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长期军事训练对氧化应激水平和DNA损伤的影响
目的 探讨长期军事训练对氧化应激水平和DNA损伤的影响.方法 训练组为15名武警战士,对照组为15名普通大学生.两组均进行一次大强度运动应激(5km跑).训练前后即刻采集静脉血,测定血浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血浆谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、血浆肌酸激酶(creatine kinase,CK)和血浆游离DNA(cell-free plasma DNA,cf-DNA).结果 组间比较,安静状态下,训练组各指标均高于对照组,一次大强度运动后,训练组MDA、CK 和cf-DNA 均低于对照组,而GSH-Px则高于对照组;组内比较,运动前后,对照组和训练组MDA、CK和cf-DNA均显著升高,但训练组上述指标变化幅度明显低于对照组,而GSH-Px无显著性变化.结论 长期军事训练可通过改善机体的氧化应激水平(降低氧化损伤、提高抗氧化能力)并降低细胞DNA损伤从而提高其对急性大强度运动的应激能力.
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5种血浆游离DNA提取方法的比较
目的 分别应用5种方法进行血浆游离DNA的提取,从而判定与筛选佳的血浆cfDNA提取方法.方法 采集19例健康人血浆标本,针对每一样本取350μl血浆分别应用经1次/2次酚-氯仿-异戊醇抽提法,经1次/2次酚-氯仿-异戊醇抽提配合微量DNA助沉剂法和介孔纳米磁珠法5种方法进行cfDNA提取,应用紫外分光法测定提取cfDNA的含量与纯度,应用实时荧光定量PCR方法以提取血浆cfDNA为模板进行扩增反应,以验证提取效果.结果 应用5种方法从19例350μ1血浆样本中提取的血浆cfDNA含量分别为(6971.43±1934.40) ng/ml、(2196.86±823.94) ng/ml、(12397.14±4197.37)ng/ml、(5568.29±1618.17) ng/ml和(7458.57±3706.83)ng/ml,A260/A280值分别为0.93±0.07、1.09±0.12、1.15 ±0.05、1.16±0.12和0.89±0.19,RT-qPCR扩增成功率为100％.结论 经1次酚-氯仿-异戊醇配合微量DNA助沉剂法提取量大,纯度高,所提取的血浆cfDNA可以为RT-qPCR提供模板,进行后续实验.
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血浆游离DNA在非小细胞肺癌诊断中的价值
目的 探讨血浆游离DNA水平在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的诊断价值.方法 选取陕西省人民医院健康中心120例健康对照者,并提取收治呼吸内科的116例非小细胞肺癌患者的,采用荧光定量PCR方法检测血浆游离DNA水平.结果 非小细胞肺癌组患者的血浆游离DNA水平为200.70±88.54 ng/ml,健康对照组的血浆游离DNA水平为18.65±6.30 ng/ml,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01);Ⅰ/Ⅱ期非小细胞肺癌患者的血浆游离DNA水平为172.75±72.87 ng/ml,Ⅲ/Ⅳ期非小细胞肺癌血浆游离DNA水平为221.88±93.86 ng/ml,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).血浆游离DNA水平与患者的年龄、性别、吸烟状况及组织学类型无明显相关性(P＞0.05).结论 血浆游离DNA是一种新发现的肿瘤标志物,可作为非小细胞肺癌早期诊断和临床分期的有效工具.
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乳腺癌患者外周血浆中游离的肿瘤相关DNA检测及其临床价值
目的 探讨外周血浆中游离DNA变异在乳腺癌早期诊断、疗效评估和复发监控中应用的可行性.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)方法,检测84例乳腺癌患者肿瘤组织、癌旁正常腺体组织及外周血浆中游离的肿瘤相关DNA钙黏素E(E-cadherin)和APC基因启动子甲基化畸变状况,选择10例乳腺良性疾病患者的血浆作为正常对照.结果 乳腺癌肿瘤组织E-cadherin和APC基因启动子甲基化畸变频率分别为52.4%和45.2%,相应外周血浆中相同的DNA变异阳性检出率分别为33.3%和31.0%.外周血浆中DNA甲基化变异与肿瘤组织的甲基化畸变状况显著相关(E-cadherin,P＜0.001;APC,P=0.002).血浆DNA E-cadherin和APC基因甲基化畸变检测的灵敏度分别为63.6%和63.2%,特异度分别为100%和95.7%.肿瘤组织及外周血浆中游离DNA甲基化畸变与临床分期、病理类型、肿块大小及受体状况无相关性(P＞0.05).癌旁正常腺体组织及健康对照血浆中均未检测到E-cadherin和APC基因甲基化变异.结论 在受检乳腺癌患者中,约1/3外周血浆中可检测到与原发肿瘤相同的E-cadherin和(或)APG基因甲基化畸变,与临床分期无相关性.在乳腺癌早期诊断、疗效评估和复发监控中,检测外周血浆中游离的肿瘤相关DNA变异有一定的可行性.
关键词： 乳腺肿瘤 血浆游离DNA E-cadherin基因 APC基因 甲基化 -
血浆游离DNA含量及其完整性检测对肝癌的诊断价值
目的 比较实时荧光定量PCR(RT-PCR)对肝细胞癌(HCC)、乙型病毒性肝炎(简称乙肝)患者及健康体检者血浆游离DNA含量及完整性的检测结果,探讨实时荧光定量PCR(RT-PCR)对HCC的诊断价值.方法 收集52例HCC患者、58例乙肝患者和60例健康体检者的静脉血标本,采用RT-PCR技术对各组血浆游离DNA中GAPDH、β-actin400、β-actin167含量及其完整性(β-actin400/β-actin167)进行定量检测,结果 采用SPSS软件进行统计学分析.结果 健康对照组的血浆游离DNAβ-actin167含量和完整性相比明显低于HCC组(Z=-4.328,P=0.000;Z=-3.885,P=0.001)和乙型肝炎病毒(HBV)组(Z=-2.473,P=0.005;Z=-3.295,P=0.013),且HBV组血浆游离DNA完整性明显低于HCC组(Z=-4.836,P=0.002).结论 RT-PCR检测血浆游离DNA完整性(β-actin400/β-actin 167)可作为HCC辅助诊断的分子生物学指标.
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雌性大鼠血浆游离DNA水平:过度训练的新监测指标?
目的:在证明过度训练的雄性大鼠血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)水平显著升高的前期研究基础上,研究血浆cfDNA水平能否成为雌性大鼠过度训练的新监测指标.方法:30只雌性SD大鼠随机分为3组:安静对照组、大强度训练组和过度训练组,每组10只.后两组大鼠进行9周的运动训练,每周训练6天.前6周的递增训练方案完全相同,后3周大强度训练组进行30 min的大强度训练,而过度训练组在此强度下运动至力竭.运动后36 h采集静脉血,real time PCR检测血浆cfDNA水平;ELISA检测血浆睾酮(T)、皮质酮(Coa)的水平、计算T/C比值.比色法等检测血浆肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性.结果:①过度训练组大鼠出现过度训练,表现为体重负增长,血浆T和T/C比值显著降低,血浆CK、Cort显著增加;而大强度训练大鼠体重停止增长、血浆Cort显著增加,T/C比值显著降低,血浆T和CK水平无显著变化.②大强度训练组和过度训练组大鼠血浆cfDNA水平均显著增加(均值分别是对照组的2.04倍和4.46倍左右);且过度训练组大鼠血浆cfDNA水平增加更显著(均值约为大强度训练组的2.19倍).③过度训练组大鼠血浆MDA显著升高,血浆SOD和GSH-Px活性无显著变化;而大强度训练组大鼠无显著变化.④皮尔森相关性分析表明,过度训练组血浆cfDNA水平与血浆Cort、T/C比值具有显著相关性,相关系数分别是0.834、-0.459;而与血浆T、CK水平和GSH-Px、SOD活性没有相关性.结论:①大强度和过度训练雌性大鼠血浆cfDNA水平均显著增加,且后者增加得更明显,提示血浆cfDNA水平增加得越显著越可能出现过度训练.②雌性大鼠血浆cfDNA水平与反映过度训练的多个指标如T/C比值、血浆Cort有相关性,提示雌性大鼠血浆cfDNA水平能成为过度训练的新的监测指标.③过度训练雌性大鼠血浆cfDNA水平的增加可能与氧化增强、骨骼肌损伤无关.
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检测大鼠血浆游离DNA的定量PCR方法的建立及意义
目的:过度训练是体育界非常重要的问题,目前用多个指标的综合评定来判断是否有过度训练,尚无灵敏、特异的监控指标和简便的评价方法.本文建立检测大鼠血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)的实时荧光定量PCR方法,并探讨血浆cfDNA水平能否成为反映大鼠过度训练的新监控指标.方法:12只雄性SD大鼠随机分为2组(n=6):安静组和过度训练组.过度训练组进行5周递增负荷的过度训练,每周运动6d,运动的后一天运动至力竭.力竭运动后36 h采集静脉血,检测大鼠血浆cfDNA、睾酮(T)和皮质酮(Cort)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和肌酸激酶(CK)的水平以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性.结果:①所建立的方法能特异扩增大鼠血浆cfDNA;②与对照组相比,过度训练大鼠的血浆cfDNA水平显著增加(约为安静组的5.43倍);③血浆cfDNA与血浆T、Cort、T/C比值和MDA显著相关(相关系数分别为-0.729,0.854,-0.655和0.720);与T-AOC、GSH-Px、SOD和CK无相关性.结论:①建立检测大鼠血浆cfDNA的定量PCR方法;②过度训练大鼠的血浆cfDNA显著增加,且cfDNA与血浆T、Cort和T/C比值高度相关,提示血浆cfDNA是过度训练的新监控指标;③过度训练大鼠血浆cfDNA的增加可能与过度训练所致的氧化应激增强有关,可能与骨骼肌损伤关系不大.
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宫内诊断的无创化与分子化
对特定孕妇开展宫内诊断可以有效降低新生儿的出生缺陷率.常规的非侵入性、侵入性宫内诊断方法如影像学检查,绒毛取样、羊膜腔穿刺、脐带血穿刺获取胎儿组织、细胞行染色体检查、FISH检测等手段存在各自的局限性.微芯片技术、孕妇外周血浆游离DNA检测技术、新一代高通量测序技术的迅速发展,可以在一定程度上与传统手段形成有效互补,使得宫内诊断的发展呈现出无创化与分子化的趋势.
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血浆游离DNA在临床应用中的新进展
血浆游离DNA(Plasma cell-free DNA,cf-DNA)是存在于人体血液中一种无细胞状态的胞外DNA.作为细胞死亡的标记物,近年来cf-DNA检测已用于多种急性或慢性疾病的诊断和预后评价中.虽然在健康人群的血浆中也可测量到一定量的cf-DNA,但据相关报道称在癌症,自身免疫性疾病,中风,败血症,先兆子痫和器官移植排斥中cf-DNA呈显著的高水平.本文对cf-DNA在临床工作中应用的新进展做出综述,观察其在肿瘤诊断,产前诊断,脓毒症及老年免疫衰老评估作用中的新进展,发现其相较其他生物标记物敏感性并无太大差别,但特异性更高,还可能与肿瘤的转移机制相关.对于老年个体衰老的机制尚未明确,炎症学说也尚未得到证实,如何评定衰老以及明确衰老的标记物已成为全世界研究的难点,而cf-DNA浓度可能代表了一种全身炎症反应和老年人死亡率新的生物标志物.这些研究都使得cf-DNA应用于临床工作中的前途更加光明.
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血浆游离DNA的临床应用新进展
血浆游离DNA(Plasma cell-free DNA,cf-DNA)游离于细胞外的机体内源性DNA,cf-DNA广泛存在于血液、脑脊液、滑膜液、支气管肺泡灌洗液和羊水等体液中.多数血浆DNA与蛋白质结合成为复合物,仅有少部分为游离的片段,受实验方法灵敏性和特异性的限制,cf-DNA的研究进展缓慢.随着分子检测技术的发展,虽然在健康人群的血浆中也可测量到一定量的cf-DNA,但是cf-DNA被发现在肿瘤、自身免疫性疾病、创伤和炎性反应等病理过程中有改变.目前cf-DNA在肿瘤的诊断和预后分析、产前诊断、感染性疾病等中均有应用价值.
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胃蛋白酶原联合血浆游离DNA在早期诊断胃癌中的临床价值
目的 探讨胃蛋白酶原(PG)联合血浆游离DN A(cf-DN A)在早期诊断胃癌中的临床价值.方法 回顾性分析西安市第一医院2015年2月至2017年2月收治的120例胃癌患者、98例胃溃疡患者、109例萎缩性胃炎患者、112例浅表性胃炎患者,另选择120名同期健康体检者作为正常对照组,比较各组间PGⅠ 、PGⅡ 、PGR(PGⅠ/PGⅡ)及cf-DNA的差异,应用受试者工作特征(ROC)曲线分析PGⅠ 、PGⅡ 、PGR、cf-DNA及联合检测早期诊断胃癌的价值.结果 胃癌组PGⅠ 、PGR明显低于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.05),胃溃疡组、萎缩性胃炎组PGⅠ 、PG R明显低于浅表性胃炎组、正常组,差异具有统计学意义(P<0.05).5组的PGⅡ水平差异无统计学意义(P>0.05).胃癌组cf-DNA水平明显高于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.05),胃溃疡组、浅表性胃炎组、萎缩性胃炎组、正常组cf-DNA水平的差异无统计学意义(P>0.05).胃癌转移组患者的PGⅠ 、PG R明显低于非转移组患者,差异具有统计学意义(P<0.05),转移组患者cf-DNA水平明显高于非转移组患者,差异具有统计学意义(P<0.05).PGⅠ 、PGR、cf-DNA联合检测的敏感度为0.85,特异度为0.79,明显高于单项检测.联合检测的ROC曲线下面积为0.88,明显大于单项检测.结论 PGⅠ 、PGR、cf-DNA联合检测早期诊断胃癌的敏感度和特异度较高,具有重要的临床价值.
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利用微滴数字PCR进行CpG岛甲基化表型结直肠癌分子分型
目的:利用微滴数字PCR(droplet digital PCR,DD-PCR)技术进行CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype,CIMP)结直肠癌分型,并探讨以血浆游离DNA进行CIMP分型的可行性.方法:收集2008到2012年在长海医院行结直肠癌手术的患者216例,抽提肿瘤组织DNA和血浆游离DNA,重亚硫酸盐处理后,利用DD-PCR进行CIMP分型.CIMP分型选用CA CNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1五个基因的甲基化位点,利用免疫组织化学技术(IHC)检测P53突变情况,以巢式PCR测序方法检测K-RAS和BRAF突变.结果:216例肿瘤中17例(7.9％)存在BRAF突变,96例(44.4％)存在K-RAS突变和112例(51.9％) P53-IHC(+).31.5％(68/216)的结直肠癌为CIMP(+)(5个基因位点中高甲基化位点数目≥3),82.3％ (14/17)的BRAF突变属于CIMP(+),而只有9.4％ (9/96)的K-RAS突变和7.1％ (8/112)的P53突变属于CIMP(+).除了K-RAS,BRAF和P53突变外,同CIMP(-)结直肠癌相比,CIMP(+)肿瘤还具有独特的临床病理特征:肿瘤更易发生在结直肠的近端位置,黏液性癌比例偏高,分化程度较高,CIMP(+)患者生存时间显著短于CIMP(-)患者.利用血浆游离DNA进行分型和利用肿瘤组织进行分型的一致性为93.4％、灵敏度为87.2％、特异性为100％.结论:CIMP(+)结直肠癌具有独特的临床病理特征,且预后较差;在缺乏肿瘤组织的情况下,利用DD-PCR对血浆游离DNA进行CIMP分型是可行的.
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利用多重数字PCR检测KRAS相关突变
目的 建立多重数字PCR体系检测血浆细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)中KRAS第2外显子12、13密码子的7种突变.方法 构建7种KRAS突变型质粒用以建立多重数字PCR检测体系,以灵敏度、特异度和动态范围为主要参数评估体系的性能.利用该体系检测15例手术可切除的胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者血浆cfDNA中KRAS第2外显子12、13密码子突变情况,并与ARMs的检测结果进行比对.结果 自建的多重数字PCR在0.01％～10％的动态范围内线性良好.两个检测体系的灵敏度分别可达到0.025％和0.043％.15名PDAC患者组织中KRAS突变的阳性率达到100％.数字PCR检测血浆cfDNA所得的结果与组织结果的匹配率达到40％,ARMs检测组织和血浆cfDNA结果的匹配率为20％.15例样本中使用多重数字PCR检测到血浆cfDNA的低丰度达到0.09％.结论 多重数字PCR具备高灵敏度和特异性,可用于准确定量外周血cfDNA中KRAS相关突变的水平.
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4种血浆游离DNA提取方法的比较
目的 比较4种方法对血浆游离结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA和质粒DNA的提取效率.方法 MTB DNA和重组质粒DNA经紫外分光光度法准确定量并梯度稀释,建立标准品.构建含有一定浓度MTB DNA和质粒DNA的血浆,分别采用4种方法提取血浆游离DNA,采用实时荧光PCR技术定量检测模拟血浆中MTB DNA和质粒DNA的含量,比较各种方法的提取效率.结果 4种方法中,磁珠法对MTB DNA和质粒DNA的提取效率高,分别为52.8%和69.2%;相对丢失率低,分别为40.1%和31.8%;重复性好,其变异系数分别为26.7%和26.0%.结论 在4种方法中,磁珠法对血浆游离DNA的提取效率高,尤其适合于小片段DNA的提取.
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非小细胞肺癌患者血浆游离DNA含量和完整性检测的临床意义
目的 评估血浆游离DNA含量和完整性(DNA integrity)在非小细胞肺癌(NSCLC)诊疗中的应用价值.方法 收集102例NSCLC患者、30例肺良性疾病患者及30例体检健康者的外周血标本,并对其中44例NSCLC手术患者进行随访.提取血浆游离DNA,用SYBR Green染料实时荧光定量PCR检测血浆游离DNA中长度分别为100 bp及241 bp的人端粒酶逆转录酶(hTERT)目的基因的含量,计算血浆游离DNA完整性,并分析其与临床病理参数的关系.结果 100 bp、241 bp血浆游离DNA含量及DNA完整性在NSCLC、肺良性疾病组及健康对照组中差异有统计学意义(H分别为21.947、52.825、27.110,P均＜0.01),NSCLC患者手术前后100 bp、241 bp血浆游离DNA含量和术前游离DNA完整性差异有统计学意义(H分别为3.259,5.149,2.609,P均＜0.01).血浆游离DNA完整性与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟状况、临床分期、病理类型、肿瘤细胞分化程度、有无转移及肿瘤大小均无明显相关性.结论 血浆游离DNA含量和完整性检测在NSCLC诊疗中有一定的临床价值,可成为NSCLC早期诊断及预后监测的指标.
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血浆游离DNA检测FLT3-ITD突变及ITD特征对急性髓细胞白血病诊断的意义
目的 探讨在血浆游离DNA中检测Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)基因内部串联重复序列(ITD)突变及ITD特征,为急性髓细胞白血病(AML)无创性诊断、个体化的分子靶向治疗提供新的策略.方法 提取88例初诊AML患者和40例对照者(体检健康者和血液系统良性疾病患者)的血浆游离DNA及骨髓细胞DNA并检测其浓度;PCR检测血浆及骨髓DNA中FLT3-ITD突变的表达水平;毛细管电泳法检测FLT3-ITD阳性患者血浆游离DNA和骨髓细胞DNA中的ITD数量,并进行统计学分析.结果 初诊AML患者组血浆ccfDNA浓度为203.85(115.8,1 165.7) μg/L,而体检健康者和血液系统良性疾病患者分别为4.60(3.21,5.79) μg/L和9.26(5.23,16.77) μg/L,三组间差异有统计学意义(K-Wx2 =84.64,P＜0.05);初诊AML患者组血浆ccfDNA浓度显著高于血液系统良性病变患者组及体检健康组(Z分别为-7.10和-6.96,P均＜0.05),而体检健康者与血液系统良性疾病患者间、FAB分型不同的初诊AML患者间的血浆游离DNA浓度差异无统计学意义(Z=-1.56,P ＞0.05;F =0.073,P＞0.05);FAB各型别中M2型FLT3-ITD突变率高为30.77％ (12/39),其次为M4型(20％,1/5),M5型(20％,2/10)和M3型(12％,3/25),其余型别未见突变;发生FLT3-ITD突变18例,与骨髓细胞DNA检测结果一致,13例患者在毛细管电泳中出现一条ITD条带峰,骨髓细胞结果与血浆结果一致;5例出现多条ITD条带峰,其骨髓细胞结果只有2例一致.结论 监测血浆游离DNA中FLT3-ITD突变及ITD数量,可能会成为AML个体化诊断的新分子标志物.
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血浆游离DNA高通量测序用于21-三体综合征无创产前检测
目的 初步探讨高通量测序技术检测孕母血浆游离DNA用于21-三-体综合征(T-21S)胎儿产前诊断的可行性.方法 收集10例T-21S胎儿的孕母血浆和100例健康胎儿孕母血浆(均经过羊水细胞C显带核型确认),分别作为T-21S组和健康对照组,用高通量测序技术对两组标本进行检测,数据经生物信息学统计分析,并将两组测序结果与羊水细胞染色体核型结果比较,评价高通量测序技术的检测效果.结果 10例T-21S组和99例健康对照组的测序结果与羊水细胞染色体核型结果符合率为100％,另1例健康孕妇血浆因胎儿DNA浓度较低未达到检测要求.结论 孕母血浆游离DNA高通量测序检测技术用于T-21S胎儿产前诊断具有无创伤、高通量、高准确率等优点,有重要的临床应用价值.
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42例大肠癌患者血浆TPEF异常甲基化及K-ras基因突变检测结果分析
目的:测定大肠癌患者外周血血浆游离DNA中含表皮生长因子和卵泡抑素结构域的跨膜蛋白(TPEF)基因启动子区异常甲基化率及K-ras基因12密码子突变率,评估联合检测此二个分子标记非损伤性筛选和诊断大肠癌的可行性.方法:提取大肠癌患者外周血血浆DNA,采用突变富集PCR-RFLP法检测K-ras基因突变,甲基化特异性PCR法检测TPEF基因甲基化异常.结果:42例大肠癌患者血浆标本中,27例检测到TPEF甲基化异常,16例检测到K-ras基因12密码子突变,联合二个分子标记,大肠癌患者诊断符合率为76.2%.结论:联合检测K-ras、TPEF基因异常将可能是一种非损伤性筛选和诊断大肠癌的有效方法.
