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MiRNA-146a对血管平滑肌细胞凋亡的抑制作用
目的 观察miRNA-146a对血管平滑肌细胞凋亡的作用并研究其机制.方法 原代培养大鼠血管平滑肌细胞,分成inhibitor组、control组和normal组,采用脂质体2000分别转染miRNA-146a inhibitors(50 μM)、错义链(50 μM)、PBS,real time PCR测定转染后miRNA-146a水平,流式细胞仪检测转染后血管平滑肌细胞凋亡,western blot检测转染后Bax蛋白水平.结果 转染48 h后,inhibitor组血管平滑肌细胞的miRNA-146a水平明显低于normal和control组(P＜0.01),inhibitor组血管平滑肌细胞的凋亡显著高于normal、control组(P＜0.05),且Bax蛋白表达水平增加(P＜0.05).结论 miRNA-146a可以抑制血管平滑肌细胞的凋亡,其机制与抑制Bax表达相关.
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血管平滑肌细胞相关细胞生长因子研究进展
经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)术后再狭窄是目前尚未解决的问题,在再狭窄发生过程中,尤其是中后期,除血管平滑肌细胞迁移、过度增殖和细胞外基质大量的合成是导致血管内膜增厚管腔狭窄外.细胞因子在此过程中亦发挥极其重要作用,现就三种研究较多的细胞因子做一综述.
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VEGF165正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节
目的构建VEGF165(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞VEGF在mRNA和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将VEGF165 cDNA从pGEM-hVEGF165克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒pCDNA3中,构建VEGF165正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和Sanger双脱氧终止DNA测序法证明VEGF165正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将VEGF165正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用RNA斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及DNA测序表明VFGF165正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P＜0.05vs对照组,31.6%),转染反义表达载体后VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P＜0.05vs对照组).结论成功地构建了VEGF165正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平.
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肽类生长因子及苏拉明对体外培养人脐静脉内皮细胞生长的影响
目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和苏拉明(suramin)对体外培养人脐静脉内皮细胞生长(HUVEC)的影响,旨在探讨他们在肿瘤血管生成和抗肿瘤血管生成中的作用.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞EV-304,一组用不同浓度的bFGF(0.01、0.1、1.0、10、100 ng/mL)进行培养,另一组在用不同浓度的苏拉明(0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L)培养6 h后加入浓度为10 ng/mL的bFGF再进行培养.结果:bFGF 可明显刺激内皮细胞的生长,而 Suramin 可阻止 bFGF 对内皮细胞的生长刺激.结论:苏拉明对体外培养内皮细胞的生长抑制作用可能是通过中和肽类生长因子如bFGF及引起内皮细胞凋亡来实现的.
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氧化苦参碱抑制肝癌细胞诱导血管内皮细胞增殖作用的研究
目的:探讨氧化苦参碱(OM)对肝癌细胞诱导血管内皮细胞(VEC)增殖的抑制作用.方法:用 MTT 法检测不同浓度 OM 对 VEC、人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖及 SMMC-7721 细胞诱导 VEC 增殖的影响.结果: OM 浓度为 2.5～10 mg/mL 时,对 VEC 增殖的抑制率为 4.6%～36.4%;OM 浓度为 0.313～10 mg/mL 时,对肝癌细胞增殖的抑制率为 2.53%～88.61% ;经浓度为 1.25～10 mg/mL OM 作用后的肝癌细胞培养液对 VEC 增殖的抑制率为 7.69%～38.46% ;OM 浓度为 0.625～10 mg/mL 时,对肝癌细胞培养液诱导的 VEC 增殖的抑制率为 3.57%～57.54%.结论: OM 对肝癌细胞诱导的 VEC 增殖具有抑制作用.
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同源异位基因与血管生成的研究
同源异位基因作为组织分化调节基因,其与血管生成的关系已从多方面进行了研究,如HOXD3、HOXB3、HOXD10、 PRX、HEX等.就现阶段的研究情况对HOX基因与血管生成之间的关系予以综述.
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血管内皮生长因子对急性髓系白血病细胞体外作用研究
目的:探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对白血病细胞生物学特性的影响.方法:台盼蓝拒染实验观察VEGF对白血病细胞增殖的影响,流式细胞术检测VEGF对化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)所诱导的白血病细胞凋亡和胞内抗凋亡蛋白bcl-2表达的影响,用集落形成方法观察VEGF对白血病祖细胞增殖的影响.结果:50ng/mL VEGF作用白血病细胞24 h,活细胞数为(3.63±1.27)×106mL-1,与阴性对照(3.23±1.60)×106mL-1差异无统计学意义.VEGF可以抵抗Ara-C 200ng/mL诱导白血病细胞的凋亡.白血病细胞胞内bcl-2蛋白的阳性表达(70.78±13.36)%明显高于正常对照组(18.55±9.24)%,P=0.039.VEGF可显著延缓细胞内bcl-2表达.VEGF组:(50.85±30.46)%,阴性对照:(36.52±12.38)%.VEGF促进非红系(白血病)集落的形成.VEGF组:(49.9±29.2)/0.5 mL,阴性对照:(36.5±12.4)/0.5 mL,P=0.013;VEGF对红系和混合集落形成无明显影响.结论:VEGF能抵抗化疗药物Ara-C所致的白血病细胞凋亡,并促进白血病细胞集落的形成,以VEGF为AML治疗靶点可望改善患者的预后.
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重组人血管内皮抑素联合NP方案治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察
目的:观察YH-16联合长春瑞滨和顺铂(NP)治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的近期疗效和安全性,同时探讨循环血管内皮细胞(CECs)与该方案疗效的相关性.方法:应用YH-16联合NP方案治疗晚期NSCLC 11例,观察其近期疗效及毒副反应.流式细胞法检测治疗前后外周血CECs数量.结果:在可评价疗效的11例患者中,CR 0例,PR 1例,SD 6例,PD 4例.初治患者3例,PR 1例,SD 2例.复治患者9例,其中二线治疗3例,均为SD;三线治疗3例,SD 1例,PD 2例;四线治疗2例,均为PD.该方案用药期间,除Ⅰ～Ⅱ度恶心呕吐及骨髓抑制,3例出现轻度心慌,4例出现轻度乏力,不影响继续用药.7例临床受益患者CECs由(0.67±0.20)%下降为(0.43±0.20)%,4例临床进展患者CECs由(0.69±0.25)%上升为(1.08±0.63)%.结论:YH-16联合 NP方案一线治疗NSCLC疗效满意,有可能使含铂一线甚至多线化疗失败者(身体状况良好者)继续临床受益;该方案安全性较好;CECs可能是一个较好的预测化疗联合抗血管生成治疗疗效的标志.
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Caveolin-1对内皮细胞增殖的抑制作用研究
目的:研究Caveolin-1蛋白在内皮细胞增殖中的作用,其与Ras-p42/44MAPK细胞信号通路的关系.方法:以腺病毒介导在内皮细胞中表达外源Caveolin-1蛋白,分析其对内皮细胞增殖和p42/44MAPK分子磷酸化水平的影响.结果:感染腺病毒表达外源Caveolin-1蛋白的内皮细胞中,血管内皮生长因子(VEGF)诱导的3H-胸腺嘧啶掺入量降低了35%(n=3,P=0.009),p42/44MAPK分子磷酸化水平降低了47.6%.结论:Caveolin-1蛋白抑制p42/44MAPK分子磷酸化水平,抑制内皮细胞增殖.
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人arresten因子对内皮细胞与LOVO细胞黏附的抑制
目的:观察人arresten因子对人脐静脉内皮细胞HUVEC与LOVO细胞黏附的影响,探讨与之相关的黏附分子表达的变化.方法:半定量RT-PCR检测arresten对人脐静脉内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA的影响,Western-blot检测VCAM-1蛋白表达的变化.孟加拉玫瑰红活细胞染色法观察arresten因子对内皮细胞与LOVO细胞黏附的影响.结果:RT PCR及Western-blot结果表明VCAM-1在HUVEC细胞中高表达,但经过arresten因子处理的HUVEC细胞,其VCAM-1在mRNA水平及蛋白水平的表达均显著下降(P＜0.05).孟加拉玫瑰红活细胞染色法显示arresten能抑制HUVEC细胞与LOVO细胞的黏附.结论:arresten因子通过降低内皮细胞VCAM-1的表达抑制内皮细胞与肿瘤细胞的黏附,这可能是其抑制肿瘤转移的一种途径.
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缓激肽对大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞及胶质瘤细胞影响的体外研究
目的:体外探讨缓激肽(bradykinin,BK)的作用靶点细胞及BK选择性开放血脑屏障的可能机制.方法:通过免疫荧光测定脑血管内皮细胞、胶质细胞及C6细胞在不同剂量BK作用前后的细胞内钙离子变化,并且通过Western Blot测定三组细胞的BK B2受体表达水平.结果:小剂量BK可以引起肿瘤细胞内的钙离子水平升高,而只有大剂量BK才能触发星形胶质细胞内的钙离子水平变化,脑血管内皮细胞对大、小剂量BK均无任何反应;三组细胞BK B2受体的Western Blot整合密度值(integrated density value, IDV)分别为5 000.12±1 110.21(n=2)、18 480.88±4 119.86 (n=3)和63 032.13±2 802.71 (n=4),组间比较差异有统计学意义.结论:BK的直接作用靶点是星形胶质细胞及肿瘤细胞,两种细胞B2受体表达水平差异是小剂量BK选择性开放血肿瘤屏障的物质基础;BK可能通过某些细胞间信使起到调节脑血管内皮细胞通透性的作用.
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内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子对兔桡骨骨折愈合影响的比较
背景:研究表明,血管内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子均在软骨内成骨及骨折愈合血管增生过程中发挥重要作用.目的:对比观察血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子在骨折愈合过程中的作用.设计、时间及地点:以动物为观察对象,双因素设计的验证性实验,于2005-08/2006-05在华北煤炭医学院病理学实验室完成.材料:选用成年健康日本大耳白兔24只,共取兔双前肢桡骨48侧,制作双侧桡骨中段骨折动物模型.按随机数字表法分为内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子组,每组24侧.方法:内皮细胞生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组分别在骨折局部注射内皮细胞生长因子0.2μg,碱性成纤维细胞生长因了100 ng.术后不用外固定.主要观察指标:分别于术后2,4和6周取材,测定骨痂矢状径、横径及截面积;通过X射线片观察骨折愈合情况,并测定外骨痂总面秘:观察骨折愈合的组织学变化,并测定骨痂中小梁骨、软骨、纤维组织所占百分比.结果:①骨折后2周,内皮细胞生长因子组的骨痂横径及矢状径大于碱性成纤维细胞生长因子组(P<0.05):4周时碱性成纤维细胞生长因子组的骨痂矢状径及截面积大于内皮细胞生长因子组(P<0.01):6周时碱性成纤维细胞生长因子组的骨痂截面积大于内皮细胞生长因子组(P<0.01).②骨折后2周,在X射线片上内皮细胞生长因子组可见较多外骨痂,骨折线较模糊:碱性成纤维细胞生长因子组骨折间隙较小.4周时碱件成纤维细胞生长因子组骨折基本愈合.6周时碱件成纤维细胞生长因子组骨折愈合.③骨折后2周,内皮细胞生长因子组组织切片小梁骨痂所占百分比大于碱性成纤维细胞生长因子组(P<0.01):6周时碱性成纤维细胞生长因子组的小梁骨痂所占百分比大于内皮细胞生长因子组(P<0.01).结论:骨折时局部应用内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可促进骨折愈合,内皮细胞生长因子促进早期骨折愈合,碱性成纤维细胞生长因子促进中晚期骨折愈合.
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人动脉原位干细胞的生物学特性
背景:作者前期工作已经证实,在人体的多种组织中均存在有-类分化潜能可与胚眙干细胞媲美的原始干细胞群体,其表型为CD105+.目的:验证人的动脉是否也存在原位干细胞,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2004-01/2007-01在河南省人民医院和中国医学科学院组织工程中心完成.材料:实验血管来源于流产胎儿,实验方案经河南省人民医院伦理委员会批准.方法:用MACS磁珠分选CD105+细胞,应用极限稀释法获得单细胞克隆,观察其表型,在特定的诱导培养基中培养,用免疫荧光法和免疫印迹等方法检测其分化.主要观察指标:①干细胞表面抗原鉴定.②血管内皮、平滑肌细胞和脂肪细胞特异性抗原表达.结果:细胞的表型是CD105+Flk1+CD31-α SMA-,可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化.结论:人的动脉中存在着可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化的干细胞.
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人动脉原位干细胞的生物学特性
背景:作者前期工作已经证实,在人体的多种组织中均存在有-类分化潜能可与胚眙干细胞媲美的原始干细胞群体,其表型为CD105+.目的:验证人的动脉是否也存在原位干细胞,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2004-01/2007-01在河南省人民医院和中国医学科学院组织工程中心完成.材料:实验血管来源于流产胎儿,实验方案经河南省人民医院伦理委员会批准.方法:用MACS磁珠分选CD105+细胞,应用极限稀释法获得单细胞克隆,观察其表型,在特定的诱导培养基中培养,用免疫荧光法和免疫印迹等方法检测其分化.主要观察指标:①干细胞表面抗原鉴定.②血管内皮、平滑肌细胞和脂肪细胞特异性抗原表达.结果:细胞的表型是CD105+Flk1+CD31-α SMA-,可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化.结论:人的动脉中存在着可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化的干细胞.
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雷帕霉素滴眼液对兔角膜新生血管的抑制作用
背景:雷帕霉素为抗移植排斥反应的药物,近年来有实验证实雷帕霉索能有效抑制小鼠视网膜及虹膜新生血管.目的:验证新型免疫抑制荆雷帕霉素对碱烧伤诱导兔角膜新生血管的影响,并与地塞米松相比较.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-02在重庆医科大学基础研究所免疫组织化学实验室及神经病学重点实验室完成.材料:选用健康成年新西兰家兔30只30眼,制作中度碱烧伤诱导的兔角膜新生血管模型.方法:将造模成功的30只兔30眼按随机数字表法分为5组(n=6),即10,20 mg/L雷帕霉素组、2.5 g/L地塞米松组、雷帕霉素溶媒组及空白对照组,空白对照组不给予任何干预措施,其余各组均于碱烧伤后第2天给予相应药物滴眼,4次,d.主要观察指标:于碱烧伤后第3,7,14天应用显微镜观察各组兔角膜新生血管的长度及面积,用免疫组织化学方法定性观察血管内皮生长因子的表达.结果:①10,20 mg/L雷帕霉索组、2.5 g/t,地塞米松组兔角膜新生血管的长度与面积均小于雷帕霉素溶媒组及空白对照组(P＜0.01).其中10,20 mg/L几雷帕霉素组小于2.5 g/L地塞米松组(P＜0.05),不同剂量的雷帕霉素组差异不明显.②角膜血管内皮生长因子在10,20mg/L雷帕霉索组及2.5 g/L地塞米松组表达减弱.在雷帕霉素溶媒组与空白对照组表达增强.结论:局部滴用10,20 mg/L雷帕霉素滴眼液及2.5 g/L地塞米松滴眼液均可抑制碱烧伤诱导兔角膜新生血管的生长,雷帕霉素作用强于地塞米松.
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Na+/H+交换器-1抑制诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的可能机制
背景:肺动脉平滑肌细胞( pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)的增殖在缺氧肺动脉高压肺血管重构中起重要作用.解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸研究所在前期实验中通过构建 Na+ /H+交换器- 1( sodium/proton exchanger isoform-1, Na+ /H+ exchanger isoform-1, Na+ /H+ antiporter isoform-1, NHE-1)特异性核酶基因逆转录病毒载体,转染入体外培养的大鼠 PASMC内表达,发现 NHE-1抑制可诱导细胞内酸化而抑制 PASMC增殖,并促进其凋亡.但这种促凋亡作用是通过什么途径来完成,尚不清楚.目的:探讨 Bcl-2、 Bax蛋白表达在 NHE-1抑制而诱导大鼠 PASMC凋亡中的作用.设计:分组对照实验.地点和材料:实验在解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所完成.转染表达 NHE-1特异性核酶基因的体外培养大鼠 PASMC( PRZ细胞)、转染 PLXSN空载体的大鼠 PASMC( PX细胞)、未处理大鼠 PASMC细胞( PA细胞)为前期实验所制备.干预:已构建 NHE-1特异性核酶基因逆转录病毒载体,转染入体外培养的大鼠 PASMC内表达,同时转染 pLXSN空载体入另一组大鼠 PASMC内,后者与未转染的大鼠 PASMC细胞为对照组.用荧光指示剂( Fura-2/AM)测定法检测转染 NHE-1特异性核酶基因的大鼠 PASMC内 Ca2+( [Ca2+ ]i)变化; RT-PCR方法检测细胞内 Bcl-2和 Bax mRNA表达变化,免疫组化法检测细胞内 Bcl-2和 Bax蛋白表达变化.主要观察指标:①转染 NHE-1特异性核酶基因的大鼠 PASMC内 Ca2+( [Ca2+ ]i)变化.②细胞内 Bcl-2和 Bax mRNA表达变化.③细胞内 Bcl-2和 Bax蛋白表达变化.结果:转染 NHE-1特异性核酶基因后,大鼠 PASMC内 [Ca2+ ]i显著升高,细胞内 [Ca2+ ]i在 PA细胞 [(95.94± 6.39) nmol/L]与 PX细胞 [(98.08± 7.37) nmol/L]之间差异无显著性意义( P 》0.05),而 PRZ细胞 [(198.08± 16.59) nmol/L]显著高于 PA细胞及 PX细胞 , 差异有显著性意义( P《 0.001).Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著降低( PA细胞、 PX细胞、 PRZ细胞的平均积分光密度分别为 2.21± 0.18, 2.09± 0.30, 1.45± 0.20), Bax mRNA和蛋白表达显著增加( PA细胞、 PX细胞、 PRZ细胞的 ABax/Aβ-actin分别为 0.17± 0.02, 0.23± 0.06, 0.59± 0.08).结论: NHE-1抑制诱导的 PASMC凋亡与 [Ca2+ ]i增加、 Bcl-2表达降低及 Bax表达增加有关.
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应用分离微血管段方法培养人脑微血管内皮细胞及对血管内皮细胞生长因子基因表达细胞超微结构的观察
背景:观察缺氧状态下脑血管内皮细胞的血管内皮细胞生长因子表达及细胞超微结构变化,可为从细胞和分子水平认识血管生成及其相关的细胞因子参与缺血性脑血管疾病的病变过程.目的:构建分离微血管段体外培养人脑微血管内皮细胞的方法,并观察血管内皮细胞生长因子基因表达与细胞超微结构变化.设计:随机对照的技术方法研究.单位:一所军区总医院的神经外科,一所大学医院的神经外科.对象:2002年沈阳军区总医院神经外科脑动静脉畸形患者18例(SpetzlerⅡ～Ⅲ级),全部病例术前均经全脑血管造影证实.取材于手术中切除的完整脑动静脉畸形新鲜标本周围粘连的新鲜脑组织,采用匀浆、过滤和酶消化技术分离微血管内皮细胞.将在培养瓶内生长良好的细胞分成缺氧2,4,8 h组和对照组4组,每4瓶为1组.方法:缺氧条件模拟:体积分数0.95 N2,体积分数0.05 CO2.免疫组化方法检测细胞中第八因子相关抗原(FⅧ-RA)表达.选用RT-PCR技术观察每组内皮细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达,同时以ELISA方法检测每组细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量,透射电镜观察细胞超微结构的变化.主要观察指标:对照组和各缺氧组血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子mRNA表达和细胞上清液中血管内皮细胞生长因子蛋白含量,以及细胞超微结构的变化.结果:相差显微镜下,培养的活细胞具有单层"卵石样"排列的典型特征,90%以上的细胞为FⅧ-RA阳性染色.缺氧4 h细胞血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达为0.98±0.19,(180.77±20.15)ng/L,较对照组显著升高[0,(26.20±6.33)ng/L,P＜0.01],8 h后表达下调[0.35±0.07,(31.68±8.34)ng/L],并出现线粒体肿胀、内质网扩张及溶酶体多囊泡形成.结论:采用分离微血管段方法培养人脑血管内皮细胞,操作简便易行,细胞纯度可靠.缺血缺氧早期血管内皮细胞生长因子表达不足以维持细胞超微结构完整,随缺氧时间延长细胞可发生损伤性变化.
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缺氧对体外培养动脉内皮细胞中诱生型一氧化氮合酶表达和细胞形态的影响
目的:观察体外培养的动脉内皮细胞在缺氧条件下诱生型一氧化氮合酶的表达和细胞形态的变化情况.方法:实验于2004-09/11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室实验室完成.原代培养牛动脉内皮细胞,将培养的内皮细胞随机分为5组,即常氧组、缺氧0.5,1,2,3 h组.每组切片选取12个400倍视野进行观察.诱生型一氧化氮合酶的表达采用免疫组织化学法测定.用计算机图文分析系统对各组切片内皮细胞诱生型一氧化氮合酶阳性表达的平均积分吸光度和缺氧后的细胞形态进行分析.结果:①缺氧1 h,2 h,3 h组的平均积分吸光度显著高于常氧组[0.100 8±0.019,0.117 9±0.037,0.196 4±0.023,0.073 5±0.032(t=-10.364～2.133,P＜0.05～0.01)].②缺氧后细胞的大直径和小直径均变小,核浆比例增大,细胞数量减少.结论:缺氧后动脉内皮细胞的生长数量和形态发生明显变化,使其屏障作用降低;同时诱生型一氧化氮合酶表达的增加提示诱生型一氧化氮合酶在缺氧后内皮细胞的损伤中发挥重要作用.
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干预糖尿病患者血管病变:二氯醋酸二异丙胺对内皮细胞的功能效应
目的:了解丙酮酸脱氢酶激活剂二氯醋酸二异丙胺对内皮细胞功能指标的影响.方法:将传代培养的人脐静脉内皮细胞接种至6孔板,培养48～72 h至90%融合.将每孔分别分组:对照组:葡萄糖浓度为5.5 mmol/L;高糖组:葡萄糖浓度为30 mmol/L;二氯醋酸二异丙胺+高糖组:浓度为1×10-5,1×10-4,1×10-3 mol/L的二氯醋酸二异丙胺,加高糖处理48 h.用2.5 g/L胰酶消化收集细胞;固定后充分混匀制成1×10 9 L-1细胞悬液;加RNA酶A37℃水浴45 min;加入碘化丙啶50g/L混匀,4℃避光放置60 min,尼龙网滤过,上流式细胞仪分析细胞DNA含量,计数10 000个细胞,以亚G1峰细胞为凋亡细胞,计算细胞凋亡率.以体外原代培养的人脐静脉内皮细胞为靶细胞观察二氯醋酸二异丙胺对高糖诱导的血管内皮细胞功能指标一氧化氮和可溶性细胞间黏附分子1及细胞凋亡的影响;用改进的DPN诱导分析法检测二氯醋酸二异丙胺对人脐静脉内皮细胞中丙酮酸脱氢酶活性的影响.结果:①高糖组细胞一氧化氮浓度[(590.77±56.00)μmol/L]明显低于对照组[(799.47±51.77)μmol/L,P＜0.01],可溶性细胞间黏附分子1水平明显高于对照组(P＜0.001).二氯醋酸二异丙胺+高糖组细胞一氧化氮浓度明显高于高糖组(P＜0.05～0.01),可溶性细胞间黏附分子1水平明显低于高糖组(P＜0.01).②不同浓度的二氯醋酸二异丙胺可呈浓度依赖性激活丙酮酸脱氢酶活性,高浓度组与中、低浓度二氯醋酸二异丙胺组相比,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:二氯醋酸二异丙胺可以通过对丙酮酸脱氢酶的激活来纠正内皮细胞功能紊乱.
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绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力
目的:研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力,为血管组织工程在体研究提供实验依据.方法:实验于2003-10/2004-10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成.无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓,用直接贴壁法获得小鼠MSCs,然后以血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)进行诱导分化,后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrandfactor,vWF)免疫荧光鉴定观察.结果:MSCs每扩增一代,细胞数量增加4～8倍,7.0×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.4×108个细胞.在70%～80%融合时呈现"铺路石"样形态,说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同.添加VEGF诱导2周后,以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现,诱导组的vWF呈阳性表达,对照组vWF表达呈阴性.结论:绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强,在VEGF作用下可以向内皮细胞转化.
