淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达及多克隆抗体制备

目的 为进一步研究蚊视蛋白参与杀虫剂抗性的相关分子机制和将其作为现场抗性检测靶标提供多克隆抗体.方法 以前期制备的重组质粒pGEM-T Easy/opsin为模板,通过基因工程手段克隆视蛋白基因胞外区片段,构建原核载体,IPTG诱导表达蛋白,并利用His亲和层析以及肠激酶酶切片段获得纯度较高的蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,western blot鉴定抗体特异性.结果 成功构建淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达载体,经IPTG 1 mmol/L诱导3h后高效表达可溶性重组蛋白,经His亲和层析及肠激酶酶切后获得纯度较高的蛋白,制备的多克隆抗体经western blot证实能特异性地识别蚊视蛋白而不与非特异性蛋白结合.结论 成功构建了淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达载体,制备的抗重组蛋白多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步研究视蛋白参与杀虫剂抗性的分子机制和将其作为现场抗性检测靶标提供了基础.

豚鼠形觉剥夺和光学离焦性近视眼模型视蛋白表达变化研究

目的 研究形觉剥夺和光学离焦性豚鼠近视眼视蛋白的表达变化,探讨视蛋白表达与实验性近视眼之间的关系.方法 实验研究.50只豚鼠随机分为形觉剥夺组、光学离焦组(每组20只)和正常对照组(10只),形觉剥夺组豚鼠出生1周后单眼戴半透明(半透明薄膜贴于平镜表面)硬性角膜接触镜(RGPCL),光学离焦组豚鼠出生1周后单眼戴-4.00 D的RGPCL,另一眼为对照眼.1、2周后各组分别测量屈光度数、眼轴长度和玻璃体腔深度,并于上午10 ～ 12点钟取材,实时荧光定量PCR观察视蛋白mRNA的变化,免疫印迹法检测视蛋白的变化.近视眼动物模型建立的数据采用两因素方差分析联合q检验,PCR和免疫印迹检测结果行配对t检验.结果 造模2周后,形觉剥夺组和光学离焦组屈光度数分别为(-4.00 ±0.87)和(-2.00±1.17)D,相对于对侧眼及对照组差异有统计学意义(F=203.98,88.66；P＜0.05),同时伴有玻璃体腔深度(F=258.26,46.67)及眼轴(F=94.19,11.72)的延长,和对侧眼及正常对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).短波长敏感视蛋白(S-opsin)mRNA在形觉剥夺和光学离焦组中表达均增加,S-opsin mRNA的内参校正值在造模2周时分别为0.752±0.05和1.117 ±0.13,较对照眼0.536 ±0.04和0.772±0.10差异有统计学意义(t=6.10,6.28;P ＜0.05).长波长敏感视蛋白(L-opsin)在形觉剥夺及光学离焦2周时mRNA的内参校正值均为0.42 ±0.01,较对照眼的0.24±0.01和0.34±0.04表达均增加(t=6.30,4.93；P＜0.05).免疫印迹检查结果亦提示S-opsin和L-opsin在形觉剥夺和光学离焦组中表达较对照眼增加.结论 视锥细胞可能是视网膜感受形觉剥夺和光学离焦信息的部位,视蛋白表达变化可能启动实验性豚鼠近视眼的形成.

视锥-视杆同源盒基因对斑马鱼光感受器细胞发育的影响

目的 观察斑马鱼受精卵CRX基因表达下调后,视网膜光感受器细胞外节盘的发育和视蛋白的表达.方法 实验研究.斑马鱼受精卵内显微注射CRX-寡核苷酸,使CRX基因的表达下降.通过眼球的组织学切片、电镜标本和视蛋白RNA探针的原位杂交观察光感受器细胞以及外节盘的发育和视蛋白的表达.结果 视网膜组织学观察,CRX组与对照组、空白组比较,视网膜和光感受器细胞的发育都没有明显差别.电镜观察,对照组和空白组光感受器细胞都有外节盘形成,但是CRX组未发现明显的外节盘结构.对照组和空白组斑马鱼均可在鼻侧视网膜区域观察到视紫红质(rhodopsin,Rho),视锥细胞蓝色视蛋白(SWS1)和紫外线视蛋白(SWS2)3种视蛋白的表达,CRX组3种视蛋白的表达明显减少.结论 CRX基因影响斑马鱼光感受器细胞外节盘的发育和视蛋白的表达.

形觉剥夺对豚鼠锥视蛋白表达的影响研究

目的 探讨形觉剥夺对豚鼠锥细胞视蛋白表达的影响.方法 出生1周的豚鼠28只,分为正常对照组和形觉剥夺组,各14只,按自然亮暗周期饲养.形觉剥夺组随机选取一只眼以半透明橡胶遮盖,正常对照组随机选择一眼作为对照.4周后取眼球行RT-PCR检测神经视网膜M-视蛋白和S-视蛋白的mRNA表达,并进行豚鼠视网膜铺片后免疫组织化学方法观察两种视蛋白的分布和表达密度,一抗为兔抗鼠红/绿锥视蛋白抗体或蓝锥视蛋白抗体,二抗为羊抗兔IgG带488荧光抗体.以Leica光学显微镜和Leica共聚焦显微镜观察豚鼠视网膜腹侧(下方)和背侧(上方)及中央区的锥细胞视蛋白的表达.结果 实验前屈光状态为:对照眼(5.63±0.87)D,形觉剥夺处理眼(5.47±1.02)D,4周后屈光状态分别为:对照眼(4.38±1.02)D,形觉剥夺处理眼(-3.03±0.78)D;屈光度的改变分别为:(-1.25+0.53)和(-8.38±1.44)D.正常豚鼠的视网膜短波敏感锥细胞分布为腹侧(下方)多于背侧(上方);中央密度高,密度变化为突变.豚鼠的中波敏感锥细胞分布在背部(上方)多于腹侧(下方),中央密度高,密度变化为渐变;正常组短波敏感蛋白的表达密度:下方为(805.0±203.3)mm-2,上方为(100.0±57.7)mm-2;中央为(1637.2±314.1)mm-2.形觉剥夺组:下方为(640.9±196.8)mm-2;中央为:(1016.7±144.6)mm-2,上方为(70.9±30.8)mm-2;正常组M-视蛋白的表达密度:上方为(946.2±388.5)mm-2,中心为(1666.7±137.8)mm-2,下方为(175.0±100.9)mm-2;形觉剥夺组:上方为(1436.7±366.0)mm-2,中心为:(2780.0±180.5)mm-2,下方为(318.2±172.7)mm-2.RT-PCR检测示形觉剥夺眼和对照眼的M-视蛋白的相对吸光度值分别为1.06±0.07和0.51±0.10,S-视蛋白的吸光度值分别为0.70±0.07和1.25±0.06.形觉剥夺性近视眼视网膜3个观察区域M-视蛋白的表达均较正常对照增加,S-视蛋白的表达减少,两因素方差分析示差别均有统计学意义(P＜0.05).结论 形觉剥夺性近视眼M-视蛋白的表达增加,S-视蛋白的表达减少,提示感光细胞锥细胞的视蛋白表达有可能在近视的发生发展中起了作用.

内在光敏性视网膜神经节细胞的研究进展

内在光敏性视网膜神经节细胞是除视锥和视杆细胞外,视网膜中另一种具有光敏感作用的细胞,其在生物昼夜节律和瞳孔对光反射的调节中具有重要作用,近年来受到世界上时间生物学和眼科学领域一些研究者的重视,然而国内学者对其研究较少,因此有必要就其生物学特征、生理作用及其在临床中的应用予以综述.

日节律光协同化研究进展

黑视蛋白来源于脊椎动脉,但与无脊椎动物视蛋白具有更高的同源性,分布于有爪蟾蜍和鳕鱼的视网膜及其它多种组织,而几乎只见于小鼠和人的视网膜节细胞.投射到视交叉上核的视网膜节细胞多表达黑视蛋白且具有光敏感性.光诱导的视网膜节细胞反应阈值高、潜伏期和持续时间长,与日节律光协同化相符.黑视蛋白、隐色素以及视杆、视锥细胞视蛋白都是光协同化过程的感光物质.

斑马鱼视网膜感光细胞的发育及视蛋白的表达

目的 研究斑马鱼视网膜感光细胞的发育和视蛋白的表达,明确利用斑马鱼研究视网膜和感光细胞的可行性.方法 制备斑马鱼视网膜感光细胞视蛋白(视杆细胞视紫质、视锥细胞紫外线视蛋白和视锥细胞蓝色视蛋白)的RNA探针.收集受精后72,96,120 h的斑马鱼眼球组织进行切片、电镜观察和整体原位杂交.结果 斑马鱼的神经视网膜分层排列,包括3个细胞层和2个丛状层.随时间发展,视网膜的发育逐渐成熟,3个细胞层的细胞排列更加整齐,感光细胞的外节盘发育更加成熟,3种视蛋白的表达逐渐增强,范围扩大.结论 利用斑马鱼进行视网膜和感光细胞的研究是可行的,视蛋白可作为感光细胞的标记.

"震波疗法"治脚跟痛/蝙蝠唾液血栓克星/步行游泳爬楼梯消耗多少卡路里/怪异耳鸣源于脑/黑视蛋白--生物钟调节剂/生男要比生女痛苦/高血压与胡萝卜素有关/食用果菜过少引发慢性病/吸烟可增加年轻人动脉硬度/米糠营养胜精米

外源性全反视黄酸对出生后豚鼠锥细胞视蛋白表达和方向性的影响

目的 观察一定浓度的外源性全反视黄酸(alltrans retinoic acid,ATRA)对豚鼠锥细胞视蛋白表达和方向性的影响.方法 出生1周豚鼠28只,随机分为ATRA组(n=14)和正常对照组(n=14).ATRA组随机选取一眼于暗红光下球周注射0.4 mg/ml浓度ATRA 0.05 ml,对照组随机选择一眼球周注射稀释ATRA用的相应浓度二甲基亚砜(0.001ml/L)和注射用水共0.05 ml.4周后取眼球,行免疫组织化学方法和RT-PCR技术观察M-视蛋白和S-视蛋白的分布和表达密度,并检测两种视蛋白的mRNA表达,方向性以Leica光学显微镜进行观察.结果 ATRA处理眼S-视蛋白的表达密度:下方为(499.4±147.6)mm-2,上方为(87.8±44.9)mm-2,中央为(968.4±210.2)mm-2;正常组S-视蛋白的表达密度:下方为(805.0±203.3)mm-2,上方为(100.0±57.7)mm-2;中央为(1637.2±314.1)mm-2.ATRA处理眼M-视蛋白的表达密度:上方为(1326.1±267.0)mm-2,中央为(2984.0±613.4)mm-2,下方为(232.9±173.6)mm-2;正常组M-视蛋白的表达密度:上方为(946.2±388.5)mm-2,中央为(1666.7±137.8)mm-2,下方为(175.0±100.9)mm-2.0.4 mg/ml浓度的ATRA 0.05 ml局部球周注射后使豚鼠视网膜的M-视蛋白的表达密度较正常对照组增加,S-视蛋白的表达密度减少.RT-PCR检测示M-视蛋白的相对光密度值分别为1.25±0.11(ATRA处理眼)和0.51±0.10(对照眼),S-视蛋白的相对光密度值分别为0.61±0.09(ATRA处理眼)和1.25±0.06(对照眼).ATRA处理眼与对照眼相比,M-视蛋白的mRNA表达增加,S-视蛋白的mRNA表达下降,两因素方差分析示两组差异均有统计学意义(P＜0.05).铺片的免疫组化结果经光学显微镜观察提示,正常豚鼠视网膜M-视蛋白有-较小的偏斜角,朝向较垂直.ATRA作用后可见M-视蛋白偏斜角明显,朝向水平位,而且排列极有规律.对S-视蛋白的方向性没有影响.结论 豚鼠锥细胞视蛋白的表达和方向性在出生后仍具有可塑性.0.4 mg/ml的ATRA球周局部作用后增加M-视蛋白的mRNA表达,减少S-视蛋白的mRNA表达;使豚鼠视网膜的M-视蛋白的表达密度增加,S-视蛋白的表达密度减少;中波敏感性锥细胞不仅内节具有方向性,其外节视蛋白也具有方向性.ATRA可使M-视蛋白的方向性更为有规律,但对S-视蛋白的方向性没有影响作用.

rd11小鼠视锥细胞变性过程中视蛋白的变化特点

背景 视网膜变性11(rd11)小鼠是近年来新发现的一种自发突变的视网膜变性小鼠.研究证实,rd11小鼠出生后随着鼠龄的增长出现快速的光感受器变性,且视杆细胞变性早于视锥细胞变性,但对于视网膜不同区域视锥细胞变性的特点还不十分清楚. 目的 应用视网膜铺片免疫荧光染色技术观察不同鼠龄rd11小鼠M-视蛋白和S-视蛋白在视网膜的表达分布及变化特点,为相关疾病的基因治疗研究提供实验依据.方法 取出生后14、28、42 d的rd11小鼠各5只,制备视网膜铺片,采用免疫荧光组织化学法分别标记小鼠视网膜后极部颞上、颞下、鼻上和鼻下象限M-视蛋白和S-视蛋白的表达,观察随rd11小鼠鼠龄的变化视网膜各区域M-视蛋白和S-视蛋白的荧光形态和密度,并与相应鼠龄的C57BL/6J小鼠进行比较.结果 出生14d的rd11小鼠视网膜M-视蛋白和S-视蛋白的红色荧光形态和密度与C57BL/6J小鼠接近,但出生28 d的rd11小鼠视网膜后极部颞上、颞下、鼻上、鼻下4个区域M-视蛋白和S-视蛋白表达密度均明显降低,荧光形态由纺锤形逐渐变为点状,出生42 d的rd11小鼠视网膜部分区域M-视蛋白和S-视蛋白表达消失.出生28 d的rd11小鼠视网膜后极部颞上、颞下、鼻上、鼻下区域M-视蛋白的表达密度分别为(414±32)、(300±8)、(324±22)和(250±20)个/0.037 mm2,明显低于同龄C57BL/6J小鼠的(484±21)、(442±19)、(459±34)和(436±12)个/0.037 mm2,差异均有统计学意义(t=4.114、15.225、7.505、17.990,均P＜ 0.05);上述4个区域S-视蛋白的表达密度下降更明显,分别为(8±4)、(175±16)、(74±13)、(315±20)个/0.037 mm2,明显低于C57BL/6J小鼠的(73±16)、(436±30)、(393±30)和(480±19)个/0.037 mm2,差异均有统计学意义(t=8.555、17.076、21.637、13.498,均P＜0.05).结论 rd11小鼠视锥细胞中的M-视蛋白和S-视蛋白均随着鼠龄的增长而急剧减少,以S-视蛋白更为明显.随着鼠龄的增长,rd11小鼠M-视蛋白变性从视神经周围区向鼻下方,再向颞上方逐渐进展,而S-视蛋白变性由颞上方向鼻下方逐渐进展.

长时间单色光照射对豚鼠视网膜视锥细胞及其视蛋白表达的影响

背景 面对视觉环境的不断变化,为获得稳定而有效的信息,动物的视觉系统均应根据需要进行必要的调整.色觉系统面临光谱环境的变化,也应该具有一定的可塑性.在长期单色光照射下,视锥细胞密度和视蛋白的表达是否出现相应的变化目前仍不明确.目的 研究长时间单色光照射后豚鼠视网膜视锥细胞密度和视蛋白及其mRNA表达的变化.方法 30只出生3 d的豚鼠按随机数字表法平均分为绿光照射组、紫光照射组和白色混合光照射组,分别暴露于530 nm的绿光、400 nm的紫光及白色混合光照射环境下饲养8周后,制作视网膜铺片,按照对不同波长敏感的光敏视锥细胞在视网膜的分布特点将视网膜分为背侧、腹侧和混合部,分别行免疫细胞化学单标和双标检测,在荧光显微镜下检测不同光敏视锥细胞的密度变化,应用荧光实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)法观察不同波长光照射后豚鼠视蛋白mRNA的变化,Westernblot法对视蛋白的变化进行定量检测.结果 视网膜背侧单标免疫细胞化学检测显示,3组绿敏视锥细胞密度的差异有统计学意义(F=234.28,P<0.01),与白色混合光照射组相比,绿光照射组绿敏视锥细胞密度明显增多(q=389.68,P<0.01),紫光照射组明显减少(q=67.11,P<0.01).视网膜腹侧单标免疫细胞化学检测显示,3组紫敏视锥细胞的差异无统计学意义(F=3.14,P>0.05);视网膜混合区双标免疫细胞化学检测显示,与白色混合光照射组比较,绿光照射组共表达视锥细胞密度明显增多(q=157.55,P<0.01),紫光照射组共表达视锥细胞密度明显减少(q:254.85,P<0.01).与白色混合光照射组相比,绿光照射组绿敏视蛋白及其mRNA的表达均明显增多(q=4.71,P<0.05;q=184.45,P<0.01);紫光照射组长波长敏感视蛋白(L视蛋白)及其mRNA的表达均明显减少(q=346.66,P<0.01;q=5.87,P<0.05);各组之间短波长敏感视蛋白(S蛋白)及其mRNA的表达差异均无统计学意义(F=3.27,P>0.05;F=1.24,P>0.05).结论长时间单色光照射下,豚鼠视网膜视锥细胞及其视蛋白的表达表现出相应的变化,这可能是视锥细胞选择有利的空间视敏度而对单色光照射环境的一种代偿性反应,说明色觉系统的发育具有一定的可塑性.绿敏视锥细胞密度的升高可能是与过渡区共表达视锥细胞的分化有关.

不同抗原修复法对视网膜石蜡切片相关功能蛋白表达检测的影响

目的 比较4种抗原修复法对视网膜组织抗原修复的效果.方法 分别应用胰蛋白酶消化、高压加热、水浴加热和微波法对视网膜组织切片进行抗原修复,比较400例胞内视黄醛结合蛋白(CRALBP)、视紫红质和视蛋白免疫组织化学染色效果.结果 4种方法对3种蛋白的阳性表达无影响(P＞0.05),但在组织完整性和背景染色方面差异有统计学意义(P＜0.01).胰蛋白酶消化法效果稳定,抗原表达强,背景清晰,组织完整.而高压加热、水浴加热和微波修复导致组织脱失皱褶、细胞核龟裂,且背景染色强.结论 在视网膜组织病理学检测中,胰蛋白酶消化法是较理想的抗原修复方法.

闪光刺激对大鼠初级视皮层脑电波的影响及机制研究

目的 检测并验证闪光刺激对大鼠初级视皮层(V1区)脑电波的影响及可能机制.方法 10只成年SD大鼠在左侧(右)慢性植入电极,予术后第5、7、9天分别给予白、红、绿色闪光刺激并同时记录V1区皮层脑电波.利用免疫组织化学鉴定大鼠视网膜感光蛋白Rhod-opsin和S-opsin,以及大鼠V1区感光蛋白S-opsin.结果 于术后第7、9天给予大鼠白、绿色闪光刺激,V1区脑电波的幅值和面积与刺激前相比有显著性增加(P＜0.01),而术后第5天,V1区脑电波在闪光刺激前后无明显变化.红色闪光刺激对V1区脑电波无明显影响(P＞0.01).免疫组织化学鉴定显示大鼠视网膜感光蛋白Rhod-opsin和S-opsin均表达阳性,V1区感光蛋白S-opsin表达阳性.结论 白、绿色闪光刺激能增强大鼠初级视皮层的电活动,并呈现出强直后增强现象.

移植视网膜组织视蛋白的测定

目的:建立玻璃体内视网膜移植的动物模型,检测玻璃体内视网膜移植片视蛋白的表达,确定移植后视网膜的功能.方法:取1～5 d新生兔12只,取出神经视网膜组织,作为供体.取成年兔12只,经角巩膜缘切口,囊内去除晶状体,切除前段玻璃体后,将供体兔右眼视网膜移植到成年兔右眼的玻璃体腔,分别于手术后7,14,21 d取出供体视网膜组织,抽提视网膜的总蛋白,用SDS-PAGE分离蛋白质,Western Blot进行视蛋白的鉴定.结果:(1)移植到玻璃体腔后,受体眼早期有一定反应,经过用药后消失;(2)移植后的视网膜可以成活;(3)在移植后7,14,21 d的视网膜移植片中检测到视蛋白存在.结论:(1)我们建立的玻璃体腔内视网膜移植的动物模型具有可行性;(2)移植到玻璃体腔内的视网膜组织可见到视蛋白的继续表达;(3)通过对玻璃体内视网膜移植的实验研究,为进行原位视网膜移植打下了一定基础.