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bcl-xL纳米微粒的制备及其对大鼠心肌细胞的高效转染
目的:制备包载含人类抗凋亡基因bcl-xL的纳米微粒,评价其转染大鼠心肌细胞的能力. 方法:用超声双乳化蒸发法制备包载bcl-xL的纳米微粒,扫描电镜观察纳米的形态和大小,DNase I消化酶试验检测其抗核酸酶能力;转染体外培养的大鼠心肌细胞后RT-PCR和Western-blot法检测基因表达. 结果:制备的纳米微粒直径约200～260 nm,包封完好,性能稳定并对基因有缓释作用;转染1 wk后bcl-xL表达高于对照组(P<0.05). 结论:成功制备包载真核表达质粒的纳米微粒,并能够高效转染大鼠心肌细胞. 纳米微粒是心肌细胞转染较理想的基因载体之一.
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P19细胞体外DMSO诱导向心肌样细胞分化
目的:体外诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化. 方法:P19细胞经复苏、传代,在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化,分化细胞经HE染色及心肌标志物转录因子(GATA-4), 连接蛋白43(connecxin43), α-肌节型肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色后,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化,透射电镜下观察细胞超微结构变化. 结果:经DMSO诱导分化后4 d有细胞聚集体形成,6 d有部分细胞GATA-4和connecxin43呈阳性表达,GATA-4阳性表达位于细胞核和细胞质,connecxin43阳性表达呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面. 10 d时GATA-4和connecxin43阳性表达明显增加,并有部分细胞呈α-sarcomeric actin阳性,阳性表达位于细胞质. 电镜观察,未分化细胞为圆形或椭圆形,细胞间连接松散,细胞质较少,细胞器不发达;诱导后6 d,细胞间出现紧密连接和中间连接,细胞质增多,部分细胞表面出现突起,突起内可见微丝. 诱导后10 d,线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基体丰富,并有中心粒形成. 结论:P19细胞在DMSO诱导下已有向心肌分化趋向,有类似胚胎心肌细胞形成.
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不同强度+Gz暴露对大鼠心肌细胞凋亡的影响
目的: 探讨不同强度的持续性正加速度(+Gz)对大鼠心肌细胞凋亡的影响. 方法: 12只SD大鼠随机分为对照组、+6Gz暴露组、+10 Gz暴露组,每组4只,+Gz暴露组分别给予+6Gz和+10Gz负荷刺激3 min,于暴露后6 h取大鼠心肌组织,用原位末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡情况并计数. 结果: 对照组大鼠偶见TUNEL阳性染色的心肌凋亡细胞;+6Gz暴露组大鼠心肌凋亡细胞数较对照组显著增多(P＜0.05);+10Gz暴露组大鼠心肌凋亡阳性细胞数较对照组及+6 Gz组均明显增多(P＜0.05). 结论: +Gz暴露可以引起大鼠心肌细胞凋亡,且随着G值的增大,心肌凋亡细胞数目逐渐增多.
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成年SD大鼠心肌细胞的培养
目的: 建立稳定的成年SD大鼠心肌细胞分离和培养的方法.方法: 主动脉插管逆行灌流分离成年SD大鼠心肌细胞,进行体外培养,并观察其形态的变化.结果: 刚分离的心肌细胞呈长杆状,表面有明显横纹,非同步博动,在含血清的培养环境中,细胞形态很快发生变化,出现去分化表现,在无血清的培养环境中,细胞保持刚分离时的在体形状,2 wk后细胞均明显萎缩.结论: 主动脉插管逆行灌流的方法是较为理想的成年SD大鼠心肌细胞分离与培养方法.
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成年兔心耳肌细胞的分离标记与自体移植
目的: 建立可靠的成年兔心耳心肌细胞的急性分离和荧光标记的方法,观察心耳肌细胞移植到自体左室前壁的存活状况. 方法: 成年新西兰白兔20只,随机分为移植组和对照组(n=10). 结扎并剪取自体左心耳组织,急性消化分离为单细胞,经DAPI标记后分别将细胞悬液和培养基注射到移植组和对照组自体正常左室前壁内. 4 wk后处死兔子,取移植区组织进行组织学观察. 结果: 急性分离的细胞中绝大部分为杆状,形态结构符合心耳肌细胞的特征,且细胞活性好. 移植组梗死区内可以观察到"细胞岛"状结构,行荧光检测可见蓝色荧光的细胞核,而对照组梗死区内无细胞结构,证明移植的心耳肌细胞在移植区存活以及DAPI标记的可靠性. 与对照组相比,移植区血管密度增高(P=0.027). 结论: 酶消化法和DAPI荧光标记是一套可靠的心耳肌细胞急性分离和标记方法;急性分离的心耳肌细胞移植到自体左室前壁后可以存活,并能够促进周围血管生长.
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心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特性
目的: 研究急性分离小鼠心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特征. 方法: 采用膜片钳单通道(细胞贴附式和内面向外式)方法,记录急性分离的小鼠心肌细胞暴露于低渗溶液时出现的肿胀激活氯通道电流(ICl.swell). 结果: 等渗状态下,用细胞贴附式记录,多数心肌细胞膜片无通道活动,用低渗溶液灌流细胞,在细胞容积增大的同时,出现单通道电流的激活. 该肿胀激活单通道氯电压在-100 mV～+100 mV均有激活. 在电压+100 mV时,其单通道电导为(38.1±2.5) pS,开放概率为0.76±0.08,电流-电压曲线显示其反转电位(-34.5±2.8 ) mV, 接近氯离子平衡电位的理论值(ECl=-38.6 mV), 且反转电位随氯离子浓度的改变而改变. 氯通道阻断剂DIDS可逆性阻断该单通道电流. 结论: 小鼠心肌细胞肿胀激活氯通道的单通道电导为(38.1±2.5) pS,电流呈外向整流特征并对DIDS敏感.
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肌浆网内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响
目的:较系统地研究肌浆网(SR)内钙容量的减少对心肌细胞钙释放的影响.方法:采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量,以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量,以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放.胞内钙信号的变化均采用激光共聚焦显微镜的方法记录.结果:SR钙泵抑制剂TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引致心肌细胞SR内钙容量的耗减,而钙容量的耗减可相应地引起全细胞水平的钙释放减少.但二者的变化不完全平行,SR内钙容量的少量减少即可引起胞内钙释放的显著减少,而当SR内钙耗减到一定程度后(虽然此时SR内Ca2+仍远高于胞质内钙),场刺激已很难或无法引致钙释放.结论:心肌细胞SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用.
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次声诱导的大鼠心肌细胞凋亡和血管内皮损伤
目的: 检测次声诱导的大鼠心肌细胞凋亡和血管内皮损伤. 方法: 用8 Hz, 130 dB的次声分别作用大鼠0, 7, 14, 21和28 d,每日2 h,观察大鼠心肌凋亡蛋白Bax, Bcl-x的表达,测定大鼠血浆NO, ET-1的含量变化. 结果: 大鼠心肌凋亡蛋白与对照组比较Bax, Bcl-x的表达均增强,Bcl-x的表达增加比Bax表达增加少(P<0.01),有统计学意义. 大鼠血浆ET-1含量在暴露期间均明显升高(P<0.01),7 d时升高多,14 d时升高少,21和28 d时较14 d时有所升高;次声暴露7 d NO含量减少(P<0.05),14 d时显著降低(P<0.01),在次声作用的0,21和28 d时,与对照组比较无差别(P>0.05). 结论: 次声可引起大鼠心肌凋亡,血管内皮受损伤,这些变化和次声暴露的时间和量有关.
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黄芪对培养心肌细胞过氧化氢损伤的保护作用
目的: 探讨中药黄芪(Astragalus, AS)对培养的心肌细胞氧化性损伤的保护作用及其机制. 方法: 体外培养的新生大鼠心肌细胞,分为3组: ①对照组(Normal组);② H2O2组: H2O2 (0.2 mmol/L)与心肌细胞共育1 h;③黄芪+H2O2组: 黄芪处理心肌细胞30 min后,加入H2O2与心肌细胞共育1 h. 心肌细胞损伤以细胞线粒体活性和乳酸脱氢酶(LDH)活性来表示,同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,均以比色法检测. 结果: H2O2处理细胞后可使细胞LDH活性显著增高(27±3) μkat/L,细胞线粒体活性明显下降0.36±0.04,SOD 活性较正常细胞显著下降(231±22)μkat/L,MDA含量显著增高(16±3)μmol/L. 黄芪处理细胞后可显著提高心肌细胞线粒体活性0.50±0.05,降低LDH活性(16.4±1.8) μkat/L;并提高细胞抗氧化能力,表现为较H2O2处理组,SOD活性增高(331±40) μkat/L,MDA含量下降(10.7±2.4)μmol/L. 结论: 黄芪可对抗H2O2对心肌细胞的损伤,其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力有关.
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pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达
目的:构建pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达. 方法: 应用限制性内切酶将目的片段VEGF165克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒pIRES2-EGFP中. 转染心肌细胞后,应用荧光显微镜检测EGFP的表达,以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在体及离体表达. 结果: 构建了真核共表达载体pIRES2-EGFP-hVEGF165. 转染心肌细胞后,荧光显微镜观察可见EGFP的表达,免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达. 结论: 外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达.
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骨髓间质干细胞体外与阿霉素损伤的心肌细胞共培养时的定向分化
目的:研究兔骨髓间质干细胞(menseuchymal stem cells, MSCs)在体外以不同方式与阿霉素损伤后的仔鼠心肌细胞共培养时的定向分化情况,为心肌病细胞移植治疗提供基础. 方法: 体外分离培养兔骨髓间质干细胞,经5-氮杂胞苷诱导和DAPI标记后,与阿霉素预处理的乳鼠心肌细胞一起共培养,分别在共培养后的第14, 21, 28日,采用透视电镜观察超微结构,免疫细胞化学方法鉴定,并用流式细胞仪检测α-sarcomeric actin阳性或DAPI和Cy3双阳性细胞所占百分比. 取仅经5-氮杂胞苷诱导的的骨髓间质干细胞作为对照组. 结果: 21, 28 d时Millicell组和对照组可见小部分α-sarcomeric actin、desmin阳性细胞,直接接触组内DAPI标记的MSCs细胞部分免疫荧光反应阳性. 电镜观察可见横纹样结构形成,核呈卵圆形,位于细胞中央,胞质中可见富集的糖原颗粒. 流式细胞仪检测结果示直接接触组中双阳性细胞百分比高于其余两组. 结论: 骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在体外病理性心肌细胞微环境中可顺利分化为心肌样细胞. 同细胞液因子相比,细胞间的直接接触对MSCs的定向分化有更重要的促进作用,MSCs可与周围的心肌细胞形成某种连接. MSCs可能成为细胞移植治疗心肌病的一种新的细胞来源.
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转染bcl-2基因对心肌细胞活力的影响
目的: 研究转染抗凋亡基因bcl-2对心肌细胞活力的影响.方法: 提取含有人bcl-2 基因的逆转录病毒真核表达载体pDOR-SB质粒,用脂质体介导的基因转染法分别将pDOR-SB质粒和pDOR质粒(不含bcl-2 基因)转染心肌细胞,观察转染心肌细胞在缺氧环境下的存活能力.结果: ①原位杂交可见bcl-2基因转染了心肌细胞; ②转染bcl-2基因能明显提高心肌细胞在缺氧条件下的存活能力,提高对缺氧的耐受力.结论: 转染bcl-2基因能显著提高心肌细胞对缺氧的耐受性.
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肥大心肌细胞对AngⅡ诱发凋亡的易感性增加
目的: 建立心肌细胞肥大模型,观测正常与肥大心肌细胞对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)促凋亡刺激的易感性.方法: 采用新生大鼠原代培养心肌细胞,观测内皮素(ET-1)或Ang Ⅱ单独作用24 h后,心肌细胞面积与凋亡率的变化.进一步观测ET-1作用24 h后,再用Ang Ⅱ刺激24 h,心肌细胞凋亡率的变化.结果: ① 10或100 nmol*L-1 ET-1作用24 h,心肌细胞轮廓面积较对照组分别增加168%或184%.而凋亡率分别为10.9%或11.7%,与对照组(10.7%)相比均无显著性差异.② 0.1, 1.0或10.0 nmol*L-1 Ang Ⅱ单独作用24 h,心肌细胞的面积较对照组分别增大了146%, 162%或224%.其凋亡率则分别为12.6%, 17.2%或16.2%,均与对照组有显著性差异.③经10 nmol*L-1 ET-1处理24 h后,再用1 nmol*L-1 Ang Ⅱ作用24 h,心肌细胞的凋亡率进一步增加为21.6%,与对照组或1.0 nmol*L-1 Ang Ⅱ刺激组相比,均具有显著性差异.④ Ang Ⅱ的AT1受体阻滞剂Losartan既可抑制Ang Ⅱ诱导的正常心肌细胞凋亡,亦可抑制肥大心肌细胞的凋亡.而AT2受体阻滞剂PD123319则无明显作用.结论: ET-1具有剂量依赖性促心肌细胞肥大作用,而对心肌细胞凋亡率无明显影响.Ang Ⅱ有剂量依赖性促心肌细胞肥大作用和非剂量依赖性促心肌细胞凋亡作用,其促凋亡作用由AT1介导.相同刺激条件下,肥大的心肌细胞较正常心肌细胞更容易发生凋亡.
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胚胎心肌细胞移植到急性梗死心肌区的实验研究
目的观察移植的胚胎心肌细胞在成年兔急性梗死心肌组织内的生长发育过程和其与宿主心肌组织的相互作用,以及对周围心肌血运的影响. 方法将培养的兔胚胎心肌细胞,经DAPI标记后,直接注入成年兔的急性梗死心肌组织内(通过结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型),同时设立对照组. 4 wk后处死动物,进行组织学和电镜观察. 结果 4 wk后的心肌组织切片中,移植心肌细胞与宿主心肌细胞之间形成闰盘,其排列方向与宿主心肌肌纤维方向平行,同时,与对照组相比,心肌梗死区面积减少及移植区血管密度增高(P<0.05). 结论移植的胚胎心肌细胞在受体急性梗死心肌内可以继续生长发育,逐渐分化成熟,从而稳定病损的心肌结构,改善心脏的收缩功能,同时,对改善周围血供起到积极作用.
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大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化
目的通过体外药物诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化,进一步验证其多能分化特性. 方法分离培养大鼠MSCs,5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-cdR)作用24 h后继续培养4 wk,电镜超微结构观察,免疫细胞化学染色鉴定. 结果 5-Aza-cdR诱导4 wk后的部分大鼠骨髓间充质干细胞α-Actinin, Troponin T阳性表达,电镜观察可见横纹样结构形成,核呈卵圆形,位于细胞中央位置,胞质中可见富集的糖原颗粒及大量线粒体. 结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,能在体外条件下经5-Aza-cdR诱导分化成心肌细胞.
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Fas系统参与介导缺氧诱导的心肌细胞凋亡
目的观察缺氧不同时间新生大鼠心肌细胞凋亡率及心肌细胞Fas抗原表达的变化,以明确Fas系统是否介导了缺氧诱导的心肌细胞凋亡. 方法取体外培养的新生大鼠心肌细胞于950 mL*L-1 N2, 50 mL*L-1 CO2孵箱中培养16 h,32 h和48 h,造成缺氧损伤的细胞模型,分别检测心肌细胞凋亡及Fas抗原表达的情况. 结果在缺氧条件下培养16 h,32 h和48 h后,流式细胞仪检测到心肌细胞的凋亡率分别为:(2.9±0.5)%, (6.2±0.8)%和(26.6±3.0)%;Fas抗原表达率分别为:(13.6±5.1)%,(25.9±4.7)%和(51.0±4.9)%. 结论心肌细胞凋亡是缺氧时心肌细胞死亡的重要形式;心肌细胞凋亡率及心肌细胞Fas抗原的表达率随着缺氧时间的延长而增高;Fas系统参与介导缺氧诱导的心肌细胞凋亡.
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卡维地洛对缺氧心肌细胞NO生成的影响
目的通过研究卡维地洛对培养的心肌细胞在缺氧过程中NO生成的影响,探讨NO是否参与了卡维地洛减少缺血/再灌注损伤的机制. 方法采用SD大鼠乳鼠心肌细胞,缺氧缺糖模拟缺血. 实验分为对照组和卡维地洛组. 对照组不加药,卡维地洛又分为1×10-6,3×10-6,1×10-5 mol*L-1 3个浓度亚组,各组按孵育时间又分为12 h和24 h两组. 结果各组缺氧前NO产量无明显差异(各组间P>0.05);缺氧后各组各个时间点NO产量与缺氧前比均有明显升高(P<0.01),而各组内各个时间点间差异显著(P<0.01);卡维地洛1×10-6 mol*L-1组各个时间点NO产量与对照组差异不显著(P<0.01);而3×10-6和1×10-5 mol*L-1组在缺氧后12 h和24 h与对照组相比NO显著升高(P<0.01),且与1×10-6 mol*L-1组差异明显(P<0.01). 结论卡维地洛可以进一步增加缺氧期间心肌细胞NO的产量,而后者可以减少缺氧时心肌的损伤,因此,在卡维地洛减少I/R损伤的过程中可能也有NO的参与.
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pH对心脏κ-阿片受体调节Ca2+瞬变作用的影响
目的研究pH对κ-阿片受体调节心肌细胞内钙瞬变作用的影响. 方法用光谱荧光法,以Fura-2为Ca2+指示剂测定大鼠单个心肌细胞电刺激引起的钙瞬变,观察激动κ-阿片受体对钙瞬变的影响及在不同pH值时该作用的变化特点. 结果当细胞外液pH为7.4时,U50, 488H (κ-阿片受体选择性激动剂)在10 μmol*L-1～30 μmol*L-1浓度范围内剂量依赖性地降低心肌细胞的钙瞬变, 该作用具有时间依赖性. 当细胞外液的pH为6.8时,U50, 488H的作用曲线明显右移,表明其作用减弱. 当细胞外液的pH为8.0时,U50, 488H的作用曲线明显左移,而且其大效应提前发生,表明U50, 488H的作用被加快和加强. 结论 pH对κ-受体介导的钙反应具有调节作用;临床酸化血液可能对阿片中毒者具有抗毒效应,而碱化血液可能会加重阿片类药物的毒性作用.
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褪黑素对氧化损伤培养心肌细胞的保护作用
目的建立心肌细胞氧化损伤模型,探讨褪黑素(MT)的保护作用. 方法① 采用两种荧光探针DCFH-DA和Fluo-3-AM分别标记细胞,用激光共聚焦显微镜观察低浓度H2O2对心肌细胞内活性氧(ROS)和游离钙([Ca2+]i)的影响. ② TBA法检测不同时间细胞丙二醛(MDA)含量. ③生化法检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量. ④台盼拒染法观察心肌细胞存活率. 结果与对照组相比,低浓度H2O2 (100 mol*L-1)可使细胞内ROS、[Ca2+]i、MDA、LDH明显升高(P<0.01)和细胞存活率明显下降(P<0.01);MT预处理后细胞内ROS、[Ca2+]i、MDA、LDH升高明显减弱,细胞存活率明显升高,两组相比差异显著(P<0.01). 结论 MT从多个方面都表现出良好的抗过氧化损伤效果,具有明显保护损伤心肌细胞的作用.
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血管钠肽抑制低氧诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成
目的观察血管钠肽(Vasonatrin peptide, VNP)对低氧状态下大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖及胶原合成的影响,探讨其防治低氧所致心肌间质结构重建的作用机制. 方法培养新生大鼠CFs, 应用流式细胞仪分析细胞周期,以3H-proline掺入率反映胶原合成速率. 结果单纯低氧不改变CFs的细胞周期,但增加低浓度血清(25 mL*L-1)作用基础上的细胞增殖指数PI (S+G2/M) / (S+G2/M+G0/G1) (P<0.01),10-6 mol*L-1的VNP抑制低氧诱导的PI增加(P<0.01). 低氧可以增加基础胶原合成(增加19.6%, P<0.05),也增加低浓度血清 (25 mL*L-1)诱导的胶原合成速率(增加37.2%, P<0.01). 10-8～10-6 mol*L-1的VNP浓度依赖性抑制低氧诱导的胶原合成速率 (P<0.01). 结论低氧增加胶原合成以及血清刺激的CFs的增殖反应,VNP抑制上述作用,从而抑制低氧引起的心肌纤维化.
