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磷酸腺苷活化蛋白激酶在老龄小鼠脑缺血再灌注时海马神经元凋亡中的作用
目的：评价磷酸腺苷活化蛋白激酶（ AMPK）在老龄小鼠脑缺血再灌注时海马神经元凋亡中的作用。方法健康清洁级雄性C57∕BL6小鼠72只，18～20月龄，体重34～36 g，采用随机数字表法分为3组（ n＝24）：假手术组（ S组）、脑缺血再灌注组（ I∕R组）和AMPK抑制剂Compound C组（ CC组）。采用夹闭双侧颈总动脉15 min后再灌注的方法制备脑缺血再灌注损伤模型。 CC组于夹闭双侧颈总动脉即刻腹腔注射Compound C 20 mg∕kg，I∕R组于相同时点给予等容量生理盐水。于再灌注48 h时处死，取海马组织，HE染色观察海马CA1区神经元病理学结果；采用TUNEL法检测神经元凋亡率；采用Western blot法检测海马磷酸化AMPKα（ p?AMPKα）和caspase?3的表达。结果I∕R组和CC组海马CA1区神经元发生病理学损伤，锥体细胞排列紊乱，细胞核固缩浓染。与S组比较，I∕R组和CC组再灌注48 h时神经元凋亡率升高，p?AMPKα及caspase?3表达上调（ P＜0．05）。与I∕R组比较，CC组海马p?AMPKα表达下调（ P＜0．05），神经元凋亡率和caspase?3表达差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论 AMPK与老龄小鼠脑缺血再灌注时海马神经元凋亡无明显关系。
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小剂量氯胺酮复合异丙酚麻醉下电休克对抑郁大鼠海马p-GluR1和p-CaMKⅡα表达的影响
目的 评价小剂量氯胺酮复合异丙酚麻醉下电休克(ECT)对抑郁大鼠海马磷酸化谷氨酸受体1(p-GluR1)和磷酸化钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱα表达(p-CaMKⅡα)的影响.方法 清洁级健康成年雄性SD大鼠,体重200 ～ 250 g,2～3月龄,采用慢性不可预见性轻度应激法建立大鼠抑郁模型.建立模型成功的大鼠40只,采用随机数字表法分为5组(n=8):M0-4组腹腔注射异丙酚80 mg/kg及氯胺酮10 mg/kg复合麻醉,待翻正反射消失后行不同电量ECT(频率50 Hz、正弦波、脉冲宽度0.7 ms、持续1 s),1次/d,连续7d.M0组两耳夹电极不通电,M1-4组电量分别为60、120、180和240 mC.于建模前、建模后1d、ECT后1d行糖水偏好实验,计算糖水偏好百分比(SPP).于建模后4d、ECT后4d行Morris水迷宫实验.随后处死大鼠取海马,采用Western blot法检测GluR1、p-GluR1、CaMKⅡα和p-CaMKⅡα的表达.结果 与建模前比较,M0-4组建模后SPP降低(P＜0.05).与建模后比较,M1-4组ECT后SPP增加,逃避潜伏期缩短,目标象限探索时间延长(P＜0.05);M1-4组间ECT后SPP比较差异无统计学意义(P＞0.05).ECT后,与M0组比较,M1-4组SPP升高,海马p-GluRl及p-CaMKⅡα表达上调(P＜0.05);与M2组比较,其余组逃避潜伏期延长,目标象限探索时间缩短,海马p-GluRl及p-CaMKⅡα表达下调(P＜0.05);5组间ECT后海马GluR1和CaMKⅡα表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 小剂量氯胺酮复合异丙酚麻醉下ECT抗抑郁时可损害大鼠认知功能,其机制与调控CaMKⅡα和GluR1的磷酸化水平有关.
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BKCa和PKG在氯胺酮舒张哮喘大鼠离体气管平滑肌中的作用
目的 评价大电导钙激活钾通道(BKCa)和蛋白激酶G(PKG)在氯胺酮舒张哮喘大鼠离体气管平滑肌中的作用.方法 健康SD大鼠,体重250 ～ 300 g,采用卵蛋白致敏法建立哮喘模型,取哮喘大鼠15只,每只大鼠制备2～3条离体气管环.取哮喘大鼠离体气管环36条,采用随机数字表法,将其分为3组(n=12):氯胺酮处理组(AK组)、BKCa阻断剂IBTX+氯胺酮处理组(AKI组)和PKG抑制剂KT-58232+氯胺酮处理组(AKK组)；AK组采用0.1 mmol/L乙酰胆碱预收缩大鼠气管环达稳态后,用0.4 g/L氯胺酮孵育15 min; AKI组用乙酰胆碱和氯胺酮孵育前,用3 μmol/L IBTX孵育30 min；AKK组用入乙酰胆碱和氯胺酮孵育前,用2μmol/L KT-5823孵育30 min；采用气管环相连的力-位移换能器测定气管环舒张幅度.结果 与AK组比较,AKI组和AKK组大鼠离体气管平滑肌舒张幅度降低(P＜0.05).结论 氯胺酮可通过激活BKCa和PKG信号通路舒张哮喘大鼠离体气管平滑肌.
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p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路与脂肪性肝炎
脂肪性肝病是遗传-环境-代谢应急相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征,在病理上分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化.目前学术界提出了脂肪性肝病发病机制的"二次打击"学说:初次打击主要是乙醇或胰岛素抵抗导致肝细胞的脂肪变性,为进一步的脂质过氧化反应提供了反应基质;二次打击主要为各种原因所致的氧应激/脂质过氧化损伤,炎性细胞因子释放增多,肝细胞发生炎症、坏死,引起乙醇性肝炎或脂肪性肝炎,炎症持续存在引起肝脏细胞外基质的合成大于降解,形成进展性肝纤维化和肝硬化.为什么肝细胞脂变会导致肝组织的炎性反应甚至纤维化,其内在的许多调控机制尚不清楚.本文对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)信号转导通路在脂肪性肝炎阶段发病机制中的作用做一简要的综述.
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PI3K/AKT信号传导通路在恶性肿瘤中的研究进展
磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)传导通路是细胞内重要的信号传导通路之一,该通路的过表达常出现在人类恶性肿瘤中,同时在肿瘤的进展中起到非常关键的作用.因此,PI3 K/AKT信号传导通路抑制剂将有可能成为治疗肿瘤的一种可行方法.
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黄芪、当归对粘着斑激酶表达和活化的抑制作用及其在防治血管内皮剥脱后再狭窄中的作用
经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后血管再狭窄的发生与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、迁移以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的大量合成和重构有关.粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种非受体酪氨酸蛋白激酶,介导细胞外信号由整合素向细胞内转导的过程.FAK的磷酸化激活以及由此产生的下游一系列蛋白质的磷酸化,是ECM与细胞相互作用并产生一系列生物学效应的关键环节,参与细胞增殖、迁移与凋亡的调节过程.本实验应用形态学、RT-PCR 和 Western blot方法,观察黄芪、当归注射液防治血管再狭窄与FAK表达和活化之间的关系.
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丝裂素活化蛋白激酶在胆囊收缩素对脂多糖刺激小鼠脾细胞增殖中的作用
脂多糖激活免疫细胞的过程有多种信号途径参与,如受体-酪氨酸蛋白激酶途径、丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)途径等.MAPK家族3个亚型ERK、JNK、p38各自有不同的生理作用.胆囊收缩素有抗内毒素休克的作用,可能参与休克过程中的免疫调节反应,其对淋巴细胞的免疫调节效应可能通过受体诱导激活MAPK,参与淋巴细胞活化的信号传导机制.本实验观察了8肽胆囊收缩素对脂多糖刺激后的脾细胞增殖功能的影响,以及胆囊收缩素受体和MAPK途径在其中的作用.
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重组人红细胞生成素对癫痫持续状态大鼠海马线粒体凋亡途径相关调控因子的影响及作用机制
目的：观察重组人红细胞生成素（ rHuEPO）对戊四氮（ PTZ）点燃的癫痫持续状态（ SE）的成年雄性（ SD）大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B（ p-PKB/p-Akt）、Bcl-2相关X蛋白（ Bax）和X-连锁凋亡抑制蛋白（ XIAP）表达的影响，并进一步探讨rHuEPO作用的可能机制。方法于2010年3月，由河北省实验动物中心提供的健康清洁级成年SD大鼠。采用PTZ点燃大鼠SE模型，将大鼠随机分为B组（ PTZ+0.9%氯化钠溶液）、C组（ PTZ+rHuEPO）、D组（PTZ+LY294002+rHuEPO）、E组（PTZ+二甲基亚砜+rHuEPO），同时另选取不进行SE制模的SD大鼠作为A组（0.9%氯化钠溶液），检测大鼠行为学和脑电图的改变；用原位末端转移酶标记技术（ TUNEL）检测海马神经元的凋亡情况；免疫组织化学法观察p-Akt、Bax、XIAP的阳性细胞数；反转录多聚酶链反应（ RT-PCR）方法检测各组大鼠海马Bax信使RNA（ BaxmRNA）的表达；Western blot方法检测各组大鼠海马蛋白激酶 B（ Akt）、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果与B组比较，C组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均增多， Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均减少，差异有统计学意义（ P<0.05）；与C组比较，D组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均减少，Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均增多，差异有统计学意义（ P<0.05）。结论 rHuEPO可以提高p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达水平，降低Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平，减少海马神经元的凋亡，发挥神经保护作用；加入磷脂酰肌醇3激酶（ PI3K）抑制剂LY294002后，海马p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达减少、Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达增加，海马神经元的凋亡增加，减弱了rHuEPO的保护作用。因此，PI3K/Akt信号通路是rHuEPO发挥神经保护作用的通路之一，其作用机制可能是rHuEPO活化PI3K/Akt后，提高p-Akt蛋白及线粒体凋亡途径相关调控因子XIAP的表达，下调了Bax的表达，从而介导线粒体凋亡途经，发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。
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AKT1基因多态性与重性抑郁障碍认知功能的关联分析
目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)信号传导通路中蛋白激酶B1(PKB1,又称AKT1)基因多态性与抑郁障碍及认知功能的关系.方法 采用病例对照研究,选取中国汉族首发重性抑郁患者73例和与之性别、年龄相匹配的健康对照73名.采用威斯康辛分类测验(WCST)评定2组人群的认知功能;并用汉密顿抑郁量表(HAMD)评定患者的临床症状;应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增目的 DNA片段,对PCR产物直接测序,检测4个AKT1基因单核苷酸多态性(SNP) rs2494746、rs2794738、rs3001371和rs1130214多态性.结果 ①样本的基因分布除SNP rs2794738(χ2＝14.19,P＝0.001)外均符合Hardy-Weiberg平衡(P＞0.05).②其余3个基因多态性的基因分型和等位基因频率在重性抑郁障碍患者组和对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05).③AKT1基因SNP rs3001371位点基因型与WCST非持续性错误数差异有统计学意义(χ2＝6.630,P＝0.002),两两比较显示G/G与G/A和A/A基因型患者间差异具有统计学意义(P＝0.001).结论 AKT1基因多态性与重性抑郁障碍无明显相关,但其中SNP rs3001371多态性与重性抑郁障碍的认知功能损伤存在关联性,G/G基因型患者认知功能损害较严重.
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肾组织环磷酸鸟苷通过直接的肾小管作用引起泌钠作用
目的 检测NO(一氧化氮)和cGMP(环磷酸鸟苷) 可引起肾脏泌钠作用的假设。方法 cGMP及其类似物，NO合成酶底物通过微透析泵输入肾组织间隙以及肾动脉。通过慢性及急 性动物实验，观察肾脏泌钠作用及血流动力学变化。结果 肾组织 间隙给予cGMP及其8-Br- cGMP 1 μg/h，使24 h尿钠排出从对照组(0.6±0.1) mmol/24 h增加到(1.2±0.10) mmol /24 h及(2 .15±0.42) mmol/24 h (P＜0.001)。蛋白激酶G抑制剂Rp-8-pCPT-cGMP能够拮抗二 者的利钠 作用，L-精氨酸(L-Arg)(NO合成酶底物)40 mg*kg-1*min-1可引起尿钠 排出 增加(急性动物实验)，从对照组(1.6±0.1) μmol/30 min到(4.1±0.1) μmol/3 0 min(P<0.001)，这一效应能被可溶性鸟苷酸环化酶的抑制剂ODQ阻断。NO供体SNAP 可增加肾脏利钠作用从(1.65±0.11) μmol到(2.93±0.08)μmol/30 min(P ＜0.001)，这一效应同样被ODQ阻断。肾动脉输入cGMP(3 μg/min)，可引起尿钠排出增加， 肾血流量及肾小球滤过率增加。肾组织cGMP增加肾脏泌钠作用，但不影响肾血流量及肾小球 滤过率。结论 肾脏NO诱导利钠作用通过可溶性的鸟苷酸环化酶的 激活以及cGMP产生。cGMP通过蛋白激酶G抑制肾小管钠的重吸收，与血流动力学改变无关。
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丝裂原所致活化蛋白激酶家族在缺血再灌注所致心肌细胞凋亡中的作用
缺血性心脏病是当今世界威胁人类生命健康的首敌。据统 计，1997年美国死于缺血性心脏病的人数超过46万，此单一疾病即占美国总死亡人数的20% ，远甚于其他任何疾病。随着人民生活水平的提高，缺血性心脏病也成为威胁国人健康的“ 第一杀手”。彻底阐明缺血性心脏病及继发于缺血性心脏病之后的再灌注性心肌损伤的发病 机制并寻求相应的治疗措施，是当今世界医学界亟待攻克的一项重要课题。本文以作者近年 的 研究工作为基础，结合国外本研究领域的新进展，综述丝裂素活化蛋白激酶（MAPKs）系 统在心肌缺血与缺血再灌注所致细胞凋亡中的作用。
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三七总皂甙对人肝癌细胞缝隙连接细胞间通讯的调节机制
目的:观察三七总皂甙对人肝癌细胞SMMC-7721缝隙连接细胞间通讯、以及缝隙连接蛋白32 mRNA和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2表达的影响.方法:实验于2005-08/2006-03在江西省分子医学重点实验室完成.①实验操作:SMMC-7721细胞用含100 mg/L,200 mg/L,400 mg/L三七总皂甙的培养液预处理,对照组SMMC-7721细胞不加三七总皂甙.②实验评估:采用划痕标记/染料示踪技术检测缝隙连接细胞间通讯的变化;采用反转录-聚合酶链反应检测缝隙连接蛋白32 mRNA水平;采用流式细胞仪检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的表达.结果:①对照组染料局限于划痕两侧的细胞内,无明显的荧光染料传输,GJIC阴性;三七总皂甙可上调染料传输范围,且随三七总皂甙剂量增高,染料传输范围逐渐增大,远可达三四层细胞.②反转录-聚合酶链反应结果显示,各组细胞缝隙连接蛋白32 mRNA水平差异无显著性意义(P＞0.05).③流式细胞仪结果显示,对照组SMMC-7721细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1/2表达的阳性率较高,伴随三七总皂甙剂量增加磷酸化细胞外信号调节激酶1/2表达的阳性率逐渐下降,呈一定的剂量依赖效应.结论:三七总皂甙可能通过抑制SMMC-7721细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的活化减少缝隙连接蛋白32的磷酸化,进而上调SMMC-7721细胞的缝隙连接细胞间通讯功能.
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脑损伤大鼠皮质神经细胞凋亡过程中细胞外调节激酶通路的作用
目的:细胞外调节激酶通路在凋亡信号转导中具有重要作用,观察细胞外调节激酶信号转导通路在颅脑损伤中的作用.方法:实验于2004-09/2006-01在华北煤炭医学院中心实验室完成.选用SD大鼠70只,按随机数字表法分为2组,即对照组(n=28)和模型组(n=42),每组又分为伤后10 min,30 min,3 h,6 h,24 h,48 h和72 h 7个时相点,对照组每个时相点4只大鼠,模型组每个时相点6只大鼠.按照Mamarou方法建立大鼠重型弥漫性颅脑损伤模型,在不同时相点采用免疫组化、Western-blot法分别检测两组大鼠颅脑损伤后皮质细胞外调节激酶的表达情况,另外分别应用原位杂交方法、原位末端标记法检测半胱氨酸天冬氨酸酶3及凋亡细胞,并进行比较.结果:70只大鼠全部进入结果分析,无脱失.①模型组大鼠皮质p-细胞外调节激酶1/2蛋白在伤后10 min时已较对照组明显升高(P＜0.05),逐渐增强,伤后6 h达高峰,24 h仍有大量表达,明显高于对照组(P＜0.01),至伤后48 h降至对照组水平(P＞0.05).②模型组大鼠皮质半胱氨酸天冬氨酸酶3 mRNA杂交阳性信号表达在伤后3 h开始升高,48 h达高峰,72 h仍明显高于对照组(P＜0.01).③模型组大鼠皮质伤后3 h偶见原位末端标记阳性细胞,6 h开始增加,明显高于对照组(P＜0.01),48 h达高峰.④p-细胞外调节激酶1/2蛋白与半胱氨酸天冬氨酸酶3 mRNA及原位末端标记阳性细胞均主要分布于损伤中心区及其周围,在分布区域上呈现很大的相似性.结论:脑损伤时p-细胞外调节激酶1/2蛋白表达呈一种过度激活状态,而且与半胱氨酸天冬氨酸酶3 mRNA及原位末端标记阳性细胞在分布区域上呈现很大的相似性,推测大鼠脑损伤后细胞外调节激酶通路的过度激活是导致神经细胞凋亡的作用途径之一.
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粘着斑激酶磷酸化与大鼠血管内膜剥脱术后血管新生内膜中细胞增生程度的相关性
背景:粘着斑激酶磷酸化参与细胞增殖、迁移与凋亡的调节过程.在血管再狭窄发生过程中,粘着斑激酶是否参与、介导了血管平滑肌细胞的迁移与增殖目前尚未见报道.目的:分析粘着斑激酶磷酸化与大鼠血管内膜剥脱术后血管重塑的关系.设计:随机对照动物实验.单位:咸宁学院心血管病研究所、深圳市慢性病防治院和华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科.材料:实验于2005-03/05在武汉同济医院心血管实验室完成.选用雄性Wistar大鼠40只,动物实验符合动物伦理学要求.方法:①将40只大鼠按随机数字表法分为5组(n=8),即非内皮剥脱对照组、内皮剥脱术后4 d、8 d、16 d和24 d组.②后4组建立大鼠主动脉内皮剥脱术后再狭窄模型,分别于术后4,8,16和24 d取内膜剥脱部位血管段进行形态学观察,以出现形态学变化作为模型成功的依据;应用Western blolt方法检测粘着斑激酶总含量及磷酸化粘着斑激酶含量.以结扎左颈总动脉的大鼠胸腹主动脉作为对照.主要观察指标:各组大鼠主动脉粘着斑激酶及磷酸化粘着斑激酶表达水平.结果:40只大鼠全部进入结果分析.①非内皮剥脱对照组大鼠主动脉血管可检测到少量粘着斑激酶,主要是以非磷酸化形式存在;内皮剥脱术后4 d组粘着斑激酶和磷酸化粘着斑激酶含量均显著高于非内皮剥脱对照组(P＜0.05).随着损伤时间的延长,粘着斑激酶和磷酸化粘着斑激酶含量显示相同的变化趋势.但粘着斑激酶在术后第8天达到峰值,一直持续到术后第16天,此后开始下降;磷酸化粘着斑激酶峰值出现在术后16 d,在峰值水平上持续时间较短.②形态学观察显示,术后8 d可见新生内膜中局灶性细胞增殖,术后16～24 d内膜呈弥漫性增厚.结论:粘着斑激酶参与大鼠血管内膜剥脱术后血管重塑,血管新生内膜中细胞增生程度与磷酸化粘着斑激酶及粘着斑激酶总含量的变化密切相关.
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缺氧复合烧伤后血清诱导心肌细胞凋亡变化中p38激酶的作用
目的:观察缺氧复合烧伤血清作用条件下心肌细胞的凋亡变化,探讨p38激酶、caspase-3在其中的作用.方法:采用乳鼠心肌细胞原代培养,检测缺氧复合烧伤血清作用后心肌细胞p38激酶的磷酸化程度,对比观察使用SB203580抑制p38激酶前后,心肌细胞caspase-3活性、酶前体蛋白表达及心肌细胞凋亡率变化.结果:缺氧复合烧伤血清使心肌细胞p38激酶迅速、持续活化,使用SB203580可降低心肌细胞caspase-3活性、稳定caspase-3酶前体和减少心肌细胞凋亡.结论:p38激酶途径参与缺氧复合烧伤血清诱导的心肌细胞凋亡过程,促进caspase-3活化是其介导凋亡的重要机制.
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脑缺血再灌注后皮质区和纹状体区细胞周期蛋白D1和周期蛋白依赖性蛋白激酶4基国表达对神经细胞凋亡的影响
背景:脑缺血再灌注后细胞周期蛋白的表达以其在凋亡机制中的作用为主,部分细胞凋亡是由于细胞增殖周期的异常调控所致. 目的:研究脑缺血再灌注后细胞周期蛋白 D1( cyclin D1)和周期蛋白依赖性蛋白激酶 4( cyclin dependent kinase,CDK4)基因表达及其与神经细胞凋亡的关系. 设计:随机对照的实验研究. 地点和材料:本实验在青岛大学医学院脑血管病研究所和山东省脑血管病防治重点实验室完成.成年健康雌性 SD大鼠 36只,体质量 230～ 270 g,清洁级,由中国科学院上海实验动物中心提供.将动物随机分为假手术组 4只和实验组 32只,实验组再进一步分为缺血 1.5 h再灌注 2, 6, 12 h, 1, 2, 3, 7和 14 d亚组,每组 4只. 方法:全部实验均由本文作者完成.具体方法:应用线栓法经左侧颈外-内动脉插线建立 SD大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,原位末端标记法检测脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的变化,原位杂交技术检测 cyclin D1 mRNA和 CDK4 mRNA的表达. 结果:脑缺血再灌注 2 h脑组织即开始出现凋亡神经细胞,并于 1 d和 2 d分别在皮质区和纹状体区达高峰(分别为 72.80± 4.66和 96.75 ± 4.37).神经细胞 cyclin D1 mRNA和 CDK4 mRNA的表达分别于再灌注 2 h和 6 h开始逐渐增强,并于 12 h和 1 d分别在皮质区和纹状体区达高峰(皮质区分别为 94.50± 2.75和 85.75± 3.73,纹状体区分别为 88.25± 5.06和 89.80± 2.93),至再灌注 14 d降至假手术组水平. cyclin D1 mRNA和 CDK4 mRNA的表达与凋亡细胞的区域基本相同. 结论:脑缺血再灌注后皮层区较纹状体区对缺血更为敏感, cyclin D1 mRNA和 CDK4 mRNA表达可能是诱导细胞凋亡的重要因素之一.
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血小板源生长因子对瘢痕成纤维细胞胞外信号调节激酶的影响
目的:分析血小板源生长刺激因子 (PDGF)刺激后各种成纤维细胞中胞外信号调节激酶 (ERK)的表达及磷酸化情况,研究瘢痕特别是瘢痕疙瘩发病过程中 ERK的作用. 方法:应用免疫印迹 (IB) 方法检测 5例瘢痕疙瘩成纤维细胞 (KFB)、瘢痕疙瘩周边相对正常皮肤成纤维细胞 (rNHDF)及正常人皮肤成纤维细胞( NHDF)的 ERK表达及其蛋白磷酸化. 结果:①无刺激条件下, ERK 在 KFB,rNHDF及 NHDF中的表达及磷酸化无差异.② PDGF-BB刺激后 ,3组成纤维细胞 ERK磷酸化增强 ,非磷酸化含量无明显改变.③ DGF-BB刺激后, KFB中 ERK蛋白磷酸化明显高于其他两组成纤维细胞. 结论 :瘢痕疙瘩细胞外基质的过度沉积可能与 KFB内 PDGF结合位点自身磷酸化和 ERK的磷酸化增强有关.
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高血糖状态对大鼠骨骼肌和心肌C-Jun氨基末端激酶和p38信号转导系统的影响
目的:探讨高血糖状态对大鼠骨骼肌和心肌 C- Jun氨苯末端激酶( C- JunN- terminal kinase, JNK)和 p38激酶活性的作用,进一步了解糖尿病的发病机制,为糖尿病的临床康复治疗提供一些理论依据. 方法: 12周龄、体质量 200～ 230 g的 SD大鼠 12只,根据是否注射链脲佐菌素 ( streptozotocin, STZ)随机分为高血糖组( n=6)和正常血糖组( n=6).高血糖组大鼠腹腔内注射 STZ( 65 mg/kg)建立持续高血糖模型(血糖 >16 mmol/L).正常血糖组大鼠不注射 STZ,维持正常血糖.运用化学发光法测定骨骼肌和心肌 JNK和 p38活性. 结果:骨骼肌和心肌 JNK活性在高血糖组明显增高,分别高于正常血糖组 1.8倍和 1.4倍.骨骼肌和心肌 p38活性在高血糖组分别高于正常血糖组的 2.0倍和 1.6倍. 结论:高血糖状态可以激活骨骼肌和心肌 JNK和 p38信号转导通道.提示细胞信号转导系统参与了糖尿病的发病机制.
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模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞蛋白激酶MEK 1的活性变化
背景:模拟失重条件下,骨形态发生蛋白2诱导的大鼠骨肉瘤成骨样细胞(ROS17/2.8)的I型胶原α1链的基因表达下降,而丝裂原激活的蛋白激酶信号传导通路中的蛋白激酶MEK1参与了骨形态发生蛋白2对成骨细胞I型胶原α1链mRNA表达的调节过程,但是在模拟失重条件下MEK1的活性如何变化尚不清楚.目的:观察模拟失重条件下由骨形态发生蛋白2诱导的ROS17/2.8细胞中MEK1激酶活性的变化.设计:不完全随机对照的实验.单位:解放军第四军医大学航空航天生物动力学教研室.材料:大鼠骨肉瘤成骨样细胞.方法:实验于2002-08/2003-01在北京航天医学工程研究所航天细胞与分子生物学实验室完成.在地面1 G和回转器模拟失重条件下培养ROS17/2.8细胞,培养时间分别为24,48和72 h.分为7组:第1组,空白对照组,即1G条件下不加骨形态发生蛋白2培养24 h;第2组,1 G培养24h;第3组,失重培养24h;第4组,1G培养48 h;第5组,失重培养48 h;第6组,1G培养72 h;第7组,失重培养72 h;第2组至第7组均加入骨形态发生蛋白2.培养结束前1 h加入骨形态发生蛋白2(500 mg/L),1 h后提取细胞蛋白,应用Western Blotting法检测MEK1的活性.主要观察指标:观察细胞中的总ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的含量.结果:①模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导后ROS17/2.8细胞的总ERK1/2的表达:各实验组细胞的总ERK1/2蛋白表达量无明显差异.②模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导后ROS17/2.8细胞的磷酸化ERK1/2的表达:第1组,细胞培养液中不含骨形态发生蛋白2在1 G重力条件下培养24 h,p-ERK1/2呈低水平表达,第2组,即培养液中加入骨形态发生蛋白2在1 G条件下培养24 h,p-ERK1/2的表达量明显高于第1组(P＜0.01).各模拟失重组p-ERK1/2表达量均低于相同时间点1 G重力对照组,即第3,5,7组的表达分别低于第2,4,6组(P＜0.01),且随着失重时间延长,第3,5,7组的p-ERK1/2表达量呈逐渐降低的趋势(P＜0.01).结论:模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导的成骨细胞丝裂原激活的蛋白激酶信号通路中蛋白激酶MEK1的活性下降.
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体内外不同环境下成纤维细胞丝裂素原激活蛋白激酶的变化
目的:观察脱离体内环境因素时成纤维细胞中信号蛋白表达及细胞生物学特性的变化.方法:瘢痕疙瘩和正常皮肤(作为阴性对照)均来自北京大学第三医院成形科手术患者各6例.取小块瘢痕疙瘩和正常皮肤组织,用组织块接种法进行成纤维细胞原代培养后,进行细胞传代.试验所用为第5～8代细胞.①评价信号蛋白的含量,用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶的积分吸光度值.②评价信号蛋白的活化强度,用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶的平均积分吸光度值.③评价信号蛋白的活化程度用活化率值(磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值÷p44/42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值).结果:①p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶平均积分吸光度值比较:瘢痕疙瘩成纤维细胞均低于正常皮肤成纤维细胞(0.023±0.005和0.025±0.005,0.030±0.000和0.042±0.004,P＜0.05).②p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值比较:瘢痕疙瘩成纤维细胞p44/42丝裂原活化蛋白激酶高于正常皮肤成纤维细胞(6 048.7±1 576.2,3 006.3±174.4,P＜0.05),瘢痕疙瘩成纤维细胞磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶与正常皮肤成纤维细胞无差异(4 876.0±895.8,3 966.5±533.1,P＞0.05).③p44/42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶活化率比较:瘢痕疙瘩成纤维细胞低于正常皮肤成纤维细胞(0.830±0.134,1.319±0.156,P＜0.05).结论:成纤维细胞在脱离生物体内环境后,其生物学特性发生改变.体外细胞培养中,磷酸化的p44/42丝裂原活化蛋白激酶的表达水平在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间无明显差别,而p44/42丝裂原活化蛋白激酶的活化程度和活化强度在正常皮肤成纤维细胞明显高于瘢痕疙瘩成纤维细胞.
