的抑制率为30.2%,36 h对结直肠癌SW480细胞的抑制率为35.2%,48 h对结直肠癌SW480细胞的抑制率为38.5%,72 h对结直肠癌SW480细胞的抑制率为39.6%,均显著高于阴性对照组(P均<0.05).结论 Survivin靶向siRNA抑制结直肠癌细胞增殖的作用显著.

  • 阿司匹林在结直肠癌中预防治疗的研究进展

    作者:李雪靖;王梅

    阿司匹林为三大经典用药之一,其主要药理作用为解热镇痛,在临床上也常用于心血管疾病方面.而近些年来,有越来越多的证据表明阿司匹林可预防结直肠癌,并且美国预防服务指南已经将阿司匹林作为预防结直肠癌预防药物,因此,阿司匹林在预防结直肠癌中的疗效得到肯定,但是其治疗剂量、治疗时间以及其作用机制均还有待进一步的研究.本文对阿司匹林的治疗疗程和作用机制进行综述,以便为其在临床上的应用提供一定的依据.

  • 过表达Oct4B1诱导结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化

    作者:陈奕霖;文坤明;胡水清;陈正权;曾庆良

    目的:探讨Oct4B1基因过表达是否诱导人结直肠癌SW480细胞发生上皮间质转化(EMT)及其可能的机制.方法:用带G418抗性的Oct4B1基因过表达质粒及阴性对照质粒转染人结直肠癌SW480细胞株,分别称为实验组(SW480-Oct4B1)及对照组(SW480-NC),转染成功后用G418筛选建立稳定转染的细胞株,对两种稳定转染细胞进行如下检测:① RT-qPCR检测Oct4B1的mRNA水平;②划痕实验和Transwell小室实验检测迁移和侵袭能力;③Western blot检测EMT相关标记物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达;④RT-qPCR和Western blot检测EMT转录因子Twist的mRNA及蛋白表达. 结果:稳定转染细胞株建立后,实验组与对照组比较:Oct4B1基因表达水平明显升高(P<0.01);细胞迁移明显增强(P<0.01);细胞侵袭能力明显提高(P<0.01);上皮标记物E-cadherin蛋白表达量明显下降(P<0.01);而间质标记物N-cadherin及Vimentin蛋白表达量明显上调(P<0.01);Twist 的mRNA及蛋白表达量均明显升高(P<0.01).结论:过表达Oct4B1基因可诱导人结直肠癌SW480细胞发生EMT,增强细胞迁移及侵袭能力,其分子机制可能与提高Twist表达有关.

  • 几种靶向抑制整合素αvβ3多肽的设计及活性比较

    作者:杨利军;卢培芬;陈俊俊;代洁;康志明;李雅惠;杨涛

    目的 设计6种靶向抑制整合素αvβ3的多肽,并对其活性进行初步评估.方法 根据锯鳞血抑肽空间结构及相关技术方法,设计6种含RGD环(即精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列)的多肽,分别编码为cEchi-L-1、cEchi-L-2、Ω-Echi、Echi-L、cEchi-M、cEchi.经高效液相法(HPLC)进行纯化;Western blot法检测不同结直肠癌细胞中整合素αvβ3的表达,选择出表达量较高的细胞;MTT法对多肽活性进行初步评估.结果 纯化后6种多肽纯度均>95%.HCT 116细胞中整合素αvβ3的表达较高.多肽cEchi-L-1及cEchi-L-2对HCT 116细胞具有一定的抑制效果,IC50分别为59.92和18.33 μmol/L.结论 筛选获得了两条具有一定抗肿瘤活性的多肽,且锯鳞血抑肽C-末端序列的活性及RGD环之间的氨基酸数量可能影响多肽的抗肿瘤活性.

  • 常见结直肠癌无线粒体DNA细胞株的建立

    作者:吴晓邡;闫秋;戴小珍;孟秋丽;姜鹤群

    目的:流行病学研究表明结直肠癌细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数变异与患者预后具有显著相关性,但因缺乏相关体外细胞模型导致其细胞生物学效应及具体分子机制尚不明确.因此研究建立结直肠癌ρ0细胞株(无mtDNA)的方对该研究域具有重大意义.方法:在合有丙酮酸、尿苷及不同浓度溴化乙锭的培养基中培养大肠癌细胞株SW480、HCT 116、HCT-8,以不加溴化乙锭的细胞为对照,利用实时定量PCR技术监测不同处理组mtDNA拷贝数的变化,并观察结直肠癌ρ0细胞线粒体形态数目及细胞形态的变化.结果:SW480细胞用50 ng/mL EB处理25代后,再以100 ng/mL EB处理14代可成功构建SW480ρ 0细胞株;HCT116细胞加用EB 100 ng/mL培养32代,继续用EB 200 ng/mL培养10代,再用EB 500 ng/mL培养3代,可成功获得HCT116ρ 0细胞株;HCT-8细胞用200 ng/mL EB培养24代,可成功获得HCT-8ρ 0细胞株.同时,ρ0细胞较亲本细胞变大变长,其线粒体的个数增多,线粒体形态变大变长.结论:利用EB处理法可成功构建大肠癌ρ0细胞株,但不同肠癌细胞方法不尽相同.mtDNA拷贝数的降低可显著影响大肠癌细胞的形态.

  • EGCG通过抑制谷氨酰胺代谢通路抑制结直肠癌细胞的生长的实验研究

    作者:李哲;钱佳乐;向敏;林芳

    目的:探讨茶多酚中主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对结直肠癌DLD-1细胞的增殖影响及其与谷氨酰胺代谢通路的关系.方法:用CCK8试剂盒检测不同浓度EGCG对DLD-1细胞增殖的影响,并用Western blot方法检测凋亡蛋白的表达水平.进而分别用外源补充谷氨酰胺、添加谷氨酰胺酶抑制剂CB-839等方法探讨EGCG的作用机理与路径.结果:EGCG在一定程度上可以抑制结直肠癌DLD-1细胞的增殖并且引起该细胞凋亡,同时,外源补充谷氨酰胺可削弱EGCG的作用,而用谷氨酰胺酶抑制剂CB-839抑制谷氨酰胺的代谢,则加剧EGCG对DLD-1细胞的生长抑制作用.同时,实验发现EGCG可以使谷氨酰胺脱氢酶的活力下降.结论:EGCG可通过抑制细胞谷氨酰胺的代谢而诱导肿瘤细胞发生凋亡.

  • 黄芪多糖对HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响

    作者:王旗;吴成声;李辉;许业传

    目的:研究黄芪多糖对人结直肠癌HCT116细胞侵袭和迁移能力的影响,并初步探讨其作用机制.方法:体外培养人结直肠癌HCT116细胞,分别以0.0、0.1、0.2,0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的黄芪多糖干预HCT116细胞24 h,采用MTT法检测HCT116细胞的存活情况.采用0.0、0.1和0.6 g/L黄芪多糖作用HCT116细胞24 h后,Transwell和划痕实验检测侵袭和迁移能力,采用Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达水平.结果:黄芪多糖能够剂量依赖性抑制HCT116细胞增殖.0.6 g/L黄芪多糖处理HCT116细胞24 h后,细胞侵袭和迁移能力,MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均显著下降(P<0.05).结论:黄芪多糖能够抑制HCT116细胞侵袭和迁移,其作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达有关.

  • RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达

    作者:王海波;隋爱华;赵萍;杨堃;代明营;刘相萍

    目的 探讨RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达.方法 设计合成4对靶向RhoA与RhoC基因的各两对寡核苷酸序列,退火后分别克隆入shRNA表达载体;通过一系列的酶切与连接,将该4段干扰片段串联起来,构建一个同时表达4个shRNA的重组质粒.经酶切和测序鉴定重组质粒.脂质体法转染HCT116,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各细胞中RhoA、RhoC mRNA的表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pGenesil2.7-A1+A2+C1+C2构建成功.转染该重组质粒后细胞中RhoA、RhoC mRNA的表达水平分别为(0.78±0.11)和(0.90±0.21),明显低于空白对照组(0±0.15、0±0.09)和阴性对照组(-0.05±0.12、0.11±0.10,P<0.05),且细胞的生长增殖率(63.8±12.5)%也显著低于对照组和质粒对照组(101.6±13.7)%(P<0.05).结论 成功构建4个shRNA串联的重组表达载体,该载体可在体外高效表达.

  • SDF-1/CXCR4对结直肠癌肝转移瘤表达乙酰肝素酶的影响

    作者:杨春康;黄小荣;应敏刚

    目的 研究基质细胞衍生因子1 (stromal cell derived factor-1,SDF-1)对高表达趋化因子受体CXCR4的结直肠癌Lovo细胞表达乙酰肝素酶(heparanase,HPA)的影响,并探讨SDF-1/CXCR4轴对裸鼠结直肠癌肝转移瘤模型中乙酰肝素酶表达的影响.方法 分别用SDF-1和SDF-1/CXCR4的拮抗剂AMD3100处理直肠癌Lovo细胞,运用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测结直肠癌细胞HPA的表达;建立裸鼠结直肠癌肝转移瘤模型,检测AMD31 00干预和非干预组转移瘤细胞中HPA蛋白的表达.结果 (1)结直肠癌Lovo细胞经不同浓度(50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml)SDF-1处理后,HPA mR-NA的表达量逐渐增高.用相同浓度SDF-1分别处理直肠癌Lovo细胞12h和24h后,其HPA的表达量随作用时间的延长而增高.在相同作用时间内,其HPA的表达量随SDF-1作用浓度(50 ng/ml、1 00ng/ml、200 ng/ml)的升高而增高.(2)SDF-1处理组HPA的mRNA和蛋白表达水平均高于SDF-1+AMD3100处理组和对照组.(3)肝脏转移瘤中HPA的表达量随AMD31 00治疗剂量的增高而降低.结论 (1)SDF-1可刺激结直肠癌Lovo细胞HPA表达增加,并且这一效应与SDF-1的浓度和作用时间有关.(2) AMD3100能有效抑制SDF-1刺激结直肠癌细胞表达HPA,使得肿瘤细胞侵袭能力下降,从而起到抑制肿瘤转移的作用.

  • Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

    作者:杨慧;张超;陆滟霞;吴小金;袁理;周畅;周春平;刘国炳;李学农

    目的 构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因.方法 扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性.流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达.结果 质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功.荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关.双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的31UTR.稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降.结论 成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因.

  • Netrin-1及其受体DCC基因在6种结直肠癌细胞中的表达差异及意义

    作者:张旭;纳玮;王丹妮;黄琦;王立斌

    目的:研究Netrin-1、DCC基因在6株不同类型和来源的体外培养结直肠癌细胞mRNA及蛋白水平的表达差异.方法:CCK8检测6株不同来源结直肠肿瘤细胞的生长曲线,以正常肠上皮细胞NCM460为对照;Real-Time PCR和Western blot分别检测Netrin-1、DCC基因在6株结直肠癌细胞内的mRNA和蛋白水平的表达.结果:与对照组相比,结直肠肿瘤细胞株可见DCC、Netrin-1基因及蛋白的异常表达;DCC表达在6株结直肠肿瘤细胞株中均表达下调,其中SW620、LOVO、LS174T细胞株内DCC表达下调差异显著,有统计学意义(P<0.05);Netrin-1在6株结直肠肿瘤细胞株中均表达上调,其中SW620、LOVO、LS174T细胞株内Netrin-1表达上调差异显著,有统计学意义(P<0.05);6株结直肠肿瘤细胞株之间DCC、Netrin-1也存在差异表达.结论:DCC、Netrin-1在结直肠肿瘤内异常表达,与肿瘤的发展和转移相关,DCC和Netrin-1在同一细胞株内表达呈负相关,DCC蛋白的下调和失活可能与Netrin-1有关.

  • 黏细菌代谢产物NX52和NX83对结直肠癌细胞增殖的影响

    作者:阎立昆;张欣;张浔;王军;万一;苏春;姚建锋;毛智军

    目的 研究两种黏细菌代谢产物(NX52和NX83)对人结直肠癌细胞增殖的影响,探讨其可能的作用机制.方法 用不同浓度(0.1 mg/mL、1.0 mg/mL和10.0 mg/mL)的黏细菌代谢产物分别处理结直肠癌细胞HT-29、SW480和SW1463,阴性对照组的肿瘤细胞不加黏细菌代谢产物,采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测其对结直肠癌细胞的增殖抑制效应,采用细胞形态学及流式细胞术观察细胞凋亡情况.结果 两种代谢产物NX52及NX83均对人结直肠癌细胞HT-29、SW480和SW1463的细胞增殖有抑制作用(P<0.05),且呈时间剂量效应;代谢产物NX83对肿瘤细胞增殖抑制作用较NX52更明显(P<0.05);与阴性对照组相比,代谢产物NX83作用SW1463细胞48 h后凋亡率明显增加(P<0.01).结论 黏细菌代谢产物NX52和NX83具有体外抗癌活性,作用机制可能是通过诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞.

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