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针对Twist的短发夹RNA抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭
背景与目的:上皮-间充质转分化在胚胎发育和肿瘤转移过程中起重要作用.在发现人肺腺癌A549细胞高表达转录因子Twist的基础上,本实验研究了针对Twist的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对体外培养的人肺腺癌A549细胞上皮-间充质转分化和体外侵袭能力的影响.方法:构建能表达针对Twist mRNA的shRNA的阳性RNA干扰(RNAi)质粒和表达不针对任何已知mRNA的shRNA的阴性RNAi质粒,分别转染至A549细胞,新霉素抗性筛选得到Twist表达受抑制的阳性RNAi细胞(Pi组)和Twist表达未受影响的阴性RNAi细胞(Ni组).针对正常(C组)、Pi、Ni三组A549细胞,分别采用RT-PCR和Western blot技术检测Twist、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙粘素表达,用Boyden小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:C组:Twist和α-SMA表达强阳性,E-钙粘素表达弱阳性,Boyden小室穿膜细胞数为57.4±3.4;Pi组:和C组相比,Twist和α-SMA表达显著减弱(P＜0.01),E-钙粘素表达显著增强(P＜0.01),Boyden小室穿膜细胞数显著减少(P＜0.01);Ni组:Twist、α-SMA和E-钙粘素表达,及Boyden小室穿膜细胞数皆和C组无显著差异(P＞0.05).结论:针对Twist的shRNA能有效地抑制A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭能力.
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阿魏酸钠对培养的皮质神经细胞内游离Ca2+的影响
目的:研究阿魏酸钠对谷氨酸诱导培养的皮质神经细胞损伤的作用.方法:采用新生大鼠皮质神经细胞原代培养建立谷氨酸神经细胞损伤模型,用Ca2+指示剂Fura-2/AM检测神经细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的变化,并观察反映神经细胞受损程度的培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量的变化.结果:阿魏酸钠40～100μmol@L-1能剂量依赖性抑制谷氨酸钠所引起的[Ca2+]i升高及LDH释放.结论:阿魏酸钠通过抑制谷氨酸钠所引起的[Ca2+];升高可能是其抗氧化性神经损伤作用的重要机制.
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氨基胍抑制糖基化终产物促进大鼠胰星状细胞增殖和基质合成的作用
目的:探讨抗糖基化药物氨基胍(AG)对高级糖基化终产物(AG Es)促进大鼠胰星状细胞(PSC)增殖和基质合成的干预作用.方法:用非同位素的溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法和时间分辨免疫荧光法测定PSC的增殖过程,以时间分辨免疫荧光法和免疫细胞化学法观察了AGEs 对大鼠PSC纤连蛋白合成的作用,并观察了氨基胍对上述效应的干预作用.结果:AGEs能以浓度相关的方式明显增强PSC的增殖和纤连蛋白的合成, AG处理的AGEs上述效应明显减弱.结论:AG对AGEs促进PSC增殖和基质合成有明显的抑制作用.
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体外培养的大鼠成骨细胞在钙化过程中的凋亡
目的:建立在体外培养时能保持分化表型的成骨细胞实验模型,并观察成骨细胞在体外的凋亡.方法:用酶解的方法从新生SD大鼠颅骨分离成骨细胞;用改良钙钴法及偶氮染色法测定其碱性磷酸酶(AKP)活性;用Von Kossa染色法及Fluo-3染色法检测其钙化沉积物:根据凋亡细胞中乙酰胆碱酯酶(AChE)高表达的特性,用乙酰胆碱酯酶染色法观察不同时期的凋亡细胞.结果:原代大鼠颅骨成骨细胞在体外培养44天中,逐步形成包括多层细胞结节,钙化的细胞外基质组成的骨样组织,随着基质的钙化,凋亡细胞逐步增多.结论:大鼠颅骨成骨细胞在体外发育过程的表型能反映成骨细胞在体外的成熟过程,是研究成骨细胞生物学理想的实验模型.
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丙丁酚抑制体外氧化低密度脂蛋白诱导的单核细胞对内皮细胞的粘附
目的:研究丙丁酚抑制体外氧化低密度脂蛋白诱导的单核细胞对内皮细胞的粘附机制.方法:采用酶联免疫法检测丙丁酚对内皮细胞粘附分子、细胞间粘附分子l(ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、P-选择素和E-选择素表达的影响,对比分析丙丁酚和上述粘附分子单克隆抗体抑制氧化低密度脂蛋白诱导的单核细胞对内皮细胞的粘附作用.结果:丙丁酚呈浓度依赖性抑制氧化低密度脂蛋白诱导的单核细胞对内皮细胞的粘附,丙丁酚浓度从10 μmol/L增加到80μmol/L,单核细胞对内皮细胞的粘附从16.7%降低至7.0%(P＜0.01),同时ICAM-1和P-选择素表达分别被抑制75%和72%(P＜0.01),可是对VCAM-1和E-选择素表达无明显作用.单独使用ICAM-1和P-选择素单克隆抗体只能微弱抑制单核细胞对内皮细胞的粘附,两者合用则可显著抑制,粘附指数为11.3%(P＜0.01),但仍然高于丙丁酚保护的粘附指数9.3%.结论:丙丁酚通过多途径抑制氧化低密度脂蛋白诱导的单核细胞对内皮细胞的粘附,其中包括抑制ICAM-1和P-选择素的表达.
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前列腺素A1通过NF-κB介导抑制大鼠心脏微血管内皮细胞凋亡
NF-κB;细胞凋亡;bcl-2基因;原位切口末端标记目的:研究前列腺素A1(PGAl)对心脏微血管内皮细胞凋亡的影响.方法:培养分离大鼠心脏微血管内皮细胞,建立缺氧再给氧模型,通过原位缺口末端标记观察PGAl对内皮细胞凋亡的作用;通过凝胶电泳迁移率测定NF-κB的活性;用Western blot法测定Bcl-2和Bax蛋白表达;用Northern blot法测定bcl-2 mRNA的表达.结果:PGAl能明显减少缺氧再给氧内皮细胞的凋亡,抑制NF-κB的活性,升高Bcl-2蛋白及bcl-2 mRNA的表达,不改变Bax蛋白的表达,导致Bcl-2/Bax增加.结论:PGAl通过NF-κB介导抑制大鼠心脏微血管内皮细胞的凋亡.
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VFGF通过对p38和p42/p44 CCDPK信号的共调节作用抑制TNF-α和H2O2诱导的牛主动脉内皮细胞凋亡
目的:研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)对肿瘤坏死因子(TNF-ot)和过氧化氢(H2O2)诱导牛主动脉内皮细胞(BAEC)凋亡的影响及信号机制.方法:BAEC培养并传代于DMEM.经TNF-a或H2O2处理24 h后,Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察形态学变化及凋亡细胞计数.MTT法测定细胞活性,琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解,Western blot法检测磷酸化p38和p42/p44 CCDPK表达.结果:TNF-α5000 kU/L和H2O2 300 tμmol/L均可诱导BAEC产生DNA断片.VEGF 100μg/L显著增强TNF-a和H2O2诱导的磷酸化p42/p44 CCDPK表达,而明显抑制磷酸化p38 CCDPK的活化.对二者所致BAEC凋亡起明显的抑制作用.P42/p44 CCDPK抑制剂U0126可取消VEGF引起的磷酸化p42/p44 CCDPK表达上调和其抗凋亡作用.结论:VEGF通过其共调节作用激活p42/p44 CCDPK,抑制p38 CCDPK信号途径而对TNF-α和H2O2所致凋亡产生的抑制效应,是内皮细胞存活的重要机制.
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氟哌啶醇季铵盐衍生物抑制氯化钾所致大鼠主动脉平滑肌细胞内钙浓度增加
目的：动态观察氟哌啶醇季铵盐衍生物(F3)对血管平滑肌细胞内钙浓度的影响.方法：利用激光共霖焦显微镜动态观察F3(0.01-10μmol/L)对由KC(30 mmol/L)诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙荧光强度增加的作用.结果：KCl可诱发细胞内钙荧光强度迅速增强，F3可以拮抗由KCl诱导的细胞内钙荧光强度增强作用，并呈量效依赖性和时间依赖性，终强度(KCl：67±24；F30.0lμmol/L：57±13；0.1μmol/L：40±13；1 μmol/L：29±9；10μmol/L：20±6).在加入F3后，钙荧光强度的变化快时程是在给F3后O-30 s.结论：F3拮抗血管收缩主要是由于阻断了Ca2+通道.
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双苯氟嗪对豚鼠心室肌细胞L-钙电流的影响
目的：观察双苯氟嗪(Dip)对豚鼠心室肌细胞L-型钙电流(ICa-L)的影响.方法：酶解法制备单个心室肌细胞.应用全细胞膜片箝技术记录豚鼠单个心室肌细胞钙电流.结果：在0.3-30μmol/L范围内，Dip可浓度依赖性地降低电压依赖性激活ICa-L峰值，被Dip 3 μmol/L所抑制的ICa-L在冲洗5 min后可得到部份恢复.但Dip对ICa-L的电压依赖特征，大激活电压，以及ICaL稳态激活无明显影响.在Dip3 μmol/L存在下，半数激活电压(V0.5)和斜率参数(κ)与对照组相比，差异均无显著性.V0.5分别为(-12.8±1.7)mV和(-13.2±2.4)mV，κ分别为(7.1±0.4)mV和(7.5±O.5)mV(P＞0.05).Dip3μmol/L可明显使钙电流稳态失活曲线左移，加速钙通道电压依赖性稳态失活.V0.5分别为(-19.7±2.4)mV和(-3l±6)mV，κ分别为(3.6±0.3)mV和(1.8±0.2)mV(P＜0.05).Dip 3 μmol/L还使ICa-L从失活状态下的恢复明显减慢.结论：Dip主要作用于L-型钙通道的失活状态，加速钙通道失活，并使其从失活状态下恢复减慢，从而抑制ICa-L.
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p38和p44/42 CCDPK信号在TNF-α诱导牛主动脉内皮细胞凋亡中的相反作用
目的：研究肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导牛主动脉内皮细胞(BAEC)凋亡及其信号途径.方法：BAEC培养并传代于DMEM.经TNF-α处理24 h后，Hoechst33258染色，荧光显微镜观察形态学变化及凋亡细胞计数.MTF法测定细胞活性，琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解，Western blot法检测磷酸化p38和p44/42CCDPK表达.结果：TNF-α诱导BAEC产生典型的凋亡细胞形态学变化(核浓染，核碎裂)和DNA断片.TNF-α(1000-5000 kU/L)浓度依赖性诱导BAFC凋亡，并同时刺激磷酸化p44/42和p38CCDPK的表达.p44/42 CCDPK抑制剂U0126可完全阻断TNF-α诱导的p44/42 CCDPK的活化，显著增强TNF-α致凋亡作用；而p38 CCDPK抑制剂SB203580可完全阻断TNF-o诱导的p38 CCDPK的活化，还可增强TNF-α诱导的磷酸化p44/42 CCDPK的表达，明显抑制TNF-α促凋亡作用.结论：TNF-α同时激活p38和p44/42 CCDPK，这两种CCDPK信号通路在TNF-α诱导BAEC凋亡中起相反作用.
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爱普列特抑制体外培养的大鼠前列腺上皮细胞生长
研究爱普列特对体外培养前列腺上皮细胞表皮生长因子受体和胰岛素样生长因子-Ⅰ受体表达的影响，探讨其抗前列腺增生的分子机制。方法：MTT法检测爱普列特对外源性表皮生长因子(epider-mal growth factor，EGF)，胰岛素样生长因Ⅰ(insulin-1ike growth factorⅠ，IGF-Ⅰ)诱导的大鼠前列腺上皮细胞增殖的作用，逆转录PCR及流式细胞术定量检测体外培养前列腺上皮细胞EGFR和IGF-Ⅰ R mRNA及蛋白表达。结果：爱普列特180 nmol/L和360nmol/L可以明显抑制IGF-Ⅰ 5，25μg/L诱导的细胞增殖；爱普列特360 nmol/L可以抑制EGF 25μg/L诱导的细胞增殖；爱普列特360 nmol/L可以明显下调EGFR、IGF-Ⅰ R mRNA的表达，而爱普列特180nmol/L则没有明显作用；爱普列特180 nmol/L和360 nmol/L均可以明显下调EGFR和IGF-Ⅰ R蛋白的表达。结论：爱普列特抗前列腺增生的分子机制与纠正增生时异常表达的生长因子有关。
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纳洛酮改变慢性吗啡处理大鼠血管反应性和培养的血管细胞内信号转导
目的：探讨吗啡戒断反应对血管反应性及其细胞内信号转导的影响.方法：大鼠注射递增剂量的吗啡两周后iv纳洛酮催瘾，记录乙酰胆碱(Ach)的降压效应.用含不同药物的Kreb's液灌流大鼠离体肠系膜血管床.AR-CM-MIC阳离子测定系统检测培养牛胸主动脉内皮细胞(aec)和血管平滑肌细胞(smc)胞浆内游离钙([Ca2+]i).计算smc呈磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(Phospho-CREB)免疫阳性反应的比例.结果：纳洛酮iv 2 mg/kg催瘾后钝化的Ach降压效应同催瘾前一致.以纳洛酮25μmol/L取代灌流液所含吗啡20μmol/L使成瘾大鼠肠系膜血管的去甲肾上腺素(NE)升压效应的EC50(μmol/L)从2.06±0.38降至1.14±0.21(n=8，P＜0.01)，而吗啡40 μmol/L完全预防NE的作用.即时加入吗啡后对照组血管平滑肌细胞内[Ca2+]j反应不一.纳洛酮使2/3的吗啡预处理组的血管平滑肌细胞内[Ca2+]i显著升高，呈Phospho-CREB免疫阳性反应的比例也因之增加.部分内皮细胞的[Ca2+]i明显下降.结论：纳洛酮增加慢性吗啡处理大鼠血管的反应性可能与血管平滑肌细胞内钙增加有关，并伴有cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化增强.
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莨菪亭对PC3细胞增殖和凋亡的影响
目的：研究莨菪亭对人前列腺癌细胞PC3增殖的作用和莨菪亭是否能引起PC3细胞的凋亡.方法：用细胞生长曲线，MTT试验和酸性磷酸酶(ACP)活性来测定细胞增殖，考马斯亮蓝法测细胞内蛋白质的含量，光镜、透射电镜和荧光显微镜观察莨菪亭引起的形态学变化.用荧光显微镜和流式细胞仪确定凋亡率和细胞的周期分布.结果：莨菪亭对PC3，PAA和Hela细胞的IC50分别为(157±25)，(154±51)和(294±100)mg/L，莨菪亭时间和浓度依赖性地抑制PC3细胞的增殖，并引起细胞内蛋白质含量减少和ACP活性降低.经莨菪亭处理后，在光镜、透射电镜和荧光显微镜下可观察到莨菪亭引起的典型的凋亡形态学变化，流式细胞仪测定显示经莨菪亭0，100，200和400 mg/L处理后PC3细胞的凋亡率分别为0.3％，2.1％，9.3％和35％，G2期细胞显著减少.结论：莨菪亭抑制PC3细胞增殖且可引起PC3细胞的凋亡.
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维拉帕米、噻庚啶和山莨菪碱拮抗TNFα诱导单个内皮细胞胞内游离Ca2+浓度的增高
目的：研究肿瘤坏死因子(TNFα)对单个内皮细胞胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响及维拉帕米(Ver)、噻庚啶(Cyp)和山莨菪碱(Ani)对TNFα诱导[Ca2+]i变化的影响，以探讨TNFα介导休克和Cyp、Ani的抗休克的机制. 方法：人脐静脉内皮细胞株(ECV304)接种于35 mm含有2 mL DMEM培养基的组织培养盘中培养.Fluo-3/AM负载细胞，激光扫描共聚焦显微技术测定单个内皮细胞[Ca2+]i.结果：TNFα使单个内皮细胞[Ca2+]i呈剂量依赖性升高，在60 s内达到峰值，然后下降并保持在基础水平之上.共聚焦扫描图像显示细胞核区[Ca2+]；升高比胞浆区明显，下降比胞浆区慢.维拉帕米1和2，噻庚啶30和60或山莨菪碱20和40 μmol/L均能显著抑制由TNFα 1.2 nmol/L诱导的单个内皮细胞[Ca2+]i升高. 结论：TNFα显著诱导内皮细胞[Ca2+]i升高，可能是TNFα介导休克的重要机制；维拉帕米、噻庚啶和山莨菪碱对TNFα诱导的[Ca2+]i升高有拮抗作用，可能是噻庚啶和山莨菪碱抗休克作用的机制之一.
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诺美孕酮醋酸盐对离体培养大鼠卵巢颗粒细胞分泌甾体激素的抑制作用
目的：观察诺美孕酮对离体培养大鼠颗粒细胞分泌雌、孕激素功能的抑制作用.方法：台盼蓝排斥法进行活细胞计数.加入FSH和睾酮刺激颗粒细胞激素分泌.放免法测定培养液中雌、孕激素含量.结果：诺美孕酮杀伤细胞的IC50为6.85mg/L(95％可信限：5.36-8.75 mg/L).诺美孕酮0.45，0.9，和1.8 mg/L在不影响活细胞数的情况下对颗粒细胞分泌雌激素的抑制率分别为7.6％，12.5％和28.3％，对其分泌孕激素的抑制率分别为44.5％，53.3％和62.0％.结论：诺美孕酮直接抑制离体培养的大鼠颗粒细胞分泌雌、孕激素.
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丹酚酸A对培养的大鼠肝星状细胞增殖与胶原生成的作用
目的：研究丹酚酸A对培养的大鼠肝星状细胞增殖与胶原生成的影响．方法：用链酶蛋白酶与胶原酶对肝脏进行原位灌流消化，Nycodenz密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞，传一代培养．MTT法与[3H]TdR掺人法测定细胞增殖．丽春红染色、图象分析法半定量细胞胶原沉积量，ELISA法测定细胞培养上清中I型胶原分泌量，检测细胞层总蛋白量校正细胞数．RT-PCR法分析前胶原α2(I)基因的表达．结果：丹酚酸A 100 μmol／L引起部分细胞脱壁与死亡，有一定毒性反应．丹酚酸A0．1一10 μmol／L对细胞形态无明显影响．丹酚酸A l一100 μmol／L浓度依赖性抑制细胞增殖，降低胶原沉积量与I型胶原分泌量．丹酚酸A 1-10 μmol／L对前胶原α2(I)mRNA表达均有明显抑制作用．结论：丹酚酸A抑制肝星状细胞增殖与胶原表达，是丹参抗肝纤维化的主要有效成分之一，抑制肝星状细胞活化是其抗肝纤维化的主要作用机制．
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p38和p42/p44 Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶信号在过氧化氢诱导牛主动脉内皮细胞凋亡中的作用
目的：研究p38和p42/p44 Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CCDPK)信号通路对过氧化氢(H2O2)诱导牛主动脉内皮细胞(BAEC)凋亡的调节作用.方法：H2O2处理BAEC 24 h后，荧光显微镜下观察形态学变化及凋亡细胞计数.MTT法测定细胞活性，琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解，蛋白质印迹法检测磷酸化p38和p42/p44 CCDPK表达.结果：H2O2诱导BAEC产生典型的凋亡细胞形态学变化(核浓染，核碎裂)和DNA断片.H2O2(100-500 μmol·L-1)浓度依赖性刺激磷酸化p42/p44和p38 CCDPK的表达.p42/p44 CCDPK抑制剂U0126显著增强H2O2致凋亡作用；然而p38CCDPK抑制剂SB203580可增强H2O2诱导的磷酸化p42/p44 CCDPK的表达，但不影响BAEC的存活.结论：p42/p44 CDPK对H2O2诱导的BAEC凋亡起保护作用，而p38 CCDPK不是介导H2O2所致细胞凋亡的主要信号通路.
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1-甲基-3-异丁基黄嘌呤延迟去除生长因子诱导的血管内皮细胞凋亡
目的：研究1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIBX)对去除生长因子(aFGF和血清)诱导的血管内皮细胞凋亡的影响.方法：通过细胞存活率的分析，荧光显微技术和DNA凝胶电泳等方法，检测MIBX对细胞凋亡的影响.结果：用25-200 μmol/L的MIBX处理培养在无aFGF和血清的培养液中的血管内皮细胞，50-200 μmol/L的MIBX在处理6 h明显抑制了凋亡小体的形成和DNA的片断化.但是同样浓度的MIBX处理细胞12 h以后，处理组和对照组之间无明显差别.结论：MIBX延迟去除aFGF和血清诱导的血管内皮细胞凋亡.
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卡托普利和依那普利对血管平滑肌细胞内钙的影响
检测ACE抑制剂对主动脉平滑肌细胞内Ca2+的影响.方法:用荧光标计和图象处理技术结果:SHR细胞内Ca2+以及KCl,NE和Ang在SHR细胞引起的Ca2+增加多于WKY细胞.Cap和Ena不影响KCl和Ang在WKY细胞的作用,但Cap,Ena和Nif抑制KCl,NE和Ang在SHR细胞的作用.结论:Cap和Ena阻断功能和特异性已改变的电压依赖性钙通道.
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人参三醇皂苷对培养心肌细胞的钙通道阻滞作用和抗自由基作用
鉴定人参皂苷Re,Rf,Rg1,Rg2,Rh1和R.的钙通道阻滞作用和抗自由基作用.方法:在Wistar大鼠心室肌细胞上,用斑片钳技术记录B、L、T三型单钙通道活动;用ESR法测定自由基含量.结果:Re,Rg1,Rg2,Rh1使B、L、T三型钙通道的开放时间缩短、关闭时间延长、开放率减小,Rf使L型钙通道的开放时间缩短、关闭时间延长、开放概率减小,R.不影响钙通道活动(60 μmol·L-1).Re,Rg1,Rg2,Rh1拮抗Xan0.42 mmol·L-1-XOD 5.3 nmol·L-1诱发的自由基含量增多,Rf和R.无此作用(30 μmol·L-1).结论:Re,Rg1,Rg2,Rh1兼有钙通道阻滞作用和抗自由基作用.Rf对L型钙通道有阻滞作用.
