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GL50分子在单核细胞来源树突状细胞上的表达及其逆向信号对树突状细胞体外分化成熟的促进作用
目的 分析GL50在不同分化时期单核细胞来源树突状细胞(Mo-DCs)上的表达,探讨GL50信号对Mo-DCs的生物学作用.方法 用Ficoll 密度离心及贴壁法获得外周血单核细胞,经GM-CSF+IL-4常规方法诱导,并分别加入丝裂霉素处理的mock-L929和ICOS-L929细胞,6 d时,加入或不加入TNF-α培养3 d后收集细胞;另外,在上述ICOS-L929细胞处理组的单核细胞中加入不同浓度的GL50单克隆抗体11C4或小鼠同型IgG,加入或不加入TNF-α,继续培养3 d后,收集细胞,免疫荧光标记和流式细胞术分析Mo-DCs表型(GL50、CD80、CD83、CD86)、摄取FITC-Dextran抗原的能力;混合淋巴细胞反应检测Mo-DCs对T细胞的作用;ELISA方法检测对分泌细胞因子IL-2、IL-10的影响.结果 GL50分子在不成熟Mo-DCs上高表达,而随着Mo-DCs的成熟呈下调性表达;GL50单克隆抗体11C4能够有效地促进Mo-DCs的成熟,上调Mo-DCs表面分子(CD86、CD80、CD83、HLA-DR)的表达,降低Mo-DCs摄取FITC-Dextran的能力,同时能有效地促进细胞因子IL-10的分泌,而对IL-2的分泌没有显著影响.结论 GL50分子介导的逆向信号参与了Mo-DCs分化成熟的调节,GL50/ICOS是参与DC/T细胞相互作用的主要分子.
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人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖的实验研究
目的 研究人羊膜间充质干细胞分离培养及免疫调节作用.方法 从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态学的结构特征及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度.建立双向混合淋巴细胞反应体系,根据不同效靶比E/T(hAMSCa/PBMC)加入丝裂霉素处理过的羊膜细胞,用3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响.结果 从羊膜组织成功培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代,细胞具有与骨髓问充质干细胞相似的表面标志,与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入的细胞数量成正比.结论 羊膜问充质干细胞可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用.
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曲古霉素A对小鼠骨髓源性树突状细胞表型和功能的影响
目的 未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDCs)诱导免疫耐受的作用受到越来越多的重视,如何保持其未成熟状态成为研究热点.文中旨在研究曲古霉素A (Trichostatin A, TSA)对小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells, DCs)表型和功能的影响.方法 取小鼠骨髓单核细胞,在含重组小鼠粒/巨细胞刺激因子(recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rmGM-CSF)和重组小鼠白介素-4(recombinant mouse interleukin 4, rmIL-4)完全培养基中诱导其向DCs分化,并与第6天收集疏松贴壁细胞分为空白组(不另外添加任何药物)和TAS组(加入100ng/ml)组,分别继续培养48h.流式细胞仪测定各组DCs表面共刺激因子的表达,ELISA试剂盒检测IL-12p40细胞因子分泌的变化,混合淋巴细胞增殖实验检测不同组DCs对T淋巴细胞增殖能力的影响.结果 与空白组比较,TSA显著下调DCs表面共刺激因子的表达和减少细胞因子IL-12p40的分泌,且其诱导的DCs显著降低同种异基因T淋巴细胞增殖能力.结论 TSA能够抑制DCs的成熟和诱导imDCs的产生.
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酶联免疫斑点法研究小鼠急性移植物抗宿主病模型中产生干扰素γ细胞的水平
目的:探讨异基因小鼠混合淋巴细胞反应(MLR)和急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型中,供者针对受者细胞反应后产生干扰素-γ细胞(IFN-γ PC)的水平.方法:在近交系MHC不合的异基因小鼠脾细胞MLR和aGVHD模型中,用酶联免疫斑点法(ELISPOT)对供者针对受者细胞反应后IFN-γ PC的水平及其影响因素进行了研究.结果:在异基因小鼠脾细胞MLR后,用ELISPOT检测到IFN-γ PC显著升高,具有针对受者细胞的特异性.在异基因小鼠aGVHD模型中,重度aGVHD小鼠脾细胞与未移植的异基因受鼠脾细胞在MLR后,IFN-γ PC较中度aGVHD明显升高,无aGVHD药物预防组较预防组IFN-γ PC明显升高,并具有针对受者细胞的特异性,与aGVHD的临床评分相一致.结论:用ELISPOT可以快速而敏感地检测异基因小鼠脾细胞MLR中的同种异体反应,并和aGVHD的程度以及病程具有相关性.
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抗体修饰抑制性Ly49受体对小鼠NK细胞功能的影响
目的:观察单克隆抗体修饰小鼠NK细胞的抑制性Ly49受体对NK细胞功能的影响.方法:免疫磁性分选近交系小鼠C57BL/6J脾脏NK细胞,以小鼠肿瘤细胞YAC-1和M1细胞为研究对象,观察单克隆抗体封闭NK细胞的抑制性受体Ly49C/I后,对YAC-1和M1细胞的杀伤作用和对M1细胞克隆形成的影响,并观察抗体修饰对C57BL/6J小鼠脾脏NK细胞与BALB/C小鼠脾单个核细胞之间单向混合淋巴细胞反应的影响.结果:抗体修饰后,NK细胞对M1细胞的杀伤能力增强(10.7%±0.5% vs 84.4%±2.9%),并与抗体浓度呈现量效关系(P<0.05);而对YAC-1细胞的杀伤作用则无明显的变化,仅0 μg/ml组与60 μg/ml组有统计学差异(P<0.05).抗体作用后,对M1细胞克隆形成的抑制率增高(8.2%±2.2% vs 94.0%±3.3%),并与抗体浓度呈现量效关系(P<0.05).混合淋巴细胞反应中反应细胞的增殖指数降低(0.398±0.025 vs 0.128±0.014),并具有统计学差异(P<0.05).结论:以抗体修饰抑制性Ly49受体有助于活化NK细胞,提高抗肿瘤能力.
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罗红霉素对小鼠接触性皮炎及T细胞功能的影响
目的:研究罗红霉素对接触性皮炎及T细胞功能的影响.方法:使用2,4,6-三硝基氯苯诱导小鼠接触性皮炎,以双向混合淋巴细胞反应及刀豆蛋白诱导脾T细胞增殖,MTT法检测活细胞数量.采用RT-PCR方法检测细胞因子mRNA表达.结果:20 mg·kg-1罗红霉素效应相灌胃给药明显抑制2,4,6-三硝基氯苯诱导的小鼠接触性皮炎(P＜0.01).25 μg·ml-1罗红霉素显著降低双向混合淋巴细胞反应(P<0.05),5、25 μg·ml-1罗红霉素明显抑制刀豆蛋白诱导的脾细胞存活、增殖(P<0.05, P<0.01)及T-bet、IL-2及IFN-γ的mRNA表达.结论:罗红霉素能抑制2,4,6-三硝基氯苯诱导的接触性皮炎,可能与其抑制T淋巴细胞存活、活化及增殖有关.
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重组人CTLA4Ig融合蛋白体外对人T淋巴细胞功能的影响
目的研究重组人CTIA4Ig对人T淋巴细胞功能的影响.方法采用初次混合淋巴细胞培养、再次混合淋巴细胞培养及细胞毒实验的方法.结果 CTLA4Ig在浓度高于3 mgL-1时能有效地抑制初次混合淋巴细胞反应(P<0.05),其在作用24 h内不能发挥有效的抑制作用,72 h能达大抑制效率;在再次混合淋巴细胞反应实验中CTLA4Ig作用后的T淋巴细胞对同一供者的外周血单核细胞的刺激表现出特异性无反应,而对无关供者的外周血单核细胞的刺激能产生正常的应答反应.结论 CTLA4Ig在体外能抑制T细胞的增殖,并且能诱导T细胞产生抗原特异性无反应.
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人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较
目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.
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应用流式细胞术动态观测小鼠树突状细胞诱导的T细胞增殖的变化
目的:运用流式细胞术(FCM)分析小鼠混合淋巴细胞反应(MLR)中T细胞增殖的动态变化.方法:把分别经脂多糖(LPS)和生理盐水(NS)刺激的小鼠树突状细胞(DC)经H22肿瘤细胞抗原肽冲击后,以1:50的比例与小鼠T细胞(TC)进行同种MLR,分别作为LPS+DC+TC组和NS+DC+TC组,同时设LPS+TC组和空白TC对照组.经体外培养,分别于反应的第0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d收集TC,FCM检测TC细胞周期.结果:随培养时间的延长,LPS+DC+TC组、NS+DC+TC组S期细胞及细胞增殖指数均先增后减、LPS+TC组和空白TC对照组则呈下降趋势(P＜0.05),各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:FCM可以从单细胞水平客观、准确地反映淋巴细胞增殖的动态变化.
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雷帕霉素对大鼠髓源性树突状细胞表型和功能的影响
目的 观察雷帕霉素(RAPA)对树突状细胞(DC)表型和功能的影响.方法 诱导分化Lewis大鼠骨髓源性DC,第6天同时加入脂多糖(LPS)和10μg／L或100 μg/L RAPA,48 h后检测共刺激分子、细胞凋亡、上清液白细胞介素(IL) -10和IL-12水平；混合淋巴细胞培养观察DC刺激Brown Norway大鼠T淋巴细胞增殖能力.结果 RAPA能抑制DC成熟,共刺激分子的上调显著受抑,细胞凋亡增加,100 μg/L RAPA组DC凋亡率达53％.DC在脂多糖作用下分泌IL-10、IL-12上升至( 1533±117)、(2575 ±58) ng/L,但同时加入100μg/L RAPA后,两者下降至(330±159)、( 245±63) ng/L.RAPA处理的DC对T淋巴细胞增殖有抑制作用.结论 雷帕霉素能抑制DC成熟并诱导其凋亡,RAPA处理的DC分泌细胞因子降低,且抑制T淋巴细胞增殖.
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IKK2dn转染树突状细胞诱导产生的CD4+CD25-T细胞的筛选及鉴定
目的 探讨从转染IKK2dn并负载供者抗原的未成熟树突状细胞(imDC)诱导产生的调节性T细胞(Treg)中筛选CD4+ CD25 - Treg的方法,并进行鉴定.方法 Lewis大鼠骨髓源性imDC,转染IKK2dn后负载供者BN大鼠抗原,与Lewis大鼠T细胞进行体外混合淋巴细胞反应(MLR)诱导产生Treg,用免疫磁珠法(MACS)筛选出CD4+ CD25 -T细胞,流式细胞仪(FCM)检测细胞纯度.加入CD4+ CD25 -T细胞行再次MLR检测其抑制T细胞增殖的作用.结果 经MACS筛选,CD4+ CD25 -T细胞纯度为(95.78±1.25)％.再次MLR结果显示CD4+ CD25 -T细胞组的吸光度值为(0.106±0.006),低于BN抗原组(0.189±0.007)、Adv0-CD4+T细胞组(0.419±0.014)及第三方供者抗原组(0.200±0.008),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转染IKK2dn并负载抗原的imDC诱导产生的Treg,经MACS筛选可以获得高纯度的CD4+CD25-T细胞,对同种T细胞增殖具有针对供者的特异性免疫抑制作用.
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JNK、P38-MAPK、IκB-α在异基因CD4+T细胞致人脐静脉内皮细胞损伤中的表达及与TF的关系
目的 检测磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、P38-丝裂原活化的蛋白激酶(P38-mitogen activated protein kinase,P38-MAPK)、核转录因子抑制因子(IκB-α)及组织因子(tissue factor,TF),在异基因及同基因CD4+ T细胞与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)混合培养时在HUVECs中的表达,分析JNK、P38-MAPK、IκB-α与TF的相关性,探讨TF在异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)血管内皮损伤中可能的作用机制.方法 体外原代分离培养HUVECs,用人T细胞亚群阴性分离柱试剂盒,从健康志愿者周围血中分离出CD4+ T细胞作为异基因实验组,以同基因CD4+T细胞为对照组,用γ干扰素预处理HUVECs后与CD4+T细胞混合培养,分别在培养前及培养后不同时间点用流式细胞仪检测HUVECs中TF抗原的表达,实时定量PCR检测TF-mRNA基因的转录状况,Western blot检测磷酸化JNK、P38-MAPK、IκB-α的蛋白含量.结果 异基因组TF及磷酸化JNK、P38-MAPK、IκB-α的表达明显升高,与对照组在不同时间点比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).相关性分析显示,TF与磷酸化JNK、P38-MAPK表达呈正相关,而与磷酸化IκB-α表达无相关性.结论 TF可能通过JNK、P38-MAPK信号通路参与异基因造血干细胞移植时aGVHD血管内皮细胞的活化与损伤.
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室内常见气传真菌的分布及其培养提取物的免疫抑制作用研究
目的了解室内常见气传真菌的分布及其影响因素,并分析其代谢提取物对呼吸道免疫功能的影响.方法以平皿沉降法进行室内环境气传真菌的采样,并进行菌株鉴定及其分布影响因素的分析;同时以改良的混合淋巴细胞反应研究了室内常见气传真菌代谢提取物的非特异性免疫抑制作用.结果室内环境中的主要真菌污染源为芽枝菌属、曲霉属、交链孢属、镰刀霉属、青霉属等,影响室内真菌分布的主要因素为温度、湿度及室外菌落数;青霉属、曲霉属的代谢提取物在无明显的细胞毒性浓度下,可抑制异型小鼠淋巴细胞混合刺激而产生的增生.结论长期暴露于室内气传真菌对人体呼吸道防御功能构成了潜在的威胁.
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大鼠骨髓来源树突状细胞体外培养体系的优化
目的 探讨优化大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)体外培养体系的方法.方法 应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant rat GM-CSF,rrGM-CSF) 20 μg/L和重组大鼠白介素(recombinant rat interleukin,rrIL)- 4 10 μg/L诱导分化Lewis大鼠骨髓单个核细胞,获得未成熟DC(immature DC,imDC).第6日加入终含量为100 μg/L的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激细胞成为成熟DC(mature DC,mDC).用倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表型、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测DC培养上清液中白介素(IL)-12、IL-10的含量,并以Brown Norway大鼠脾脏 T 淋巴细胞为反应细胞,做混合淋巴细胞反应检测,观察DC刺激 T 淋巴细胞增殖能力.结果 经细胞形态学、流式细胞术及混合淋巴细胞反应三方面鉴定,证实所培养细胞为DC.体外培养第6日,见大量增殖细胞集落,细胞高表达OX62.LPS刺激细胞后,细胞伪足样突起明显增多,细胞逐渐呈半悬浮、悬浮生长,细胞表面高表达主要组织相容性抗原复合体(MHC)Ⅱ类分子和共刺激分子(CD40、CD86).与imDC比较,mDC分泌IL-10和IL-12显著增加,刺激同种异体 T 淋巴细胞增殖的能力显著提高.结论 通过采用调整rrGM-CSF和rrIL- 4 的用量等方法优化体外培养体系诱导大鼠骨髓单个核细胞,可分化出大量骨髓源性DC.
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骨髓基质干细胞对脑胶质瘤大鼠的免疫调节作用
目的 研究骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)在体外及脑荷瘤大鼠体内的免疫调节作用.方法 培养BMSCs,以抗原致敏的树突状细胞(dendritic cell,DC)作为刺激细胞,将BMSCs与DC及T淋巴细胞混合培养,或应用Transwell将BMSCs与DC及T淋巴细胞以8μm的膜隔开培养,观察BMSCs对体外混合淋巴细胞反应的调节作用.建立大鼠脑胶质瘤模型,将BMSCs植入荷瘤大鼠脑内,观察对荷瘤大鼠的免疫调节作用.结果 BMSCs不能刺激T淋巴细胞的增殖,但明显抑制DC对T淋巴细胞的激活作用;用Transwell将BMSCs与DC及T淋巴细胞以8 μm的膜隔开,与BMSCs、DC、及T淋巴细胞混合培养相比,结果无统计学差异(P=0.934);在混合淋巴细胞反应早期加入BMSCs可产生明显的抑制效果,在晚期加入BMSCs则抑制效果明显降低(P＜0.01).流式细胞术检测显示混合淋巴细胞反应的T淋巴细胞凋亡不明显.体内检测显示,BMSCs对荷瘤鼠体内的IFN-γ、IL-2、IL-10水平无明显影响,肿瘤内浸润的淋巴细胞与对照组相比无明显减少(P＞0.05).结论 BMSCs可能通过分泌的细胞因子对T淋巴细胞产生一定的抑制作用.
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芍药苷抑制骨髓源性树突状细胞的成熟及功能
目的 探讨芍药苷对树突状细胞(DC)表型及功能的影响.方法 分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,体外加入粒单-集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)诱导骨髓源性DC,培养过程中加入不同浓度的芍药苷共培养.利用CCK-8实验检测芍药苷对细胞活力的影响;流式细胞术检测不成熟DC表面共刺激分子CD80、CD40和M HCⅡ的表达;FITC-Dextran细胞摄取实验检测不成熟DC的吞噬功能;混合淋巴细胞实验检测芍药苷对成熟DC诱导同种异型淋巴细胞增殖的影响.结果 芍药苷不影响细胞活性,无明显毒性作用.芍药苷可抑制不成熟DC表面共刺激分子CD80、CD40和M HCⅡ的表达,抑制不成熟DC的吞噬功能.此外,芍药苷还可明显抑制成熟DC介导的混合淋巴细胞反应.结论 芍药苷能够明显抑制DC的成熟和功能,这为芍药苷在自身免疫病治疗中的应用提供了实验依据.
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树突状细胞负载肝癌相关抗原后成熟调控的研究
目的研究树突状细胞(DC)负载肝癌相关抗原后的成熟调控.方法用SDS-PAGE制备电泳纯化牛结核分枝杆菌热休克蛋白70,用其诱导DC的分化与成熟.结果DC负载肝癌可溶性抗原后,10%细胞失去了DC特征,同时其表面CD 54(90.0%)、CD 83(78.0%)、CD 86(85.0%)分子表达下降;牛分枝杆菌卡介苗-热休克蛋白70(BCG HSP70)的活化有利于负载肝癌可溶性抗原后的DC维持其特异性标志,同时DC表面CD 54(92.0%)、CD83(90.0%)、CD86(91.0%)分子表达增加,DC诱导同种异体淋巴细胞转化的能力增加,淋巴细胞增殖加快,从而促进DC成熟,增加其抗原呈递能力.结论预示BCG HSP70有可能成为促进DC活化和成熟的另一重要分子.
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自体树突状细胞疫苗诱导胃癌患者术后肿瘤特异性免疫反应的作用
目的探讨胃癌术后患者应用树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗治疗后机体肿瘤特异性免疫反应的变化.方法采用外周血单个核细胞及自体肿瘤抗原在体外制备DCs疫苗,皮下注射胃癌术后患者,每周1次,共治疗4次.在治疗前后相应各时相点检测针对自体肿瘤抗原的迟发性超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH),外周血单个核细胞混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reacion,MLR)及细胞上清IFN-γ及IL-4的水平.结果疫苗治疗后可以明提高外周血单个核细胞混合淋巴细胞反应的强度.治疗前及治疗后第2、4、8周患者外周血单核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC)分泌IFN-γ的水平分别为(184±20)、(467±55)、(700±88)、(257±38)pg/ml,各组差异显著;而分泌IL-4的水平分别为(66±8)、(69±9)、(66±7)、(61±7)pg/ml.各组之间无明显变化.有16例疫苗注射后患者DTH反应呈阳性.结论树突状细胞疫苗可改善胃癌术后患者免疫功能状态,并诱导出了肿瘤特异性的免疫反应.
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RDP1258免疫调节功能在大鼠体内实验研究
目的观察一种新型HLA衍生肽(RDP1258)的体内免疫抑制功能并探讨其机制.方法人工固相合成HLA衍生肽(RDP1258),以3H-TdR法观察其在体内对大鼠脾细胞增殖反应的影响;与HO-1酶活性激动剂HEMIN及拮抗剂ZNPP相对比,采用酶化学法及免疫组化方法观察其对体内脾细胞血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)活性的影响.结果RDP1258体内应用可显著抑制淋巴细胞转化及MLR的增殖反应;该肽能够明显提高体内HO-1活性,并增强HO-1的表达.结论RDP1258体内应用能够显著抑制大鼠脾细胞由丝裂原或同种抗原引起的增殖反应,这种作用可能是通过影响HO-1活性而达到的.
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RDP1258对人外周血单核细胞增殖能力及HO-1活性的影响
目的观察一种新型HLA衍生肽(RDP1258)针对人外周血单核细胞由丝裂原以及同种异体抗原刺激导致的增殖能力的影响,并探讨其机制.方法人工固相合成RDP1258, 3H-TdR掺入法观察其在体外对人外周单核细胞增殖反应的影响,以酶化学法观察其对淋巴细胞血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)活性的影响.结果 RDP1258可显著抑制人外周血单核细胞的转化及MLR增殖反应;该肽体外降低HO-1活性呈现出剂量依赖性.结论 RDP1258能够显著抑制人外周单核细胞经丝裂原或同种抗原刺激引起的增殖反应,这种作用可能是通过影响HO-1活性而达到的.
