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脐血和骨髓来源的CD34+细胞体外扩增巨核祖细胞差异的研究
本研究探讨脐血(CB)和骨髓(BM)来源的CD34+ 细胞体外扩增巨核祖细胞的差异.采用Ficoll-Hypaque分离法分离人CB及BM单个核细胞,免疫磁珠法制备CD34+细胞,在含血小板生成素(TPO)、TPO+白介素11(IL-11)或TPO+IL11+肝素的无血清液体培养体系中培养14天.流式细胞术检测扩增产物(CD34+、CD41a+及CD34+CD41a+细胞)免疫表型、巨核细胞凋亡率及DNA含量,并以集落形成单位测定法进行粒巨-噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、红系爆式集落形成单位(BFU-E)及巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk)计数.结果表明:14天培养中,CB来源细胞在总细胞数、CD41a+ 及CD34+ CD41a+细胞扩增倍数上均高于BM(P均＜0.05).0天CB及BM来源CD34+ 细胞在CFU-GM、BFU-E及总的CFU-Mk的形成能力上无显著性差异(P均＞0.05),但CB来源CD34+ 细胞形成的CFU-Mk以大集落为主,其数量高于BM(P＜0.05);在培养7、10和14天,CB及BM来源细胞CFU-GM扩增倍数无显著性差异(P均＞0.05),但CB来源细胞的BFU-E及总的CFU-Mk扩增倍数均高于BM(P均＜0.05).14天培养中CB和BM来源巨核细胞的凋亡率无显著性差异(P均＞0.05).DNA含量检测发现,14天培养中CB来源巨核细胞始终以2N细胞为主(比例＞90%),而BM来源巨核细胞随着培养时间延长,4N、8N及以上倍体巨核细胞比例逐渐增加.结论:CB来源CD34+细胞体外扩增巨核祖细胞能力高于BM,它可能是巨核祖细胞体外扩增较好的来源.
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动员人外周血巨核祖细胞体外扩增的研究
本研究探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6)组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用,研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的佳细胞因子组合及培养时间.用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血(MPB)单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天.在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数,采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的数量.结果表明:经过15天的培养,在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中,以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果好,明显高于其它3组,CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍.第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降.CFU-MK产率(/1×103个细胞)第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个,明显高于其余3组.结论:以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的佳组合,动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜.本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系.
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脐血CD34+细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究
本研究探讨人脐血CD34+细胞体外扩增的巨核祖细胞的生物学特性及其免疫原性变化,为体外扩增脐血巨核祖细胞的临床应用提供实验依据.采用Ficoll-Hapaque分离法分离人脐血单个核细胞,应用免疫磁珠法(MACS)再分离富集CD34+细胞,在含血小板生成素(TPO,50 ng/ml)、白介素-11(IL-11,50 ng/ml)和肝素(25 U/ml)的无血清液体培养体系中培养14天.用流式细胞术检测扩增产物免疫表型(CD34+、CD41a+、CD61+、CD34+CD41a+及CD34+CD61+)、巨核细胞凋亡率及其表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达,并进行巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk)的检测.结果显示:脐血CD34+细胞能够有效地向巨核细胞分化,CD41a+和CD61+细胞比例在培养第14天达到峰值,CD34+CD41+和CD34+CD61+细胞比例在扩增第7天达到高峰[分别为(3.41±2.80)%和(1.89±1.43)%];CFU-Mk大集落在扩增第7天达到高峰[(20.66 ±32.79)倍],小集落在扩增第10天达到高峰[(435.62±482.65)倍];在培养7、10和14天时巨核细胞的凋亡率分别为(19.48±9.64)%、(26.87±9.03)%和(52.46±11.74)%,其中培养7天和10天的凋亡率无显著性差异(p＞0.05),培养14天的凋亡率显著高于7天和10天(p均＜0.05);巨核细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达随着扩增天数的延长逐渐降低,其中培养0到10天阶段下降明显.结论:采用TPO+IL 11+肝素组合,可以有效地扩增脐血巨核祖细胞;培养7天,CFU-Mk大集落扩增倍数、CD34+CD41+和CD34+CD61+细胞比例均达高峰,这是巨核祖细胞体外扩增的较佳培养时间.
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血小板生成素与新生儿血小板减少
血小板生成素(thrombopoietin TPO)在体内主要是巨核细胞-血小板系的体液调控因子,在促进巨核祖细胞增殖分化,促进巨核细胞成熟及血小板的形成起主要作用.
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脐血巨核祖细胞的体外扩增
目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34+细胞定向扩增巨核祖细胞.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34+细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34+、CD41a+、CD61+、CD34+CD41a+和CD41a+CD61+)的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能.结果单用TPO 7 d时,CD34+CD41a+细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO+IL-11+肝素组扩增倍数为TPO组、TPO+IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P＜0.05).TPO+IL-11+肝素组巨核祖细胞中大集落(＞50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO+IL-11组均有明显增加(P＜0.05).将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率.电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板,有正常巨核细胞功能.结论TPO、IL-11和肝素组合的培养体系可有效扩增脐血巨核祖细胞.
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脐血巨核祖细胞体外诱导扩增的研究
目的 探讨适用于临床的诱导脐血细胞向巨核细胞分化并扩增的方法.方法 将脐血用羟乙基淀粉(HES)沉降红细胞,以Ficoll液密度梯度分离单个核细胞(MNC),并探索不同细胞因子组合以及不同培养基体外诱导其向巨核细胞分化及扩增的效果.结果 HES浓度为15 g/L沉降红细胞效果好,可获得更多的有核细胞.分别采用116t(IL-11、IL-6、TPO)、st36(SCF、TPO、IL-3、IL-6)、pt36[血小板衍生生长因子(PDGF)、TPO、IL-3、IL-6]、pst36四种不同细胞因子组合的国产无血清培养基体外诱导培养脐血MNC7d,其中st36组(50 ng/ml SCF、50 ng/ml TPO、20 ng/ml IL-3、50 ng/mlIL-6)获得的CD41 +CD61+细胞数高,为(6.79±1.97)×104.含st36的进口无血清培养基体外培养7d,细胞存活率为(82.85±0.64)％,优于含相同因子组合的国产无血清培养基[细胞存活率为(60.90±6.93)％],且获得CD41 +CD61+细胞数为(18.60-1.97)×104,高于国产无血清培养基.故以含st36的进口无血清培养基作为培养体系进行后续实验.倒置显微镜观察显示,脐血MNC随培养时间的延长,细胞数增多,细胞体积变大,培养7d细胞增殖明显.体外诱导培养10d的脐血MNC经Wright-Giemsa染色可见原巨核细胞、幼巨核细胞、颗粒型巨核细胞等不同阶段的巨核细胞;诱导培养14 d CD41+CD6+细胞率达到(54.27±6.31)％.巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)实验表明,随着诱导时间延长,CFU-MK数呈增加趋势.体外诱导14 d CFU-MK数为1 236.0±32.9,高于未诱导的脐血MNC,差异有统计学意义(P＜0.01).收集体外诱导培养10d的细胞上清,加入凝血酶,可见聚集的血小板.结论 采用HES浓度15 g/L沉降红细胞,含st36四种因子组合的进口无血清培养基诱导巨核祖细胞可获得佳的细胞数和诱导效率,且诱导的细胞能够产生有功能的血小板.
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系统性红斑狼疮重症血小板减少患者血清对巨核祖细胞的影响
研究系统性红斑狼疮(SLE)合并重症血小板患者的血清对正常人巨核祖细胞增殖分化的影响.以12例SLE重症血小板减少患者为研究对象,12份正常骨髓单个核细胞,培养中分别加入患者血清或灭活补体的患者血清,免疫化学染色检测巨核细胞克隆形成单位(CFU-MK),流式细胞仪检测CD41+细胞数.结果是正常对照组骨髓CFU-MK集落数为(61.22±29.71)个/片,加入SLE重症血小板减少患者血清后减少为(29.44±23.35)个/片,P＜0.05;加灭活补体血清后减少为(22.56±15.21)个/片,与正常对照相比P＜0.05;灭活补体与否差异不显著,P＞0.05.加入患者血清或灭活补体的血清后,CD41+细胞数由正常(2.30%±1.63%)分别减少为(1.15%±0.85%)和(1.07%±0.76%),与正常对照相比P＜0.05;灭活补体与否差异不显著.SLE血小板正常但活动期病人的血清对正常人CFU-MK和CD41+细胞的生成均无显著抑制.提示SLE重症血小板减少患者血清能抑制正常人骨髓巨核祖细胞的增殖分化,这种抑制作用是非补体依赖性的.
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特发性血小板减少性紫癜患者骨髓巨核祖细胞体外培养及其临床意义
目的探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的骨髓巨核祖细胞体外培养集落形成能力及临床意义.方法用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)检测ITP患者的外周血T淋巴细胞亚群的表达;采用胶原半固体培养法,对33例ITP及12例正常人行骨髓巨核祖细胞培养.结果 ITP组巨核祖细胞集落数与对照组差异无显著性(P>0.05);ITP中骨髓巨核细胞(MK)增高组(23/33)的CFU、BFU及总集落数与对照组比较,差异无显著性(P>0.05),而MK不增高组(10/33)CFU、总集落数显著低于对照组(P<0.05);CD4+/CD8+比值减低组较对照组CFU-MK及总集落数明显减低.结论 ITP患者巨核祖细胞培养集落数可正常或减少,可能与免疫异常有关.巨核祖细胞体外培养对ITP患者治疗方案的选择具有一定的指导意义.
关键词： 巨核祖细胞 特发性血小板减少性紫癜 胶原半固体培养 -
系统性红斑狼疮血小板减少患者巨核祖细胞分化障碍
目的明确系统性红斑狼疮(SLE)血小板减少患者骨髓巨核祖细胞增殖分化情况,以及患者血清对巨核祖细胞增殖分化的影响.方法分离7例SLE血小板减少患者(SLE血小板减少组)、11例胸外科开胸手术切除肋骨患者(正常对照组)和4例SLE血小板正常但病情活动患者(SLE血小板正常组)的骨髓单个核细胞,体外巨核祖细胞(CFU-MK)无血清半固体培养;并分别加入SLE血小板减少和SLE血小板正常患者的血清,观察血清对CFU-MK集落形成的影响.结果 SLE血小板减少组CFU-MK集落数为(27.33±9.30)个/片,明显低于正常对照组的(61.22±29.71)个/片和SLE血小板正常组的(60.00±29.71)个/片(P值均<0.05);加入SLE血小板减少患者血清后,SLE血小板减少组(n=7)和正常对照组(n=7)CFU-MK集落数分别减少为(14.29±6.73)和(29.44±23.35)个/片(P<0.05).加入SLE血小板正常患者血清后,正常对照组(n=7)CFU-MK增加到(115.60±72.99)个/片,与未加血清者的差异无显著性(P<0.05);而SLE血小板减少组(n=7)无显著增加(P>0.05).结论 SLE血小板减少患者骨髓巨核祖细胞分化障碍,患者血清对骨髓巨核祖细胞的分化具有抑制作用.
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新的肿瘤标记物血小板生成素（TPO）在肝癌诊断中的价值
血小板生成素（thrombopoiebin，TPO）通常被认为能促进巨核祖细胞的复制并促进其成熟和释放血小板，使外周血中的血小板数目增加，现在TPO已经被成功分离和克隆［1~3］。在一些肿瘤患者中发现继发的血小板增多症，在成功克隆TPO之后，发现有些肿瘤患者血清中TPO的量异常增高［4~6］。现有的肝癌血清标记物主要为甲胎蛋白（AFP），敏感性不高，TPO已受到广泛关注［7，8］。有研究认为，TPO通过与它的受体c-MpI一种细胞内原癌基因产物结合发挥其作用［9］。在文旨在评价TPO在肝癌诊断中的作用。
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更昔洛韦治疗特发性血小板减少性紫癜应用指征
目的 探讨更昔洛韦(GCV)治疗人巨细胞病毒(HCMV)感染相关的特发性血小板减少性紫癜的(ITP)应用指征.方法 选择血清HCMVDNAPCR和(或)HCMVIgM检测呈阳性ITP患儿46例,采用逆转聚合酶扩增反应(RT-PCR)检测巨核系祖细胞中HCMV晚期抗原mRNA,并行GCV治疗,判定其疗效及应用指征.结果 46例血清HCMV-DNAPCR阳性和(或)血清HCMV-IgM阳性的ITP骨髓巨核祖细胞HCMV晚期抗原基因mRNA阳性19例,GCV治疗有效16例,mRNA阴性27例,GCV治疗有效4例.阳性组疗效高于阴性组,有显著性差异(P＜0.01).结论 HCMV感染的ITP患儿,若对常规治疗无效,应检测其巨核祖细胞内HCMV晚期抗原基因mRNA,阳性者是应用更昔洛韦的有效指征.
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人类细小病毒B19感染致特发性血小板减少性紫癜的发病机制
目的探讨人类细小病毒B19(HPVB19)感染对骨髓巨核祖细胞的影响.方法运用酶联免疫吸附试验检测HPVB19-IgM、PCR检测HPVB19VP独特区DNA.筛选出并HPVB19感染特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿.骨髓行巨核祖细胞体外培养,集落细胞计数.结果外周血HPVB19-DNA阳性及血清HPVB19 IgM阳性ITP 31例患儿中,巨核祖细胞集落细胞形成减低,与正常对照组及非HPVB19感染组比较,差异有显著性.结论 HPVB19可影响巨核祖细胞集落形成.
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人微小病毒B19感染的特发性血小板减少性紫癜患儿血清对人巨核祖细胞体外生长的影响
目的:探讨人微小病毒B19(HPVB19)感染的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿血清对人巨核祖细胞(CFU-MK)增殖的影响.方法:采用巨核祖细胞体外半固体培养技术,观察HPVB19感染的ITP患儿血清对巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)生长的影响.结果:HPVB19感染的ITP患儿血清在体外能明显抑制CFUMK生长.结论:HPVB19感染后体内产生的免疫反应可能是该病毒引起ITP发生的原因之一.
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免疫因子对慢性免疫性血小板减少性紫癜骨髓巨核祖细胞体外生长的影响
目的:探讨慢性免疫性血小板减少性紫癜(CITP)骨髓巨核祖细胞生长成熟与免疫因素的关系.方法:通过巨核祖细胞体外培养,观察CITP骨髓巨核祖细胞生长和成熟情况,并观察抗CD80抗体及干扰素α-2b(IFN-α-2b)对CITP和对照组巨核祖细胞生长和成熟的影响,并与对照组比较.结果:①CITP组的各种集落数(CFU-MK、BFU-MK、mCFU-MK)均低于对照组,两组间集落数的均值比较差异有统计学意义(P＜0.05).CITP组的直径和面积均低于对照组,两组间直径和面积均值比较差异有统计学意义(P＜0.05).②加入抗CD80抗体的CITP的巨核祖细胞集落生成数明显增多(P＜0.05).③IFN-α-2b对两组的总集落均有抑制,CITP比对照组的巨核祖细胞集落生成受抑制程度低(P＜0.05).结论:CITP巨核祖细胞的集落生成和成熟度较低.抗CD80抗体和IFN-α-2b对CITP巨核祖细胞的集落形成均有影响.
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体外构建人巨核祖细胞/胃癌细胞融合体生成血小板的研究
目的 构建脐血巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体产生功能性血小板.方法 免疫磁珠分选人脐带血CD34+细胞,通过RPMI1640培养基体外静态培养,加入定向分化因子TPO、FL、IL-3、IL-6产生巨核祖细胞;复苏胃癌SGC7901细胞;采用聚乙二醇(PEG)化学融合法制备巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体,HAT筛选系统分选融合细胞,继续培养;流式细胞仪检测培养孔上层液中类血小板颗粒表面CD41、CD62p表达,血小板聚集试验、粘附试验检测血小板功能,瑞氏染色观察颗粒形态.结果 免疫磁珠分选的CD34+细胞培养7 d可增殖80倍,与胃癌SGC7901细胞株经PEG化学融合法融合成巨核祖细胞/胃癌细胞,融合率为(36.91±1.08)%;融合细胞培养10 d可增殖4倍,产生(6.1±1.21)×106/ml的类血小板颗粒;瑞氏染色后观察,其形态与正常血小板相似.类血小板颗粒表达血小板特异性标志CD41及血小板活化后标志CD62p,与正常血小板比较,CD62p在类血小板颗粒中表达略降低:正常血小板(74.11±1.71)%、类血小板颗粒(71.04±1.64)%;CD41表达明显降低:正常血小板(88.83±3.26)%、类血小板颗粒(72.51±2.79)%(t=6.59,P<0.05);聚集试验表明具有正常血小板相似的聚集功能;血小板粘附试验:正常血小板(40.43±1.63%)、类血小板颗粒(35.53±4.06%).结论 通过PEG细胞化学融合法构建的脐带血巨核祖细胞/胃癌SGC7901细胞融合体能产生功能性血小板.
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血小板生成素和白细胞介素-11对慢性特发性血小板减少性紫癜巨核细胞的影响
目的探讨重组人血小板生成素(rhTPO)及联用重组人白细胞介素-11(rhIL-11)对慢性特发性血小板减少性紫瘢(CITP)患者骨髓巨核祖细胞增殖和成熟的影响.方法采用血浆凝块法对21例CITP患者骨髓巨核祖细胞进行体外培养,培养体系中加入不同浓度的rhTPO,或同时加rhIL-11两者联用.培养14天后经SZ-21(GPⅢa)单抗和ABC试剂盒染色观察集落生长数,用MCDS-2010型超清晰度骨髓细胞分析系统进行巨核细胞的面积和直径测定.结果CITP组骨髓巨核细胞面积及直径明显低于对照组(P<0.05).rhTPO对CITP患者的巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)总集落数、巨核细胞直径与面积均有促进作用,但无浓度依赖性.体外适浓度为10ng/ml;rhTPO与rhIL-11联用组较单用组的CFU-MK、总集落数及面积、直径均显著增加.结论CITP患者骨髓巨核细胞存在成熟障碍,体外rhTPO单用及与rhIL-11联用均可促进CITP患者巨核祖细胞的增殖与成熟,其联用较单用促进作用更强.
