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金属硫蛋白对离体缺血再灌注未成熟心肌细胞功能的影响
背景:实验已证实金属硫蛋白对成熟心肌有保护作用,但对于未成熟心肌的保护作用尚缺乏实验证据.目的:探讨诱导金属硫蛋白在未成熟心肌中的表达及对缺血再灌注未成熟心肌细胞功能的影响,为未成熟心肌的保护提供有效的方法.设计:完全随机分组设计,对照实验.单位:青岛大学医学院附属青岛市立医院妇产科和心脏外科,华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科.材料:实验于2001-10/2002-09在华中科技大学同济医学院药理实验室(安全级别一级)完成.选用出生14～21 d日本长耳大白兔27只,雌雄不拘.随机将兔分为4组:对照组9只,腹腔注射ZnSO4 12,24,48 h组各6只.方法:①对照组:腹腔注射蒸馏水0.3 mL,按注射后12,24和48 h取离体心脏,灌注重碳酸氢盐缓冲液15 min转为工作心15 min,全心停灌45 min,恢复灌注15 min改为工作心30 min.腹腔注射Zn-SO412,24,48 h组:分别按腹腔注射36 g/L ZnSO4 12,24和48 h后取离体心脏,余方法同对照组.②计算心肌肌酸激酶和乳酸脱氧酶15 min漏出率=心肌肌酸激酶(乳酸脱氢酶)(IU/L)×15 min漏出液(L)/[1000×心肌湿重(g)].③采用荧光素酶法心肌组织三磷酸腺苷含量.④心肌线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶活性按Jones方法在Shi-madzu UV-1200型紫外分光光度计上测定.⑤在电感耦合等离子体原子发射光谱仪上测定线粒体Ca2+含量.⑥取制备的心肌线粒体悬液按Nayler法测定线粒体合成三磷酸腺苷能力.⑦采用109Cd-血红素饱和法测定心肌组织中金属硫蛋白含量.组间计量资料差异比较采用t检验.主要观察指标:各组兔心肌细胞中金属硫蛋白含量、肌酸激酶和乳酸脱氢酶漏出率、三磷酸腺苷含量、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶活性及线粒体Ca2+含量、心肌线粒体合成三磷酸腺苷能力比较.结果:日本长耳大白兔27只均进入结果分析.①乳酸脱氧酶漏出率、肌酸激酶漏出率、心肌Ca2+含量、线粒体Ca2+含量:腹腔注射ZnSO424,48h组明显低于对照组和腹腔注射ZnSO412 h组(P＜0.01);.②心肌三磷酸腺苷含量、心肌线粒体Ca2+-三磷酸腺苷酶活性、心肌线粒体合成三磷酸腺苷能力、心肌金属硫蛋白含量:腹腔注射ZnSO4 24,48 h组明显高对照组和腹腔注射ZnSO4 12 h组(P＜0.05～0.01).结论:腹腔注射ZnSO4可诱导心肌金属硫蛋白长时间表达,金属硫蛋白可减轻未成熟心肌细胞缺血再灌注损伤.
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彩色多普勒超声对中孕期胎鼠心肌细胞凋亡的影响及其远期效应
目的:探讨彩色多普勒超声照射对中孕期胎鼠心肌细胞凋亡的影响及其远期效应,从而为彩色多普勒超声临床安全应用提供实验依据.方法:将24只孕14 d SD大鼠按取材时间不同随机等分为胚胎组和幼仔组,再各自等分为照射30min组和对照组.胚胎组于照射后24 h剖宫取胎鼠心肌标本,幼仔组于出生后10 d取材.HE染色光镜观察组织细胞结构,TUNEL法检测凋亡细胞,激光共聚焦显微图像分析仪检测荧光强度,透射电镜观察超微结构的变化.结果:各组光镜下观察未见心肌组织细胞结构异常;TUNEL法检测结果,胚胎对照组心肌组织内可见散在凋亡细胞,幼仔各组心肌组织内凋亡细胞则更稀少;胚胎照射30 min组凋亡细胞较易观察到,部分区域可见较密集的凋亡细胞.胚胎照射30 min组[(0.48±0.42)IU]与胚胎对照组荧光强度[(4.08±0.54)IU]比较,差异有显著性意义(t=2.45,P＜0.05);幼仔照射30min组和幼仔对照组荧光强度差异无显著性意义(P＞0.05).胚胎照射30 min组心肌电镜检查发现染色质浓缩边集、线粒体、内质网肿胀等超微结构变化.结论:彩色多普勒超声照射30 min以上可引起中孕胎鼠心肌细胞凋亡,但这种影响在幼仔期消失.
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螺内脂抑制醛固酮诱导大鼠心肌细胞中钙调神经磷酸酶的表达
目的:在引起心肌细胞肥大的刺激因素醛固酮作用下,应用醛固酮受体拮抗剂螺内脂进行共同培养,观察培养的原代大鼠心肌细胞钙调神经磷酸酶蛋白及mRNA表达水平.方法:实验于2004-07/12在基础医学研究所组织工程研究中心实验室进行.取出生1～3 d的Wistar乳鼠,进行心肌细胞培养.将培养的乳鼠心肌细胞分为4组:①空白对照组:不干预.②醛固酮组:予以醛固酮至浓度为1 nmol/L.③环孢素A组:予以醛固酮至1 nmol/L,同时给予环孢酶素A至5 mmol/L.④螺内脂组:予以醛固酮至1 nmol/L,同时给予螺内脂至3 μmol/L.通过免疫组织化学染色观察钙调神经磷酸酶Aβ蛋白表达,反转录-聚合酶链反应方法检测钙调神经磷酸酶蛋白AβmRNA的表达.结果:①钙调神经磷酸酶Aβ蛋白表达:免疫组织化学染色结果发现醛固酮组心肌细胞胞浆中阳性颗粒(棕色)多,表达增高,用环孢素A及螺内酯干预的大鼠心肌胞浆中阳性颗粒显著少于醛固酮组,与空白对照组接近.②钙调神经磷酸酶AβmRNA表达:醛固酮组心肌细胞表达显著高于空白对照组(P＜0.05),环孢素A及螺内酯组显著低于醛固酮组,与空白对照组无明显差异.结论:在醛固酮诱导下钙调神经磷酸酶蛋白及mRNA表达水平均升高,螺内酯通过拮抗醛固酮与受体结合可减少钙调神经磷酸酶蛋白及mRNA表达,其效果与钙调神经磷酸酶特异性抑制剂环孢素A相似.
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肿瘤坏死因子α对心肌细胞线粒体和膜电位、胞内钙离子浓度的影响
目的:通过研究肿瘤坏死因子对培养的衰老心肌细胞的线粒体膜电位、胞内钙离子浓度[Ca2+]i的变化,探讨其在心肌细胞损伤中的作用机制.方法:实验于2001-09/2002-09在解放军总医院老年心血管病研究所分子生物学实验室及军事医学科学院电镜中心进行.常规培养心肌细胞.用噻唑兰检测不同浓度肿瘤坏死因子α(1000,3 000,5 000U/L)对心肌细胞活力的影响.以3 000U/L肿瘤坏死因子α刺激心肌细胞,Rhodamine123和Fluo-3/AM负载后通过共聚焦激光扫描显微镜测量线粒体膜电位和细胞内钙浓度([Ca2+]i)的变化.结果:①噻唑兰法显示3种浓度的肿瘤坏死因子α作用24 h后,A值百分率高,48 h后A值百分率下降.②3 000U/L肿瘤坏死因子α刺激心肌细胞后,共聚焦扫描图像显示心肌细胞[Ca2+]i升高,作用0,2,12 h平均荧光强度分别为29.64±16.33,9645±29.42,104.52±22.17,有显著性差异(P＜0.05).③3000 U/L肿瘤坏死因子α刺激后,激光共聚焦显微镜显示线粒体膜电位在75 s内可见荧光强度先稍有降低后升高,未用肿瘤坏死因子α处理组及肿瘤坏死因子α处理后5,10,15,20 min、2及12 h的MMP荧光强度分别为134±57,115±43,114±40,112±38,97±28,77±55,34±16,12 h后线粒体膜势能下降一半,统计学分析无显著意义.结论:肿瘤坏死因子α能增加[Ca2+]i、降低线粒体膜电位,可能是肿瘤坏死因子α介导心肌细胞损伤的重要机制之一.
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5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验
目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点.方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成.取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓.利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增.用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定.应用10 μmol/L 5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24 h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达.结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45.②以5-氮胞苷诱导培养24 h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构.③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加.结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间.
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RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡
目的:利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶,观察细胞增殖和凋亡的变化.方法:实验于2004-12/2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.实验选用10～12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只,以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组,选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组,共4组,各6只.消化法培养大鼠心脏成纤维细胞,设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体,western blot法测量黏附斑激酶的沉默效率,四唑盐比色法检测细胞增殖,DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡,流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化.结果:Wistar大鼠24只,全部进入结果分析.①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功,转染细胞后,Westernblot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率高,为72.1%,其余分别为66.2%和55.3%.②Pavu6+27-黏附斑激酶2转染组A490值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组(0.179±0.017,0.30±0.002,0.296±0.006,0.281±0.007;t=17.802,16.436,14.993,P＜0.01);凋亡率较其余各组则明显升高[(22.28±2.13)%,(4.72±1.67)%,(6.36±0.92)%,(8.19±1.33)%;t=-19.05,-17.31,-15.16,P＜0.01].③Pavu6+27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显,与正常对照组和空质粒转染组比较,差异十分显著(2.15±058,1.01±0.04,1.12±0.04;t=-4.79,-4.318,P＜0.01);与阴性对照组比较,差异显著(1.19±0.31,t=-3.59,P＜0.05).④Pavu6+27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升(1.62±0.15,1.04±0.03,1.09±0.01,1.23±0.04;t=-9.39,-8.701,-6.338,P＜0.05).结论:通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达,可诱导心脏成纤维细胞凋亡,抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段.
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厄贝沙坦对大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响
目的:观察自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)心肌细胞凋亡和Bax/Bcl-2蛋白的表达;同时观察血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensinⅡ1 type receptor,AT1R)拮抗剂-厄贝沙坦对SHR大鼠心肌细胞凋亡和BcL-2/Bax蛋白表达的影响.方法:24只16周龄SHR大鼠(上海市高血压研究所提供,医动字02-37-1号)分为SHR治疗组[沙坦30 mg/(kg·d),20周]和SHR对照组,另选16周龄Wistar大鼠12只作为正常对照组.分别采用SP免疫组化法和末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法方法检测心肌细胞凋亡指数和BcL-2/Bax蛋白水平的表达,放射免疫法检测血浆和组织血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ).结果:SHR治疗组与正常对照组比较:收缩压明显增高[(243±13)和(151±11)mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa],左心室质量与体质量比(leftventricular mass/body mass,LVW/BW)明显增加[(4.05±0.33)和(2.90±0.23)g/kg];血浆和心肌组织AngⅡ增高[血浆:(31.8±5.4)和(22.2±18.5)ng;心肌:(13.2±2.1)%和(8.3±1.2)%];心肌细胞凋亡指数明显增加[(4.75±0.70)%和(2.84±0.60)%];心肌细胞Bax蛋白的表达明显增强[(5.02±0.34)%和(2.85±0.29)%],Bcl-2/Bax比率明显降低(0.65 ±0.13和1.05±0.18),差异有显著性意义(P＜0.05～0.01);而Bcl-2蛋白的表达[(3.29±0.24)%和(2.95±0.29)%]差异无显著性意义.SHR治疗组与SHR对照组比较:收缩压明显回落,LVWI明显下降,心肌细胞凋亡指数明显减少,心肌细胞Bax蛋白的表达减弱,Bcl-2/Bax比率、血浆和心肌组织AngⅡ则高于SHR对照组[SHR对照组上述指标分别为(179±11)mm Hg,(3.22±0.38)g/kg,2.73±0.60)%,(3.17±0.27)%,0.65±0.13,(31.8±5.4)ng/L,(13.2±2.1)ng/L],差异均有显著性意义(P＜0.05～0.01).SHR治疗组与正常对照组比较:心肌细胞凋亡指数、Bax,Bcl-2蛋白表达均无明显差别,血浆、心肌组织AngⅡ则明显高于正常对照组,差异均有显著性意义(P＜0.05～0.01).结论:成年SHR大鼠的左室心肌细胞凋亡活跃与Bax蛋白表达增强,致Bcl-2/Bax比率减低有关.其次还提示较长时间给予ATlR厄贝沙坦能有效抑制Bax的过度表达,增加Bcl-2/Bax比率,从而让心肌细胞凋亡恢复正常.AT1R-厄贝沙坦使心肌细胞凋亡恢复正常的作用可能与心肌局部肾素血管紧张素系统有关.
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外环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响
目的:研究外环境对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响.方法:取SD大鼠骨髓,通过贴壁法进行MSCs培养,经过多次传代后获得较纯的MSCs.用5-氮胞苷进行诱导分化,显微镜下观察其形态变化,通过RT-PCR鉴定心肌特异基因心房利尿肽和脑钠肽表达.实验分Ⅰ组为在玻片上的5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;Ⅱ组为5-氮胞苷干预的MSCs;Ⅲ组为玻片上未用5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;Ⅳ组为未用5-氮胞苷干预的MSCs.显微镜下观察4组形态变化,并通过免疫组化鉴别结蛋白和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinI,cTnI)表达及其出现时间的早晚.结果:RT-PCR显示诱导6周后有心房利钠肽,脑钠肽的表达.Ⅱ组MSCs诱导后10 d可见细胞由原来扁平多角形变成长梭状,15 d后部分细胞胞体明显增粗,可见到有些细胞间有融合样情况发生,20 d左右类似肌管样细胞出现;而Ⅰ组在17d左右可以看到类似肌管样细胞;Ⅲ,Ⅳ组未见上述形态改变.免疫组化表明Ⅲ,Ⅳ组未见阳性细胞出现;Ⅰ,Ⅱ组可见阳性结果,且Ⅰ组阳性结果出现的比Ⅱ组更早.结论:MSCs在体外的化学诱导物条件下可以诱导分化成心肌样细胞,心肌细胞培养环境对其定向分化成心肌样细胞有促进作用.
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钙三醇和甲状旁腺素对鼠心肌细胞凋亡的影响及机制
目的:研究甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)对心肌细胞内游离钙和细胞凋亡的影响,以及钙三醇的修复作用.方法:利用培养的新生SD大鼠(n=25)心肌细胞,以Fluo-3/AM负载,通过激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙浓度([Ca2+]i);采用透射电镜和流式细胞仪观察细胞凋亡的变化.结果:PTH1-34 0.01μmol/L和0.1 μmol/L刺激7 d后,心肌细胞内钙荧光强度分别为186.0±43.6,217.9±22.2,、细胞凋亡率分别为(6.97±1.00)%和(12.58±1.75)%较对照组[(77.7±19.9)%,(0.12±0.11)%]显著增加,差异有显著性意义(F=158.52,54.19,P＜0.01).若以PTH1-34 0.1 μmol/L刺激,并同时加入0.001 μmol/L的钙三醇干预上述指标明显降低[分别为(114.3±29.9)%,(3.43±0.40)%],差异有显著性意义(F=158.52,54.19,P＜0.01);但同时应用0.1 μmol/L钙三醇干预,则无显著改善.结论:PTH1-34可以浓度依赖性增加心肌细胞内[Ca2+]i,诱导细胞肥大和凋亡;适宜浓度的钙三醇干预,具有修复作用.
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兔心肌梗死后2个月肥大心室肌细胞的电生理研究
背景:心肌梗死后电重构与梗死后时间和区域相关.目的:研究陈旧性心肌梗死非梗死区肥大心室肌细胞离子通道电流的变化,探讨心肌梗死后肥大心肌发生心律失常的可能的离子机制.设计:随机对照实验研究.地点、材料和干预:所有实验过程在石家庄市白求恩国际和平医院心内科中心实验室完成.新西兰纯种大耳白兔20只,按随机抽签法分为两组:心肌梗死动物模型组和正常对照组.采用结扎兔冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌梗死动物模型,应用膜片钳全细胞记录方法.主要观察指标:梗死后2个月心外膜远离梗死区组与梗死区组及正常对照组心室肌细胞L-钙通道电流(L-calcium current,ICa-L)、瞬间外向钾电流(transient outward current,Ito)的变化.结果:①远离梗死区组细胞电容[(155.7±5.8)pF,n=41]明显大于对照组[(120.3±6.2)pF,n=35]和梗死区组[(130.4±7.8)pF,n=38](t=2.642,2.613,P均＜0.01).②ICa-L:远离梗死区组ICa-L电流峰值(0 mV)为[(826.12±121.31)pA,n=21],较对照组[(670.21±183.32)pA,n=10]和梗死区组[(629.43±172.12)pA,n=11]明显增大(t=2.451,2.732,P均＜0.05).但远离梗死区组电流密度峰值为(5.32±0.78)pA/pF,较对照组[(5.58±1.53)pA/pF]略下降,与梗死区组[(4.84±1.48)pA/pF]和对照组比较无显著性意义(P均＞0.05).③Ito:远离梗死区组[(13.21±4.13)pA/pF,n=23]和梗死区组[(10.61±4.12)pA/pF,n=18]的Ito电流密度(+60mV时)均明显低于对照组[(17.39±5.24)pA/pF,n=16](t=3.591,2.725,P均＜0.01).但远离梗死区组明显高于梗死区组(t=2.429,P＜0.05).结论:心肌梗死后2个月,远离梗死区心室肌细胞电容明显增大,反映心肌细胞发生代偿性肥大.远离梗死区心室肌细胞ICa-L幅值升高,但Ito电流密度明显下降,ICa-L电流密度轻度下降,可导致动作电位平台期延长,复极异常,异常自律性的增加,并且心室不同部位存在电生理异质性,可能是导致陈旧性心肌梗死出现室性心律失常的离子基础.
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缺血再灌注后心肌细胞凋亡及相关基因变化与不同剂量黄芩茎叶总黄酮的预处理效应
目的:黄芩茎叶总黄酮具有保护缺血再灌注心肌的作用,从细胞凋亡及相关基因的角度,观察黄岑茎叶总黄酮预处理对缺血再灌注大鼠心肌细胞的影响.方法:实验于2006-02/2006-12在承德医学院解剖学研究室(院级实验室)完成.①实验分组及方法:选择雄性Wistar大鼠40只,按随机数字表法分为5组(n=8),即黄岑茎叶总黄酮0.05g/(kg·d),0.1 g/(kg·d),0.2 g/(kg·d)组、缺血再灌注组和假手术组,分别于术前1周灌服黄岑茎叶总黄酮和等量生理盐水.假手术对照组只穿线不结扎,其余各组结扎大鼠左冠状动脉前降支40 min,再灌注1 h.②实验评估:实验结束后快速取大鼠心脏,石蜡切片,采用DNA末端标记技术观察心肌细胞凋亡指数;应用免疫组化抗生物素-生物素-过氧化物酶法检测Bcl-2,Bax基因蛋白反应强度.结果:40只大鼠全部进入结果分析.①与假手术组相比,缺血再灌注组、各黄岑茎叶总黄酮剂量组大鼠心肌细胞凋亡指数、Bcl-2和Bax表达均显著增高(P＜0.01).②与缺血再灌注组相比,各黄岑茎叶总黄酮剂量组凋亡指数和Bax基因表达降低(P＜0.05～0.01),黄岑茎叶总黄酮0.1,0.2 g/(kg·d)组Bcl-2表达增高(P＜0.05).③黄岑茎叶总黄酮0.1,0.2 g/(kg·d)组凋亡指数和Bax基因表达低于黄岑茎叶总黄酮0.05 g/(kg·d)组(P＜0.05),Bcl-2表达高于黄岑茎叶总黄酮0.05 g/(kg·d)组(P＜0.05),黄岑茎叶总黄酮0.1,0.2 g/(kg·d)组差异无显著性意义(P＞0.05).结论:黄岑茎叶总黄酮预处理可能通过抑制心肌细胞凋亡,下调Bax基因蛋白表达,上调Bcl-2基因蛋白表达来保护缺血再灌注心肌细胞,不同剂量的黄岑茎叶总黄酮阻抑心肌细胞凋亡具有一定的剂量依赖效应.
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体外诱导骨髓间质干细胞分化为心肌样细胞及其低免疫源性实验
目的:通过体外诱导骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化,验证其多能分化特性,检测分化后的细胞进行免疫源性.方法:①实验于2003-03/2004-09在华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科实验室完成.实验选用1月龄Wistar大鼠20只.②贴壁法体外培养骨髓间质干细胞,用化学物质5-氮杂胞苷诱导24 h,免疫组化检测诱导后的细胞心肌特异性蛋白的表达,单向混合淋巴细胞反应检测诱导分化后的骨髓间质干细胞的免疫源性.③实验分组如下,对照组1:单独的反应细胞组;对照组2:刺激细胞+反应细胞.实验组1:不同数量诱导分化后的骨髓间质干细胞1×107,1×108,1×109 L-1+反应细胞;实验组2:不同数量诱导分化后的骨髓间质干细胞1×107,1×108,1×109L-1+刺激细胞+反应细胞.以抑制率表示诱导分化后的骨髓间质干细胞的免疫调控活性.④多均数比较采用方差分析,进行方差齐检验后,均数间两两比较采用LSD法.两样本均数比较采用t检验.结果:20只大鼠均进入结果分析.①部分诱导后的细胞胞浆结蛋白,心肌特异性肌钙蛋白,连接蛋白-43免疫组化呈阳性反应.②实验组1(加入的骨髓间质干细胞为1×107,1×108,1×109L-1时)同种异体淋巴细胞的每分钟脉冲值明显低于对照组1(4 610.106±276.16,3 704.55±159.50,2 881.317±114.62,8 232.333±351.71,P＜0.05),各剂量骨髓间质干细胞组间差异明显(P＜0.05).③实验组2(加入的骨髓间质干细胞为1×107,1×108,1×109L-1时)对混合淋巴细胞反应的抑制率明显高于对照组1(43.9%,55.1%,65.7%,1.65%,P＜0.05),各剂量骨髓间质干细胞组间差异明显(P＜0.05).结论:骨髓间质干细胞具有向心肌样细胞分化的潜能,分化后的骨髓间质干细胞能呈剂量依赖性地抑制同种异体淋巴细胞增殖,可以抑制正在进行的混合淋巴细胞反应,具有低免疫源性,可用于同种异体移植.
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兔骨髓基质细胞的生物学特性及植入心肌后的存活状况
目的:观察兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,MSCs)的部分生物学特性及植人心肌后的存活状况.方法:密度梯度离心与贴壁粘附得到高纯度的兔下肢骨MSCs,建立体外培养体系,光镜、电镜、细胞周期等观察其生物学特性,4',6-二脒基-2-苯吲哚(4',6-dianidino-2-phenylindone,DAPI)标记培养的MSCs,植入心肌后检测植入细胞在6周内不同时相点的存活状况.结果:体外培养的MSCs显示良好的贴壁扩增生长能力,88%的培养细胞为静止期细胞,96.4%细胞为活细胞,电镜证明培养细胞显示幼稚细胞的结构.标记的MSCs植人心肌后至少生存6周并且植入细胞扩散融合于植入区宿主心肌中.结论:体外培养的MSCs显示幼稚细胞形态,标记的培养MSCs植入心肌后可以长期存活并扩散融合于宿主心肌.
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溶血磷脂酸对豚鼠心室肌细胞单通道电流的影响
目的 观察溶血磷脂酸 (LPA)对豚鼠心室肌细胞单通道延迟整流钾电流的影响,探讨LPA 在室性心律失常中的作用.方法 Langendorff离体心脏逆向灌流法分离豚鼠心室肌细胞,随机选取心室肌细胞分为对照组、LPA (10 μmol·L-1)组及LPA (10 μmol·L-1)+PTX(1 μmol·L-1 )组.应用细胞贴附式方式记录心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik),分析LPA对Ik通道动力学的影响.结果 LPA组心室肌细胞通道开放时间,开放概率明显低于对照组(P＜0.05),关闭时间明显高于对照组(P＜0.05);LPA (10 μmol·L-1)+ PTX(1μmol·L-1)组通道开放时间,开放概率以及关闭时间与对照组相比,无显著差异(P>0.05).结论 LPA通过缩短开放时间、延长关闭时间、降低开放概率抑制心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)外流,G-蛋白耦联通路可能参与了LPA对Ik通道动力学作用的调控.
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人参皂苷单体Rb1对缺血心室肌细胞动作电位及L-型钙离子通道的影响
目的:观察人参皂苷单体Rb1对豚鼠缺血心室肌细胞动作电位(AP)和L-型钙离子通道的影响.方法:Langendorff离体心脏逆向灌流法分离豚鼠心室肌细胞,随机选取心室肌细胞分为正常对照组、缺血组及Rb1100、200和400 μmol·L-13个剂量组.应用全细胞电流钳模式记录心室肌细胞动作电位,应用电压钳模式记录L-型钙离子通道电流(Ica-L).结果:Rb1100、200和400μmol·L-1组缺血心室肌细胞动作电位复极50%(APD50)和动作电位复极90%(APD90)明显低于给药前(P＜0.05或P＜0.001),缺血后的心室肌细胞L-型钙离子通道峰值电流明显低于给药前(P＜0.05或P＜0.01).Rb1抑制缺血心室肌细胞钙离子通道的开放,随浓度增加钙电流显著降低,具有浓度依赖性.结论:Rb1缩短缺血心肌细胞AP时程和抑制钙通道的作用,可能是其抗心肌缺血的机制之一.
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1-磷酸鞘氨醇对豚鼠心室肌细胞单通道延迟整流钾电流的影响
目的:观察1-磷酸鞘氨醇(S1P)对豚鼠心室肌细胞单通道延迟整流钾电流的影响,探讨S1P在室性心律失常中的作用.方法:Langendorff离体心脏逆向灌流法分离豚鼠心室肌细胞,随机选取心室肌细胞分为正常对照组,S1P(2.2 μmol·L-1)组及S1P(2.2μmol·L-1)+Suramin(200 μmol·L-1)组.应用细胞贴附式记录方式记录心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik).结果:细胞贴附式记录及通道动力学分析,S1P组心室肌细胞通道开放时间及开放概率明显低于正常对照组(P＜0.05),关闭时间明显高于正常对照组(P＜0.05);S1P+Suramin组通道开放时间、开放概率以及关闭时间与正常对照组比较差异无显著性(P＞0.05).结论:S1P抑制心室肌细胞延迟整流钾电流外流,该作用通过缩短开放时间、延长关闭时间、降低开放概率实现,且通过膜受体介导.
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黄芪甲苷对新生乳鼠心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用
目的:探讨黄芪甲苷(ASⅣ)对培养的心肌细胞氧化损伤的保护作用及其机制.方法:体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞分为对照组、0.1%二甲基亚枫(DMSO)溶剂组、H2O2损伤组(0.2 mmol·L-1)、阳性药黄芪注射液组及ASⅣ小、中、大(3、10及30 mg·L-1)剂量组.药物预先处理心肌细胞30 min后,加入H2O2损伤心肌细胞24 h,观察ASⅣ对心肌细胞形态学的影响,MTT法测定心肌细胞存活力以及测量乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量的变化.结果:H2O2损伤组心肌细胞部分皱缩,细胞核暗淡,伪足消失;ASⅣ各剂量组心肌细胞损伤程度减轻,心肌细胞核折光性较H2O2损伤组好,伪足略变细;ASⅣ各剂量组细胞存活力均高于H2O2损伤组(P＜0.05或P＜0.01);ASⅣ10及30 mg·L-1剂量组LDH、MDA含量低于H2O2损伤组(P＜0.05或P＜0.01),SOD、NO含量高于H2O2损伤组(P＜0.05或P＜0.01).结论:ASⅣ可对抗H2O2对心肌细胞的损伤,其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力、诱导NO生成有关.
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心脏钾离子通道相互作用的研究进展
心脏存在多种多样的钾离子通道,它们显示不同的分子结构、生物物理特征、功能作用和药理学意义.钾离子通道的不同亚单位相互作用形成独特电生理学效应的通道复合物.本文从电生理学和分子生物学等方面对钾离子通道的研究进展作一综述.
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缺血-再灌注对心肌细胞钠快通道电流的影响
目的:探讨在心肌缺血-再灌注后钠快通道电流的变化及其在室性心律失常发生中的作用.方法:以常规方法制备大鼠心肌缺血-再灌注模型,以酶解法分离单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳记录技术观察缺血10和30min后再灌注组(10min和30min组)的心室肌细胞钠快通道电流(INa)的变化,以正常心肌INa为对照,同时设假手术对照组.结果:缺血10 min再灌注组INa受到抑制,电流密度-电压关系曲线上移,而缺血30 min再灌注组增大,电流密度-电压关系曲线下移,峰值钠电流密度对照组为(-13.55±4.32)pA/pF(n=10个细胞),缺血10min和30min再灌注组分别为(-6.51±2.45)pA/pF(n=10个细胞)和(-41.27±9.68)pA/pF(n=10个细胞),与对照组相比,差异均有极显著性意义(P＜0.001);缺血10min再灌注失活曲线左移,而缺血30min再灌注组又右移,半数大失活电位对照组为(-105±12)mV(n=10个细胞),缺血10min和30 min再灌注组分别为(-112±16)mV(n=10个细胞)和(-101±12)mV(n=10个细细胞),与对照组比较,缺血10 min再灌注组显著减小(P＜0.001),而缺血30min再灌注组变化不明显(P＞0.05).结论:缺血10min再灌注组心室肌细胞钠快通道受抑制,而缺血30min再灌注组心室肌细胞钠快通道反而激活,可能为缺血-再灌注性心律失常发生的机制之一.
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小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达
目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.
