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γ型干扰素增强脂肪干细胞介导的免疫抑制
背景：脂肪干细胞可以向成骨细胞和软骨细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和神经细胞等分化。脂肪源性干细胞与间充质干细胞不但具有非常近似的生物学性质，而且在细胞表面标志谱的表达方面也十分接近。目的：探索脂肪源性干细胞表面白细胞抗原Ⅱ类分子的表达以及其免疫原性和免疫调节作用，并探讨其具体机制是通过什么途径诱导的。方法：分离培养脂肪源性干细胞，并用γ型干扰素刺激，然后用流式细胞术检测其表面免疫分子白细胞抗原Ⅱ的表达，实时荧光定量PCR和Western bolt分别检测吲哚胺-2，3-双加氧酶基因和蛋白的表达。脂肪源性干细胞单向刺激淋巴细胞，观察细胞增殖情况。淋巴细胞用植物血凝素刺激后，加入1×102-1×105脂肪源性干细胞，观察淋巴细胞增殖情况；同时，1×102-1×105脂肪源性干细胞作为“第三者”细胞加入混合双向淋巴细胞反应体系中，同样观察淋巴细胞增殖情况。结果与结论：脂肪干细胞低表达白细胞抗原Ⅱ和吲哚胺-2，3-双加氧酶，但在γ型干扰素刺激后，白细胞抗原Ⅱ和吲哚胺-2，3-双加氧酶表达均明显上调。脂肪源性干细胞不能刺激淋巴细胞增殖，但能抑制植物血凝素或异体淋巴细胞导致的淋巴细胞增殖，且脂肪源性干细胞与混合淋巴细胞共培养的上清中检测到大量γ型干扰素的表达。提示脂肪干细胞具有低免疫原性，同时可在体外抑制淋巴细胞增殖反应，添加外源性γ型干扰素有助于脂肪源性干细胞发挥免疫抑制作用。
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树突状细胞共刺激分子表达与免疫抑制剂的干预
背景：以往关于器官移植免疫抑制和抗排斥反应的研究，多关注T淋巴细胞介导的免疫反应及免疫抑制剂对T 淋巴细胞的作用，树突状细胞作用尚不清楚，且对于免疫抑制剂对树突状细胞影响的表现及机制亦不尽相同。目的：比较不同免疫抑制剂对树突状细胞共刺激分子表达及功能的影响，探讨其免疫抑制作用机制。方法：在诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞定向分化为树突状细胞时分别加入20μg/L雷帕霉素、0.04 mg/L霉酚酸酯、10μg/L他克莫司和1 mg/L环孢霉素A。结果与结论：流式细胞仪检测结果显示，各组CD40表达为：雷帕霉素<他克莫司<环孢霉素A<霉酚酸酯(P<0.01)；CD86表达分别为：雷帕霉素<他克莫司<环孢霉素A=霉酚酸酯(P<0.01)；CD80、CD11c及主要组织相容性复合体Ⅱ的表达各组差异无显著性意义(P>0.05)。单向混合淋巴细胞反应结果显示，各组树突状细胞共刺激T细胞增殖能力表现为：雷帕霉素<霉酚酸酯<他克莫司=环孢霉素A (P<0.05)。结果证实，雷帕霉素、他克莫司、环孢霉素A、霉酚酸酯均通过抑制树突状细胞共刺激分子CD40及CD86表达而发挥免疫抑制作用，以雷帕霉素为显著；虽然以上药物对树突状细胞抗原递呈能力主要组织相容性复合体Ⅱ的表达均无明显抑制性，但均能抑制树突状细胞刺激T细胞增殖的能力，雷帕霉素的抑增殖能力强。
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未成熟树突细胞诱导同种免疫低应答性的研究
目的:证实缺少辅助刺激分子的未成熟树突细胞(DC)在体外诱导同种T细胞的低应答性.方法:应用骨髓微血管内皮细胞作为饲养细胞扩增同品系小鼠骨髓细胞 ,经不同浓度GM-CSF作用,在体外培养出不同发育阶段的DC.采用初次和再次单向混合淋巴细胞培养方法观察Balb/c小鼠脾脏T细胞对同种未成熟DC或脾细胞的应答能力.结果:在初次MLR试验中,Balb/c T细胞对C57BL/6小鼠未成熟DC刺激只呈现出微弱的增殖反应,SI=2.84±0.60,明显低于对相应品系鼠成熟DC或脾细胞的增殖反应(SI分别为15.72±6.49,6.57±2.85);在再次MLR系统中,经未成熟DC预处理的Ba lb /c T细胞对C57BL/6来源的脾脏细胞只发生低应答反应(SI=1.29±0.19),而对无关品系AK R的脾脏细胞仍显示较高的增殖能力(SI=10.64±1.89).结论:缺乏辅助刺激分子的未成熟DC在体外MLR系统中诱导出同种Balb/ c小鼠T细胞免疫低应答性.
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新型HLA衍生肽对人外周单核细胞免疫功能的抑制作用
目的:探讨一种新型HLA衍生肽(RDP1258)对人外周血单核细胞增殖的免疫抑制作用及其机制.方法:人工固相合成RDP1258,用3H-TdR掺入法观察其在体外对人外周单核细胞增殖反应的影响,以酶化学法观察其对淋巴细胞血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)活性的影响.结果:RDP1258可显著抑制淋巴细胞转化及MLR的增殖反应;该肽体外降低HO-1活性呈现出剂量依赖性.结论:RDP1258能够显著抑制人外周单核细胞经丝裂原或同种抗原刺激引起的增殖反应,这种作用可能是通过影响HO-1活性而达到的.
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两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及生物学特性的研究
目的:研制功能性抗cD40L单克隆抗体,探讨其生物学特性及其运用价值.方法:采用B淋巴细胞融合、免疫荧光、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD40LmAb,通过Daudi细胞生长抑制试验、混合淋巴细胞反应观察抗CD40LmAb的生物学功能.结果:经表型分析、Western blot和竞争抑制试验,证实mAbBl、mAb4F1是识别人CD40L分子的特异性单抗,且识别的位点不同;mAbBl、mAb4F1均能不同程度地拮抗CD40L-TC介导的Daudi细胞生长抑制和抑制混合淋巴细胞反应.结论:成功地获得两株能稳定分泌特异性抗人CD40L单克隆抗体的杂交瘤(1B1、4F1),这两株单抗对cD40L的生物学功能具有明显的阻断作用,为阻断型单抗.
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调节性T细胞介导异基因交配孕鼠对父方抗原同种反应性的影响
目的研究怀有同种异基因胚胎对母体对父方抗原同种反应性的影响及其相关机制.方法采用CFSE标记应答细胞、SNARF-1标记刺激细胞的单向混合淋巴细胞培养体系,对孕10.5d的同基因交配孕鼠BALB/c×BALB/c(syn-BALB/c)和异基因交配孕鼠BALB/c×C57(allo-BALB/c)对C57小鼠同种抗原的应答强度进行比较;流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞在syn-BALB/c和allo-BALB/c各淋巴器官的比例变化,及其胞内Foxp3表达.结果孕10.5d的allo-BALB/c对C57同种抗原的应答强度明显低于syn-BALB/c,但将应答细胞中的CD4+CD25+T细胞去除后,应答强度反而高于syn-BALB/c.allo-BALB/c脾脏、淋巴结和外周血CD4+CD25+T细胞明显高于syn-BALB/c,这些细胞均表达高水平的Foxp3.结论异基因交配孕鼠对父方抗原的同种反应性较同基因交配孕鼠降低,这一现象很可能是由CD4+CD25+Treg介导的.
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阻断型CD154抗体和CD80抗体生物学作用的研究
为比较阻断型抗人CD154单克隆抗体(1B1)和抗人CD80单克隆抗体(3H8)的单独及联合应用在调节CD4+T细胞对同种抗原的初次和再次免疫应答中的作用.采用免疫磁珠阴性选择法分离获得人外周血CD4+T细胞、将纯化的CD4+T细胞与刺激细胞体外共培养,通过检测培养上清IL-2、IFN-γ水平以及CD4+T细胞的增殖来评价1B1和3H8的生物学作用.结果显示,1B1和3H8单独或联合应用能不同程度地抑制混合淋巴细胞反应中CD4+T细胞对同种抗原刺激的增殖,下调CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ,并且在再次反应中能有效诱导CD4+T细胞对同种抗原的免疫低反应性.因此,1B1和3H8的单独及联合应用在移植排斥的免疫干预及同种抗原免疫耐受的诱导中具有潜在的应用前景.
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抗B7-1和抗CD40L单抗延长小鼠皮肤移植物存活实验研究
将C57BL/6小鼠腹部全层皮肤移植于BALB/c小鼠中段背部,实验分组(每组7只小鼠):1.B7-1功能性单抗(4E5)治疗组;2.抗CD40L单抗(4F1)治疗组;3.4E5+4F1治疗组,各单抗以20mg/kg的剂量注入腹腔内;4.空白对照组,只注射同等量的生理盐水.注射时间为移植后0、1、3、5 d,观察移植皮肤排斥情况.于术后第6天分别杀死各组受体和供体鼠,取受体脾细胞与供体作混合淋巴细胞反应(MLR).收集培养6 d的初次反应细胞,检测再次MLR.结果发现,与对照组相比,各单抗治疗组皮肤移植物存活时间延长(P＜0.05);与各单独应用4F1和4E5相比,联合使用4F1和4E5产生一定的协同作用,但未能进一步延长移植物的寿命(P＞0.05).初次单向MLR:4F1、4E5和4F1+4E5治疗组受体T淋巴细胞在MLR中表现对供体淋巴细胞特异性低反应性,能有效抑制T细胞对同种异体抗原的初次应答.再次单向MLR:4F1、4E5、4F1+4E5对供体淋巴细胞在再次反应中仍保持着对同种抗原的反应性,与对照组无显著差异,未能诱导特异性免疫耐受.综上结果证实,anti-CDB7-1 mAb(4E5)和anti-CD40L mAb(4F1)作为新型免疫抑制剂,在一定程度上抑制细胞免疫应答,干预排斥反应.
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静息B细胞体外诱导同种T细胞低反应的实验研究
本文采用体外同种混合淋巴细胞实验系统观察了静息B细胞(resting B cell)诱导的同种免疫低应答反应.C57BL/6小鼠脾细胞经贴壁去除巨噬细胞后,用抗Thy-1抗体加补体和Percoll非连续密度梯度离心法分离,获得纯化的静息B细胞,经FACS检测其表面高表达SmIg(94.88%)和处于细胞分裂的G0期(95.79%),并表达H-2Kb(99.5%)和H-2I-Ab(82.42%),但低表达CD80/CD86(分别为4.26%和4.16%).C57BL/6小鼠静息B细胞刺激同种BALB/c小鼠T细胞(初次MLR)只呈现微弱增殖反应,明显低于用LPS活化B细胞或全脾细胞刺激时的反应值.作再次MLR实验时,经初次MLR处理的T细胞对C57BL/6小鼠脾细胞表现为很弱的应答反应,但对无关的第三品系AKR鼠脾细胞却呈现强应答,说明这种应答低下具有相对特异性.上述结果提示,静息B细胞在MLR系统中不能诱导同种T细胞的充分活化而表现为同种免疫应答的低下.这在同种移植中诱导受体对移植物耐受提供有益的启示.
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体外扩增后人脂肪源干细胞的体外免疫调节功能的实验研究
目的 研究体外扩增后人脂肪源干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)在体外的免疫调节功能,以期以少量组织获得足够量的低免疫原性且具有免疫调节功能的脂肪源干细胞,用于组织修复及细胞治疗. 方法 流式细胞仪检测扩增至第2代及第5代的人脂肪源干细胞表面标记物,观察在扩增的过程中ADSCs表面标记物的变化;同时,检测扩增至第5代的ADSCs在体外抑制淋巴细胞增殖的能力,以评价ADSCs的免疫原性及免疫调节功能. 结果 ADSCs在扩增过程造血干细胞标记物表达降低,间质细胞表型及内皮细胞表型变化无显著性差异,同时第5代的ADSCs在体外不会引起淋巴细胞的增殖,并且在混合淋巴细胞反应中可以抑制淋巴细胞的增殖. 结论 扩增中的ADSCs逐渐表达均一的间充质干细胞的表面标记物,并在扩增至第5代时仍保持有低免疫原性及免疫调节的能力.
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mB7AP-exCD40L融合蛋白的分子设计及其在Pichia Pastoris中的表达和生物活性
目的小鼠B7反义肽与小鼠CD40L胞外区融合蛋白(mB7AP-exCD40L)的分子模拟设计及其酵母表达体系的建立,研究其酵母表达产物的生物活性.方法分子模拟设计mB7AP-exCD40L;构建pPIC9K-mB7AP-exCD40L质粒并用电击法转化Pichia pastoris GS115.Western blot鉴定融合蛋白的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)研究mB7AP-exCD40L对淋巴细胞增殖的影响.结果构建的重组Pichia pastoris实现了mB7AP-exCD40L的分泌表达,表达蛋白质的相对分子质量约2.6×103,对MLR具有抑制作用.结论分子模拟设计的mB7AP-exCD40L在Pichia pastoris表达体系成功表达,为进一步研究mB7AP-exCD40L在抗移植排斥反应中的作用奠定了基础.
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终末期肾脏病患者外周血树突细胞的数量及活性
目的 观察终末期肾脏病(ESRD)患者外周血中树突细胞(DC)数量及活性,为反映细胞免疫功能、评估透析对机体免疫状态的影响及开展ESRD免疫治疗提出可能.方法 31例ESRD患者分为尿毒症组(未透析,11例)、腹膜透析组(10例)、血液透析组(10例),另选取23名健康者作为正常对照组.采用DC分类试剂盒检测外周血DC亚群百分率.分离外周血单个核细胞,细胞因子体外诱导培养,采用流式细胞仪检测DC表型分子表达水平.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测第9天DC培养上清液中白介素(IL)-12的含量.采用异体混合淋巴细胞培养评估DC刺激T细胞增殖的能力.结果 ①DC亚群状况:与正常对照组比较,尿毒症组的外周血DC显著减少(P＜0.05),以淋巴系DC(PDC)减少为主(P＜0.01);腹膜透析组的外周血DC较尿毒症组显著增多(P＜0.01),接近正常对照组(P＞0.05);与正常对照组比较,血液透析组的髓系DC (MDC1)明显减少(P＜0.01),PDC明显增多(P＜0.01),MDC1/PDC降低(P＜0.01).②DC表型分析:与正常对照组比较,尿毒症组的DC表型分子表达均显著减少(P值均＜0.01);腹膜透析组DC表达CD40、CD80、CD83显著减少(P值分别＜0.05和0.01);血液透析组DC表达CD1a、CD11c、CD40显著减少(P值均＜0.01),表达CD123显著增多(P＜0.05).③IL-12:尿毒症、腹膜透析和血液透析组DC分泌IL-12较正常对照组明显减少(P值均＜0.05).④异体混合淋巴细胞反应:与正常对照组比较,尿毒症和腹膜透析组的DC刺激T细胞增殖的能力明显降低(P值均＜0.01),血液透析组接近正常(P＞0.05).结论 ESRD患者DC数量明显减少且功能明显紊乱,腹膜透析及血液透析不同程度地改善了此现象,为患者的生物免疫治疗提供可能.
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胸腺肽α1对80岁以上老年人外周血树突状细胞体外培养及功能的影响
目的 观察胸腺肽α1对≥80岁老年人外周血单核细胞体外诱导培养生成的树突状细胞( dendritic cell,DC)的活力及其功能的影响作用. 方法 取30例高龄老年人作为研究对象,给予胸腺肽α1注射剂1.6mg皮下注射,每周2次,疗程为1月,各取治疗前后的外周血,用淋巴细胞分离液离心获得单个核细胞,贴壁培养2h后获得单核细胞,以含有重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素-4的培养基培养1周,观察治疗前后DC的生长、活力、存活时间、对同种T淋巴细胞的刺激反应,并进行比较. 结果 治疗前≥80岁老年人DC培养过程中细胞逐渐死亡,培养至第7天大部分细胞死亡,获得的DC数量较少,其中有8例未能培养出DC；而治疗后培养的DC的活力保持较好,至第7天获得的DC数量较治疗前明显增多,对同种T淋巴细胞的刺激能力也明显增强. 结论 ≥80岁老年人应用胸腺肽α1外周血培养的DC生长活力、T细胞刺激能力明显增强,由此可以推断胸腺肽α1可以在某种程度上提高≥80岁老年人的免疫功能.
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老年人外周血树突状细胞的体外培养及功能研究
目的 探讨≥80岁老年人外周血单核细胞体外诱导培养生成树突状细胞(dendriticcells,DCs)的情况及其功能特点.方法 取30例≥80岁老年人及30例60～70岁老年人外周血,用淋巴细胞分离液离心获得单个核细胞,贴壁培养2h后获得单核细胞,用含有rhGM-CSF和rhIL-4的培养基培养1周,观察2组DCs的生长、活力、存活时间、同种T淋巴细胞的刺激反应,并进行比较.结果 ≥80岁组DCs培养过程中细胞逐渐死亡,培养至第7天大部分细胞死亡,获得的DCs数量较少,其中有8例未能培养出DCs;较60～70岁组对同种T淋巴细胞的刺激能力也显著下降,而60～70岁组培养细胞的活力保持较好,至第7天均可获得数量较多的DCs.结论 较60～70岁组,≥80岁组外周血培养的DCs体外的生长活力、T细胞刺激能力明显降低,可能是≥80岁老年人免疫功能降低的重要原因.
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骨髓细胞来源的树突状细胞体外刺激T淋巴细胞增殖的研究
分离骨髓单核细胞,在一定的培养条件下将其诱导成树突状细胞,通过混合淋巴细胞反应检测这些树突状细胞的体外刺激T淋巴细胞增殖的能力.
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γ射线全身照射对中国猕猴T细胞免疫功能的影响
目的本文选用猪-新生猴心脏移植模型,来研究γ射线全身照射对中国猕猴T细胞免疫功能的影响.方法实验行猪-猴异种腹腔异位心脏移植.动物分为两组,空白组:受体不作任何处理.照射组:于心脏移植前30天(d-30),接受60Co 3GY全身剂量,余同空白组.结果照射后一周,淋巴细胞下降至低水平(9.2%),且此时CD4 、CD8水平降到低,CD4水平为照射前的42%,CD8水平为照射前的24%,MLR刺激效应较同期空白组有所下降(P<0.05).存活时间照射组较空白组延长(P<0.05).结论 1)3GY的全身照射能迅速清除外周血中的大多数淋巴细胞,且对机体影响相对较小.2)中国猕猴CD8+T细胞对γ射线的照射更为敏感.3)γ射线全身照射可作为一种诱导耐受的有效的辅助手段.
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人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定
目的:建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法:分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导培养获得DC,电镜及共聚焦显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性.结果:从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重组人GM-CSF、IL-4、TNF-α的共同诱导培养,得到大量成熟DC.形态学观察可见典型DC特征;荧光激活细胞分离器(FACS)检测表明,诱导的DC高表达HLA-DR(96%)、CD83(94.2%)、CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40(97.7%)、CD80(98.2%)分子.同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能.
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大鼠骨髓来源树突状细胞外泌体的提取及功能研究
目的:探讨在不同成熟状态下树突状细胞(dendritic cell,DC)分泌的外泌体(exosomes,Dex)的制备、提取及体外功能鉴定.方法:F344大鼠骨髓来源DC培养6后分为2组,一组为未成熟树突状细胞组(immature DC,imDC):直接收集上清;一组为成熟树突状细胞组(matureDC,mDC):每孔加入终浓度为1μg/ml的LPS培养48 h后,收集上清.然后用多步离心法分离得到Dex,流式细胞术检测两组Dex的表型,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测两组Dex与Wistar大鼠骨髓来源的imDC共培养上清的白细胞介索10(IL-10)、白细胞介素12(It-12p70)的含量.混合淋巴细胞实验(MLR)检测共培养DCs刺激T细胞增殖能力.结果:与mDC分泌的exosomes相比,imDC分泌的exosomes表面中度表达MHC-Ⅱ类分子、低表达CD80、CD86、CIM0共刺激分子,而且与Wistar大鼠骨髓来源的imDC共培养后刺激IL-12p70分泌能力较低(P＜0.05),刺激T淋巴细胞增殖的能力也较mDC分泌的exosomes组弱(P＜0.05).结论:不同成熟状态下的DC分泌的exogomes功能各异,可能在宿主的免疫反应中发挥不同的作用.
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小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖
目的：建立一种体外诱导培养小鼠树突状细胞(DCs)的方法，并观察其不同生长阶段生物学形态及刺激淋巴细胞增殖的能力。方法：联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化，并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果：用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞，3 d后可见细胞形态改变，并呈集簇生长，培养至5 d可见典型的树突状突起，体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs，扫描电镜可见典型的树突状细胞形态，高表达骨髓来源DCs特异性标记CD11c和共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ，成熟DC具有很强的刺激同基因型和同种异基因型T淋巴细胞增殖的能力。结论：小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可生成大量成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。
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树突状细胞表面共刺激分子在哮喘小鼠中的作用研究
目的:研究哮喘小鼠骨髓来源树突状细胞(DCs)的表型及共刺激分子在哮喘发病中的影响.方法:用卵清蛋白建立哮喘模型,利用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导骨髓细胞分化为DCs,流式细胞仪检测DCs表面共刺激分子的表达,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激同种异体的T淋巴细胞增殖的能力.结果:在两种细胞因子的作用下,从骨髓中可以诱导出大量的DCs;且均表达DCs的表面标志(33D1).哮喘组DCs表达CD86分子的水平高于对照组,而CD40、CD80在两组之间没有差异;哮喘组与对照组DCs均能强烈刺激同种异体T淋巴细胞的增殖,哮喘组DCs的刺激能力明显强于对照组.结论:哮喘组DCs的抗原递呈能力增强,表明DCs在哮喘的发病中可能起着重要作用.
