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NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫感染免疫效应中的作用
目的探讨NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫(P.b)感染免疫效应中的作用. 方法每只BALB/c小鼠接种5×105个感染P.b 的RBC,分组后分别给予5 mg/d NO合成酶选择性抑制aminoguanidine、0.03 μg/d IL-12和aminoguanidine联合IL-12 处理.观察各组小鼠原虫血症变化及生存时间.感染第5 d收集小鼠血清进行NO水平测定. 结果 aminoguanidine联合IL-12处理组小鼠的原虫血症水平与单独IL-12组差异不明显,却使小鼠生存率显著降低;IL-12联合aminoguanidine处理组较单独aminoguanidine及感染对照组原虫血症达峰值的时间显著推迟,小鼠存活时间明显延长.IL-12处理小鼠血清NO水平显著上升;给予aminoguanidine后的小鼠血清NO含量较低,与感染对照组水平接近. 结论 aminoguanidine能有效的抑制IL-12诱导的NO的产生,显著降低IL-12处理小鼠生存率,但对原虫血症水平无明显影响.因此,IL-12抗P.b感染的免疫保护作用部分依赖NO介导,且NO的作用可能并非是NO对疟原虫的直接杀伤.
关键词： 白细胞介素12 疟原虫 伯氏 NO合成酶选择性抑制剂 一氧化氮 -
伯氏疟原虫CSP基因N端蛋白靶向肝细胞的研究
目的 研究伯氏疟原虫CSP基因的N端蛋白与小鼠肝细胞膜HPSGs受体结合后在体外、体内的肝组织靶向性.方法 将伯氏疟原虫CSP基因N端片段(PbCSP-N)克隆入原核表达质粒pET-28a,经IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析纯化后采用Western blot方法鉴定;采用Pull-down方法检测PbCSP-N蛋白与小鼠肝细胞表面受体硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan,HSPG)的结合力;应用免疫组化、放射性碘标记示踪方法检测该蛋白在体外、体内特异性靶向小鼠肝组织作用.结果 成功构建PbCSP-N原核表达质粒并表达、纯化出PbCSP-N重组蛋白(15 ku),Pull-down方法证实该蛋白可与小鼠肝细胞膜HPSGs受体结合,免疫组化试验显示该重组蛋白定位于正常小鼠肝细胞膜,表明该蛋白可特异结合正常小鼠肝细胞膜;放射性碘(125I)标记示踪显示,标记的重组蛋白在注射1、2、4、6、12 h后在小鼠肝脏分布较多,表明该重组蛋白可靶向正常小鼠肝组织.结论 伯氏疟原虫CSP基因N端蛋白与肝细胞膜HPSGs受体结合后在体内、外靶向肝细胞,可作为肝细胞靶向性药物候选分子.
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小鼠感染伯氏疟原虫后TLR2、9、11及其下游因子表达量的变化
目的 了解小鼠感染伯氏疟原虫后Toll样受体(TLRs)的免疫作用. 方法 用伯氏疟原虫感染小鼠,采用RT-PCR、ELISA等方法测定TLRs的mRNA和下游炎症因子血清水平. 结果 小鼠感染伯氏疟原虫后TLR2、9、11的mRNA分别升高3、3.5和6倍；在感染后96 h,IL-6、TNF-α及IL-12均达到峰值,分别为10 023 U/ml、485 pg/ml和186 pg/ml；IL-18持续升高,在144 h为4 225 pg/ml. 结论 小鼠感染伯氏疟原虫后TLRs mRNA表达上调,并增强下游炎症因子的表达.
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IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠淋巴细胞增殖活性的影响
目的探讨IL-12对伯氏疟原虫(P.b)红内期感染小鼠淋巴细胞增殖活性的影响.方法每只BALB/c小鼠接种5×105个感染P.b的RBC,同时每天分别给予0.03或0.15 μg IL-12处理,用3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞增殖转化活性,流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群CD4+与CD8+百分比.结果每天给予0.03或0.15 μg IL-12处理,均可显著增加P.b感染小鼠脾淋巴细胞数量及CD4+、CD8+数.每天给予0.03 μg IL-12可显著促进脾淋巴细胞的增殖转化,而每天给予0.15 μg IL-12则明显抑制脾淋巴细胞增殖.结论适当低剂量IL-12可促进P.b感染小鼠脾淋巴细胞增殖活性,增强机体抗感染免疫,而较大剂量IL-12则抑制脾淋巴细胞增殖活性,甚至可致免疫病理损害.
关键词： 白细胞介素12(IL-12) 疟原虫 伯氏 脾淋巴细胞增殖 -
伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子的表达和纯化
目的表达和纯化伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子(PbMIF). 方法根据GenBank中PbMIF mRNA的预测序列,设计特异引物,采用RT-PCR方法从伯氏疟原虫ANKA株红内期RNA扩增获得PbMIF基因.将PbMIF基因与T载体连接并测序,利用NCBI中Blast程序分析测序结果.阳性T/A克隆质粒经BamH I和XhoI双酶切后,将目的片段克隆至原核表达载体pET28a,并转化大肠埃希菌BL21(DE3),收集经IPTG诱导表达的细菌进行SDS-PAGE分析,并对表达产物进行亲和纯化.结果从伯氏疟原虫RNA中扩增到PbMIF cDNA,长度为351 bp,编码116个氨基酸.测序结果显示,其核苷酸序列与GenBank中PbMIF cDNA的预测序列完全一致,编码的氨基酸在一级结构上与恶性疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子(PfbbMIF)的同源性为76%,与人类和小鼠MIF的同源性为31%.表达产物为可溶性的PbMIF蛋白,亲和纯化后的PbMIF蛋白纯度为71%.结论表达并纯化出可溶性PbMIF蛋白,为进一步研究疟原虫的生物学特性奠定了物质基础.
关键词： 疟原虫 伯氏 巨噬细胞移动抑制因子 基因表达 -
肿瘤坏死因子α与一氧化氮在脑型疟疾发病中的作用
目的 研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)与一氧化氮(NO)在脑型疟疾(cerebral malaria,CM)发病中的作用. 方法 建立C57BL/6J小鼠CM动物模型,按文献方法检测发病过程中血清及脑组织TNF-α、NO及一氧化氮合酶(NOS)含量,同时观察地塞米松及NO合成抑制剂L-硝基精氨酸(L-NNA)对血清和脑组织中TNF-α和NO浓度的影响. 结果 CM模型组小鼠均发生CM,地塞米松组、L-NNA组小鼠及感染对照组小鼠至感染后第10 d均未发生CM;CM模型组小鼠发病时脑组织、血清TNF-α、NO、NOS及脑组织含水量均高于感染第5 d(P＜0.01);CM模型组小鼠发病时和感染后第5 d脑组织及血清TNF-α、NO、NOS和脑组织含水量均高于正常对照组及感染对照组 (P＜0.01);地塞米松组小鼠感染后第5 d及第10 d与同时间CM模型组比较,脑组织、血清TNF-α和脑组织含水量均显著下降 (P＜0.01);L-NNA组与CM模型组比较,脑组织及血清NO、NOS、脑组织含水量均显著降低 (P＜0.01). 结论 CM症状可能与小鼠脑组织NO过量有关,TNF-α主要通过NO起作用.使用地塞米松和L-NNA可降低体内NO浓度,预防CM发生.
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瑞香素结构衍生物体内外抗疟活性的研究
目的 通过体外试验和鼠疟(Plamodium berghei)动物模型观察瑞香素结构衍生物的抗疟作用.方法 通过光学显微镜镜检和微量荧光法两种体外筛选系统筛检瑞香素类衍生物对恶性疟原虫(Plamodium falciparum)的体外抗疟作用;对体外筛检抗疟活性高的化合物,采用WHO推荐的"四天抑制试验"测定其对鼠伯氏疟原虫(ANKA株)的抗疟作用.结果 通过体外筛选系统筛选出DA78与DA79两种新型的瑞香素类抗疟化合物,两者的IC50分别为7.6 μmol/L和1.4 μmol/L,其体外抗疟活性与瑞香素在同一统计学水平(P＞0.05);体内试验伯氏鼠疟原虫ANKA株感染鼠,DA78 1、10、50、75 mg/kg·d×4 d剂量组D4减虫率与空白对照组比较差异有显著性(P＜0.01),而DA79 50或75 mg/kg·d×4 d剂量组D4减虫率与对照组相比较差异有显著性(P＜0.05),DA78 10或75 mg/kg·d×4 d剂量组D4减虫率高于同剂量的瑞香素组(P＜0.05).结论 以DA78与DA79为代表的瑞香素类衍生物作为一类新型的抗疟化合物,在体外和体内试验中均显示出一定的抗疟活性,为寻求更有效的抗疟化合物提供了方向和理论依据.
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中药复合汤剂对伯氏疟原虫的杀伤及对宿主免疫的调控作用
目的 研究新型中药制剂对疟原虫的杀伤及对宿主的免疫影响.方法 用伯氏疟原虫感染昆明小鼠,建立动物模型.设置四组,分别为阴性对照组、阳性对照组、青蒿素治疗组、中药治疗组,感染相同剂量疟原虫后第3d开始给药.每日测量小鼠体温;同时取血制片,染色后镜检,记录红细胞染虫率.治疗后第5d抽取小鼠血液,分离血液淋巴细胞,采用MTT法检测T、B细胞成活率;分离血清,采用ELISA法检测IFN-γ含量;同日取小鼠肝脏和脾脏,常规方法制作肝、脾组织切片,染色后观察病理变化.结果 中药组小鼠T、B淋巴细胞及INF-γ水平明显增高,与其他各组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);宿主肝、脾细胞切片观察恢复效果较好;药物抑制宿主体温升高.结论 中药制剂可以提高宿主免疫功能,对疟原虫有一定的抑制作用,同时对肝脾细胞有一定保护作用.
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我国Q热立克次体菌株23S rRNA基因插入顺序的分析
目的 对我国伯氏考克斯体(Cb)分离株的23S rRNA基因插入片段(23S IVS)作核酸序列分析.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增7株Cb中国分离株和2株外国参考株的23S IVS,用双脱氧核苷酸法对扩增产物进行测序.结果 重庆,四川,内蒙分离株以及Henzerling和Grita等6株的IVS序列均相同,YS-8,YS-9和YH-11等云南分离株的IVS与前6株的比较仅少一个7个碱基的重复序列.结论 Cb 23S IVS为高度保守基因片段,与高度异质性的钩端螺旋体的同源性基因片段不同;云南株和其它6株的IVS差别与Cb分离株的地理分布的不同有关,云南分离株可能为一亚种.
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本芴醇对疟原虫DNA含量及溶酶体pH值的影响
目的：探讨本芴醇的抗疟作用机制。方法：采用流式细胞术(FCM)分析了本芴醇和氯喹对鼠伯氏疟原虫K173株DNA含量及溶酶体pH值的影响。结果：对照组疟原虫DNA含量在各时间点没有显著变化。本芴醇单次给药后，随时间推移疟原虫DNA含量逐渐减少，药后2 h两给药组疟原虫红内期 DNA含量开始降低，到16 h降到低，但药后24 h DNA含量又有所回升。本芴醇单次给药后1 h起疟原虫溶酶体pH值开始升高，药后3 h升至高，药后4 h原虫溶酶体pH值恢复至药前水平。对照药氯喹对疟原虫DNA含量和溶酶体pH值也有相同影响。结论：本芴醇的抗疟作用与其抑制DNA合成相关，但与其升高溶酶体pH值的关系不明确。
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维拉帕米对伯氏疟原虫抗本芴醇株抗药性的影响
目的:分析维拉帕米对伯氏疟原虫抗本芴醇株的耐药性是否有逆转作用.方法:采用Peters 4日抑制实验,涂片计数红细胞感染率并计算原虫抑制率,分析了维拉帕米对伯氏疟原虫敏株、抗本芴醇株及抗氯喹株的药物敏感性的影响.结果:维拉帕米不但能增强本芴醇对伯氏疟原虫K173株(敏感株)的杀虫作用,还能在一定程度上增强抗本芴醇株对本芴醇的敏感性.与之相比,维拉帕米对氯喹杀灭敏株的作用没有影响,也不能逆转抗氯喹株的氯喹抗性.结论:维拉帕米可在一定程度上增强本芴醇对伯氏疟原虫K173株及其抗本芴醇株的杀虫作用;维拉帕米对抗本芴醇株及抗氯喹株产生逆转作用的机制可能不同.
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伯氏疟原虫抗本芴醇株抗性转化相关基因的克隆
目的:研究药物敏感虫株伯氏疟原虫K173株及其在本芴醇压力下产生的本芴醇抗性株之间基因表达的差异状况,克隆抗性相关基因.方法:采用mRNA差异显示技术寻找相关基因,并用Northern杂交证实.结果:采用24种引物组合进行mRNA差异显示,克隆到30余个差异表达基因片段,对其中8个进行了Northern杂交鉴定及测序.结果表明,与敏感株相比,克隆CB52在本芴醇抗性株中表达明显增多,而在氯喹抗性株中的表达有所减少,说明克隆CB52确与本芴醇抗性相关,序列同源性检索表明CB52序列与恶性疟原虫环亲蛋白基因有微弱同源性.向GenBank登录8条新基因序列.结论:克隆CB52基因表达水平的改变与伯氏疟原虫本芴醇抗性的产生相关,疟原虫对本芴醇的抗性机制在基因水平不同于氯喹抗性.
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免疫荧光法快速检验伯氏柯克斯体的研究
伯氏柯克斯体(Coxiella burnetii)习惯上称为Q热立克次体,它所引起的Q热是一种人兽共患病.Q热临床表现多以发热、头痛、肌肉酸痛为主, 与其他热性疾病难以鉴别,极易造成误诊.因此,快速检验并鉴定Q热立克次体,是防治Q热的重要环节.通常,实验室对送检的可疑标本做吉姆萨染色,但该法是非特异性的染色方法,难以即时作出判断.为此,本实验室建立了免疫荧光直接检测病原体的方法,并尝试用微波促抗原抗体反应进行快速染色的方法,可以在15 min之内得出初步诊断报告.本方法为研制鉴定Q热立克次体的标准化免疫诊断试剂盒奠定了基础.
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瑞香素的抗疟作用及其高效液相色谱分析方法
目的研究中药瑞香素在体外和体内的杀疟原虫裂殖体作用、抗红细胞外期疟原虫作用及其高效液相色谱(HPLC)分析方法.方法在恶性疟原虫FCC1株常规体外培养中测试瑞香素杀裂殖体活性,并按"4 d抑制试验"在感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠中测定不同剂量瑞香素的体内抗疟活性.于癌症研究所(ICR)小鼠腹腔注射约氏疟原虫子孢子后0.5 h灌胃给药,连续4 d.不同剂量的瑞香素及瑞香素与伯氨喹(PQ)配伍用药的抗疟作用分别以第8天ICR小鼠阴性率及第12天或第13天ICR小鼠每千个红细胞被原虫感染数评价.再以高效液相色谱及质谱的方法分析鉴定瑞香素及其两个结构类似物:香豆素,7-羟基香豆素.结果体外试验中瑞香素在1～10μmol/L剂量范围内有明显杀裂殖体作用,而体内试验中按第5天减虫率与感染鼠在30 d内的平均生存天数评价,50或100 mg·kg-1·d-1×4 d瑞香素灌胃以及10、50或100 mg·kg-1·d-1×4 d瑞香素腹腔注射给药在伯氏疟原虫ANKA株感染鼠中的抗疟作用与10 mg·kg-1·d-1×4 d氯喹(CQ)灌胃的疗效相似.瑞香素的剂量范围为每天10～100 mg/kg,连服4 d,第8天原虫阴性小鼠数及第12天红细胞被感染程度与对照组相比差异均无显著性;瑞香素每天50 m/kg和每天PQ 5 mg/kg配伍组的第8天小鼠阴性率与PQ每天10 mg/kg组相当.运用特定的高效液相色谱方法,瑞香素与其结构类似物可达完全的基线分离,分析灵敏度为10～20 ng;经质谱分析确定各化合物的分子量正确.结论瑞香素在体外和体内均有一定的杀裂殖体活性.瑞香素单独用药,无明显抗红细胞外期疟原虫作用,但瑞香素每天50 mg/kg与PQ每天5 mg/kg配伍用药的抗疟效果与PQ每天10 mg/kg相当.高效液相色谱方法可实现对中药瑞香素的准确、精密的定量分析.
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脑型疟发病中肿瘤坏死因子α与一氧化氮的作用机制研究
目的 研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与一氧化氮(nitric oxide,NO)在脑型疟(cerebral malaria,CM)发病中的作用. 方法首先建市C57BL/6J小鼠的CM动物模型.然后,取雌性(C57BL/6J 小鼠100只,随机分为:正常对照组,腹腔注射生理盐水;感染对照组,接种约氏疟原虫By265;CM模型组,腹腔注射感染们氏疟原虫K173;地塞米松处理组,于感染伯氏疟原虫K173前一天在饮水中加入地塞米松,浓度为10 ms/L;L-硝基精氰酸(L-NNA)处理组,从感染伯氏疟原虫K173当天开始每只每大腹腔注射25 g/L的L-NNA溶液0.2 ml.每组均为20只.CM 模型组鼠于CM发病时取脑组织,其他各组小鼠于感染后第10天取脑组织匀浆.观察脑组织TNF-α、NO及氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在CM发病过程中的含量变化;同时观察TNF-α合成抑制剂地塞米松及NO合成抑制剂L-NNA对脑组织中TNF-α和NO浓度的影响. 结果 (1)CM模型组小鼠均发牛CM,地塞米松组、L-NNA 组及感染对照组小鼠至感染后第10天均末发生CM.(2)小鼠CM发病时脑组织TNF-α、NO、NOS均高于感染第5天(P＜0.01).(3)小鼠CM发病时和感染后第5天脑组织FNF-α、NO、NOS均高于感染对照组和止常对照组(P＜0.01).(4)地塞米松组小鼠感染后第10天、第5天与同时间CM模型组比较,脑组织TNF-α均明显下降(P＜0.01).(5)L-NNA组与CM模型组比较,脑组织NO、NOS均显著性降低(P＜0.01). 结论 (1)成功地建立起较理想的CM动物模型.(2)伯氏疟原虫感染小鼠给予地塞米松或L-NNA后,可有效地预防CM的发病.
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伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株对宿主细胞色素P450ⅡB1基因转录的影响
目的:比较伯氏疟原虫氯喹抗性(RC)株和敏感(N)株对宿主肝脏细胞色素P450ⅡB1基因mRNA转录影响的差异.方法:以小鼠CYP450ⅡB1基因的cDNA(552bp)为探针,分别与感染伯氏疟原虫RC株和N株的小鼠肝脏总RNA进行Northernblot杂交.结果:感染伯氏疟原虫N株小鼠肝CYP450ⅡB1基因的mRNA明显低于感染RC株鼠及正常对照鼠,而感染RC株鼠与正常对照鼠之间该基因的转录无明显差异.结论:伯氏疟原虫RC株和N株感染对宿主肝脏CYP450ⅡB1基因mRNA转录的影响有显著差异,为氯喹抗药性疟原虫可加速宿主氯喹代谢的抗药性假说提供了分子生物学依据.
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伯氏疟原虫小亚单位rRNA在斯氏按蚊体内的转录类型和动态
目的:观察伯氏疟原虫(P.berghei)小亚单位核糖体RNA(SSUrRNA)在斯氏按蚊体内的转录类型和动态.方法:应用RT-PCR方法,特异地扩增伯氏疟原虫A型和S型SSUrRNA,检测斯氏按蚊虫体内S型SSUrRNA的转录水平.结果:吸感染血的斯氏按蚊体内仅见S型SSUrRNA的条带.整体检测从第2天开始查见,第8天明显增强,第12～16天达到高峰.在蚊腹部S型SSUrRNA转录动态与整体检测结果相似.胸部于第12天查见该基因的转录.结论:斯氏按蚊体内伯氏疟原虫仅转录S型SSUrRNA,它的转录动态与疟原虫在蚊体内的发育密切相关.
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蒿甲醚高效缓释颗粒剂对鼠疟的实验疗效观察
目的:观察蒿甲醚高效缓释颗粒剂对小鼠体内伯氏疟原虫的疗效.方法: 采用4 d抑制性治疗法,比较蒿甲醚高效缓释颗粒剂及对照品蒿甲醚胶囊的抗疟效价;采用高峰治疗法,观察用药后30 d内的治愈率与病鼠存活率.结果: 蒿甲醚高效缓释颗粒剂50%抑制剂量(SD50)为1.30 mg/kg,对照品蒿甲醚胶囊SD50为5.70 mg/kg,高效缓释颗粒剂的抗疟效价约为蒿甲醚胶囊的4.4倍,原虫血症清除时间快12 h.经高峰治疗用药后,高效缓释颗粒剂100,50,25 mg/(kg*d)3个剂量组的鼠原虫血症分别于第2,3,5天清除,30 d内无复燃,病鼠存活率高,疗效明显高于蒿甲醚胶囊相应剂量对照组. 结论: 蒿甲醚高效缓释颗粒剂可增强抗疟效果,延长药物作用时间,并能降低疟原虫的复燃率.
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伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株感染小鼠肝、肾、肺超微结构的比较
目的：研究伯氏疟原虫（Plasm odium bergh ei）氯喹抗性(RC)株与敏感(N)株致病力和宿主对不同虫株感染反应的差异。方法：比较伯氏疟原虫RC株和N株感染ICR小鼠后期，肝、肾、肺等重要脏器超微结构的病理学改变。结果：N株感染后期，肝血窦、肾间质和毛细血管、肺泡毛细血管含有较多的感染疟原虫红细胞，肺泡壁毛细血管内皮细胞有较多的突起与疟原虫感染红细胞相接触。较多的肝细胞、肾小球旁细胞、肾小管上皮细胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞出现膜破溃，细胞器和胞质流失等不可逆的坏死性病变，一些肝血窦、肾小管和肺泡内可见多量的细胞碎片。RC株感染后期，肝血窦、肾间质充血，含有较多的感染疟原虫红细胞。肝细胞、肾小管上皮细胞的病变以线粒体肿胀为主的变性，可见肝脏部分变性肝细胞出现恢复状态，肾小球毛细血管内皮细胞下、基膜、系膜区可见电子致密物沉着，肺泡隔内可见较多的单个核细胞。[ HT5W〗结论：N株毒力较强，对宿主肝、肾和肺细胞超微结构的损害为不可逆的坏死性病变，呈急性变质性炎症过程；而RC株毒力明显减弱，对宿主肝、肾和肺细胞超微结构的损害以变性为主，呈慢性增生性炎症经过。
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伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株感染ICR鼠病理变化的比较研究
目的：研究伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)的抗药性与致病力的关系。方法：比较伯氏疟原虫氯喹敏感株（N）和抗性株（RC）感染ICR鼠的肝、脾、脑、心、肺、肾等重要脏器病理组织学的动态变化。结果：N株感染后，小鼠肝、脾有较多的疟色素沉着，肺脏呈郁血性水肿；脑微血管充血和阻塞；各脏器呈急性炎症的病理变化特点。RC株感染后，小鼠肝、脾脏的病理组织学改变与原虫血症的变化有关。肺脏呈间质性肺炎，各脏器呈慢性增生性炎症的病理变化特点。结论：N株致病力较强，感染后引起宿主死亡的主要原因是感染疟原虫的红细胞对脑微血管内皮细胞的粘附，造成微血管阻塞；RC株致病力较弱，宿主的应答反应在感染早期可能是CD4+Th1相关的迟发型超敏炎症反应，而感染后期是CD4+T h2辅助作用下的抗体依赖性的免疫应答，并在疟原虫的后清除上起着关键性的作用。
