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表皮生长因子受体酪氨酸激酶区基因突变研究进展
该文着重介绍表皮生长因子受体酪氨酸激酶区基因突变的特点、这种突变对非小细胞性肺癌患者接受表皮生长因子受体抑制剂治疗的临床意义,以及在其他肿瘤发生的状况,阐述了对表皮生长因子受体酪氨酸激酶区进行基因突变筛选的新进展.
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酪氨酸激酶Etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系
目的:观察酪氨酸激酶Etk的表达与放射引起的鼻咽癌细胞株凋亡之间的关系,探讨Etk对放射引起的鼻咽癌细胞凋亡的调节机制.方法:运用免疫荧光技术和流式细胞术检测4株鼻咽癌细胞Etk的表达情况;直线加速器6MV-X射线2 Gy单次剂量照射细胞后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,以及与Etk,凋亡相关蛋白Bcl-2及Bak表达的关系.结果:流式细胞仪检测显示4株鼻咽癌细胞Etk表达水平分别为:5-8F(73.3±3.4)%, 6-10B(50.5±6.1)%,CNE-1(47.7±1.9)%,CNE-2(29.5±1.7)%.免疫荧光显示,Etk蛋白主要在鼻咽癌细胞胞质中表达,胞核中表达微弱.统计分析表明,放射线照射后,鼻咽癌细胞株Etk的表达降低,并与细胞的凋亡率及Bak蛋白的表达呈负相关,与Bcl-2的表达无关.结论:Etk蛋白与放射引起的鼻咽癌细胞凋亡有关,它可能通过调节凋亡蛋白Bak的表达参与了放射后鼻咽癌细胞的凋亡.
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Bcr-Abl酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达
目的:制备Bcr-Abl激酶域及其突变体-His的重组蛋白. 方法:用PCR方法从含有Bcr-Abl全长的质粒pGD210中扩增出Bcr-Abl激酶域片段,再通过重组PCR技术获得激酶域的几个主要突变体(T315I,Y253F,E255K,E255V),测序正确后将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建表达激酶域片段和His标签融合表达的载体,IPTG诱导表达,得到的融合蛋白用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化. 结果:成功得到了Bcr-Abl激酶域及其突变体序列,经序列分析证实后将重组质粒转入BL-21进行表达. 结论: 通过重组PCR技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合蛋白表达在包涵体,占菌体总蛋白的70%以上. 经Ni-NTA镍珠纯化后,纯度在95%以上.
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三羟基异黄酮对增生性瘢痕成纤维细胞受体型酪氨酸蛋白激酶-丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响
目的 了解5,7,4'-三羟基异黄酮(genistein)对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)内受体型酪氨酸蛋白激酶-丝裂原活化蛋白激酶(TPK-MAPK)信号转导通路的影响,探讨genistein抑制瘢痕增生的分子机制. 方法体外分离培养HSFb,以不同浓度genistein(25、50、100μmol/L)处理细胞,再加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激,用[γ-32P]腺苷三磷酸底物掺入法检测细胞TPK活性;用蛋白质印迹法检测TPK-MAPK通路中主要信号蛋白分子c-Raf、丝裂原激活蛋白激酶激酶(MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化蛋白的表达变化.以二甲亚砜溶剂处理的HSFb为对照组. 结果 25、50、100μmol/L genistein作用后,HSFb内TPK活性分别为(7.15±0.35)、(5.62±0.88)、(3.17±0.94)×105 pmol·min-1·mg-1,与对照组(8.92±0.28)×105 pmol·min-1·mg-1比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);细胞内磷酸化c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、p38蛋白的含量均有不同程度降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).genistein各剂量组磷酸化JNK蛋白含量与对照组近似.在genistein预处理前提下,加入bFGF刺激的细胞内TPK活性及各信号蛋白的表达亦呈下降趋势. 结论 genistein可通过抑制细胞受体TPK信号转导途径影响HSFb的增殖与活化,主要信号通路可能为TPK→Raf→MEK→ERK/p38途径.
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严重烫伤大鼠肝细胞胰岛素信号转导缺陷机制的研究
目的探讨严重烫伤大鼠肝细胞中胰岛素信号转导缺陷的环节,初步阐明严重烫伤后机体产生胰岛素抵抗的分子基础.方法以30%体表面积Ⅲ度烫伤大鼠为模型,采用麦胚凝集素-葡聚糖4B亲和层析技术,部分纯化大鼠肝细胞胰岛素受体,通过胰岛素受体结合、受体蛋白自身磷酸化、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影和外源性底物磷酸化方法,观察烫伤大鼠早期肝细胞胰岛素受体结合行为、受体β-亚基自身磷酸化和受体酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的变化.结果大鼠烫伤后3 d,肝细胞胰岛素受体大结合容量及亲和力无明显改变;受体β-亚基自身磷酸化能力明显下降;受体TPK活性明显降低,对胰岛素刺激的反应性明显减退.结论严重烫伤后,大鼠肝细胞中的胰岛素信号转导发生偶联障碍,导致胰岛素生物效应受体后缺陷,可能是胰岛素抵抗发生的分子基础.
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新方法随机筛选血管内皮生长因子受体1激酶的抑制剂
目的:利用重组血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1激酶蛋白质建立大规模随机筛选分子模型.方法:重组人源VFGF受体1激酶蛋白质的催化活性通过酶联免疫法检测96孔板上的底物磷酸化程度得到.用大规模随机筛选寻找抑制剂,并在稳定表达VEGF受体1的细胞系上研究它们的性质.结果:在研究VEGF受体1激酶蛋白质大肠杆菌表达体系的基础上,建立了大规模筛选模型.通过对2800个有机化合物的筛选,找到了两个二取代呋喃类的VEGF受体1激酶抑制剂(A1和A5).其中化合物A1能抑制底物磷酸化,而化合物A5则对激酶的自磷酸化和底物磷酸化都能抑制.同时A1和A5都能影响转染细胞上的受体磷酸化作用.结论:利用重组受体激酶建立的分子模型为寻找抗肿瘤血管生成抑制剂提供了一个简单而有效的方法.
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脑缺血再灌注后酪氨酸蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性变化及其机制
目的：研究脑缺血再灌注后沙土鼠海马突触体蛋白质酪氨酸激酶(PTK)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)活性的变化及其引起变化的机制．方法：双侧颈总动脉结扎(15 min)形成全脑缺血模型；放射性同位素γ-32p掺人法和比色法分别测定了总PTK和PTP的活性，免疫沉淀和γ-32p放射性同位素测定Src和PYK2活性，免疫印渍测定Src和PYK2蛋白表达量．结果：①脑缺血再灌注引起PTK活性升高，而PTP活性不变．②在假手术对照组中，Src比PYK2活性高，脑缺血再灌引起Src活性明显升高，而PYK2活性无显著变化．③脑缺血前腹腔分别给予氯胺酮和硝苯地平，都能拮抗脑缺血再灌注引起的PTK和Src活性的升高，但对PTP活性无影响．结论：脑缺血再灌注能诱导沙土鼠海马突触体总的PTK活性升高，而对PTP活性无影响，PTK活性的升高主要是Src活性的增加而与PYK2无关；脑缺血再灌注诱导PTK和Src活性升高是通过NR和L-型电压门控钙通道介导的，即与这两种钙通道的激活有关，而与其蛋白表达量无关．
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槲皮素对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的抑制作用
目的:研究槲皮素(Quercetin,Que)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱发培养乳鼠心肌细胞肥大的抑制作用及机制.方法:分别用[3H]胸苷、[14C]尿苷和[3H]酪氨酸标记测定DNA、RNA和蛋白质合成;用Lowry法测定蛋白质含量;用组蛋白ⅢS、[γ-32p]ATP与蛋白激酶C(PKC)酶液一起保温测定PKC活性;用聚谷氨酸@酪氨酸(4:1)多肽、[γ 32p]ATP与酪氨酸蛋白激酶(TPK)酶液一起保温测TPK活性.结果:AngⅡ作用于心肌细胞24h后,心肌细胞总蛋白含量明显增加(P＜0.01),[14C]尿苷和[3H]酪氨酸掺入量明显增加(P＜0.01),而[3H]胸苷掺入量未见增加(P＞0.05);AngⅡ作用30 min后,心肌细胞PKC和TPK活性明显增加.Que(1-100μmol/L)能剂量依赖性地抑制AngⅡ所致心肌细胞总蛋白含量、[14C]尿苷和[3H]酪氨酸掺入量、PKC及TPK活性的增加.结论:Que可抑制AngⅡ致培养乳鼠心肌细胞肥大,该作用与抑制PKC及TPK活性有关.
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颈深肌肌梭密度及背根节NT-3和Trk C 表达与退变性颈椎失稳关系
目的 研究人颈深肌肌梭密度及神经营养因子3(NT-3)、酪氨酸激酶C(Trk C)在相应背根神经节中的表达随年龄变化的规律,探讨它们在颈椎失稳中的作用.方法 经甲醛固定1年以内的尸体12具,按年龄分为婴儿组5具,青少年组3具,老年组4具,测定其颈深肌群中的颈长肌及头夹肌肌梭密度,应用免疫组化的方法观察NT-3、Trk C在相应背根节神经元的表达.结果 婴儿组颈长肌、头夹肌肌梭密度均高于青少年组及老年组(F=19.28、93.47,q=7.11～16.58,P<0.01),青少年组及老年组颈长肌、头夹肌肌梭密度无明显差异(q=0.112、0.597,P均>0.05).与婴儿组比较,青少年组NT-3、Trk C免疫组化染色强,老年组染色弱,差异有显著性(F=53.32、141.99,q=3.507～23.663,P<0.01).结论 肌梭密度变化对退变性颈椎失稳发生发展无太大的意义,NT-3、Trk C的分泌减少可能与退行性颈椎失稳有关.
