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PKB/CDC25B信号通路对甲状腺鳞癌SW579细胞生长增殖的调控作用
目的 探讨PKB/Cdc25B信号通路对甲状腺鳞癌SW579细胞生长增殖的调控作用.方法 体外培养甲状腺鳞癌SW579细胞,实验分为对照组、Wortmannin组和DMSO组,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;用western blot方法检测PKB、CDC25B蛋白表达和PKB-pS473、CDC25B-pS353及CDC2-pTyr15的磷酸化状态;用ELISA方法检测MPF活性.结果 与对照组相比,DMSO组细胞形态无明显变化,各项检测指标无明显差异(P＞0.05);Wortmannin组细胞形态回缩,PKB和CDC25B蛋白表达明显下降(P＜0.01),PKB-pS473和CDC25B-pS353的磷酸化水平显著下调(P＜0.01),而CDC2-pTyr15的磷酸化水平显著上调(P＜0.01),MPF活性明显下降(P＜0.01).结论 甲状腺鳞癌SW579细胞内源性PKB可以通过调控CDC25B对MPF活性及细胞增殖产生影响.
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细胞分裂周期蛋白CDC25B抑制剂研究进展
CDC25(cell division cyclin 25)是调控细胞周期的重要蛋白,主要有CDC25A,CDC25B和CDC25C 3种亚型.CDC25B的过表达与许多癌症的发生有关,被认为是新的很有潜力的抗肿瘤药物靶点.高活性、高选择性的小分子抑制剂能为研究CDC25B在细胞通路中的生物功能和作用机制提供工具化合物,为抗肿瘤药物研究提供药物先导物.本文就2012年以来报道的CDC25B抑制剂做简要的综述.
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从PKA到MPF途径调控卵细胞减数分裂周期的研究进展
在大多数物种中,由于未知的体内信号作用,细胞减数分裂周期停滞在分裂前期到中期的过渡阶段.在促黄体激素作用下,Cdc2/cyclinB复合物(即MPF)的Cdc2激酶组分被活化,进而促发胚泡破裂.这种现象的内在机制为高浓度的cAMP及活化的PKA导致Cdc25B及Wee1b磷酸化从而使Cdc25B失活及Wee1b活化,活化的蛋白激酶Wee1b磷酸化Cdc2使MPF失活,从而使减数分裂停滞在分裂前期.在促黄体激素的作用下,终导致MPF再次活化,减数分裂重新开始.
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Cdc25B蛋白过表达可使小鼠胚胎突破2-细胞期阻滞
目的:探讨Cdc25B蛋白过表达对小鼠2-细胞期胚胎发育的影响.方法:利用体外转录试剂盒将Cdc25B转录成mRNA,将mRNA显微注射入小鼠2-细胞期胚胎中,观察胚胎发育情况和卵裂率.用蛋白激酶活性测定方法和western印迹分别检测Cdc25B蛋白过表达小鼠胚胎MPF的活性及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态.结果:hCG后48 h,mRNA注射组有超过40%的2-细胞期胚胎分裂到4-细胞期而对照组仍停留在2-细胞期;激酶活性测定显示注射Cdc25BmRNA后,MPF的活性显著升高;Cdc2-Tyr15的磷酸化状态变化与激酶活性测定结果一致.结论:Cdc25B蛋白过表达可以激活有丝分裂促进因子(MPF),从而使小鼠2-细胞期胚胎突破2-细胞期阻滞,发育到4-细胞期.
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基于虚拟筛选的3D QSAR药效团设计CDC25B抑制剂
目的:用计算机辅助药物设计的方法发现潜在的CDC25B抑制剂.方法:用Hypogen方法研究CDC25B抑制剂.cost分析、测试集预测和Fisher检验用来验证该模型的可靠性.随后,运用hypo-1-CDC25B对ZINC数据库进行筛选,得到符合成药五规则的26个化合物,26个化合物进行分子对接得到6个对接得分高的化合物.结果:通过分子对接研究,发现6个化合物有较好的亲和力.结论:发现6个潜在的CDC25B抑制剂,这有助于发现治疗癌症的强有力的先导化合物.
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CDC25B与CDK2/Cyclin A蛋白相互作用研究
目的:研究双特异性蛋白磷酸酶B(CDC25B)与细胞周期素A(CyclinA)和细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)蛋白发生相互作用的结构基础.方法:应用Discovery Studio (DS) v3.5中的ZDOCK模块对CDC25B与CDK2/CyclinA蛋白进行对接.应用“Analyze Protein Interface”模块计算CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白的溶剂可及表面积(SAS)并分析CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白相互作用界面的关键氨基酸残基.应用“Calculate Interaction Energy”模块计算CDC25B蛋白和CDK2/CyclinA蛋白相互作用界面处的关键氨基酸残基间的相互作用能.结果:对pose 1的疏水相互作用、氢键相互作用、相互作用能进行计算分析,预测得到CDC25B-CDK2/Cyclin A复合物的结合模式及起相互作用的氨基酸残基(CDC25B:GLY380,TYR382,ARG485,ARG488,GLU489,ARG490,ARG492,TYR497;CDK2/Cyclin A:THR165,TRP167,ASP206,SER207,ASP210,PHE213).结论:该结果为今后深入研究CDC25B通路和发挥协同刺激作用的信号体系以及基于该信号途径新型分子靶向药物的设计提供了理论基础.
关键词： CDC25B CDK2/Cyclin A 蛋白-蛋白对接 关键氨基酸 -
膀胱不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义
目的 探讨膀胱癌不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义.方法 采用蛋白印迹法检测CDC25B蛋白在膀胱永生化细胞SV-HUC-1细胞系和膀胱癌BIU-87和T24细胞系中的表达.结果 T24细胞中CDC25B蛋白表达水平高于BIU-87细胞和SV-HUC-1细胞系中的表达水平(P<0.05);且BIU-87细胞中CDC25B蛋白表达水平高于SV-HUC-1细胞中的表达水平(P<0.05).结论 CDC25B可能成为评价肿瘤恶性程度的新指标.
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小鼠Cdc25B融合蛋白构建和表达
目的 研究小鼠N末端缺失286氨基酸的野生型Cdc25B原核表达载体的构建和表达.方法 应用Primer5.0软件分析并设计小鼠Cdc25B5'及3'端引物(N末端缺失286氨基酶),化学合成并用聚合酶链反就(PCR)方法扩增,经限制性内切酶酶切后连接原核表达载体PGEX4T-2,构建成PGEX4T-2-Cdc25B融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21后,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导进行目的蛋白表达.结果 通过双酶切、电泳分析及测序证明成功构建了Cdc25B融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹(Western blot)显示,相对分子量为53KD的蛋白谱带,与预期一致.结论 成功构建并表达了Cdc25B-N末端缺失的基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为近一步研究Cdc25B的功能提供基础依据.
关键词： CDC25B 基因表达 谷胱甘肽转移酶(GST) 聚合酶链式反应 -
小鼠截短型CDC25B蛋白PKA体外磷酸化分析
目的 通过体外磷酸化研究和放射自显影技术证实小鼠CDC25B蛋白是蛋白激酶A(PKA)的直接作用底物.方法 构建小鼠截短型pGEx-4T-2-CDC25B201原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化CDC25B蛋白,与PKA进行体外磷酸化反应,分别采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印迹(western blot)和放射自显影鉴定CDC25B是否为PKA直接磷酸化底物.结果 在E.coli BL21细胞内,采用0.1 mmol/L的IPTG在27℃条件下诱导表达3h即可达到较高表达水平；SDS-PAGE显示在约50kD处有明显GST-CDC25B201融合蛋白特异条带；放射自显影显示GST-CDC25B201融合蛋白的磷酸化条带大约位于55 kD处；Western blot分析,在重组质粒表达的总蛋白、载体表达的GST蛋白、纯化蛋白及磷酸化蛋白的相应位置均出现GST抗体的杂交条带.结论 小鼠CDC25B蛋白是PKA的直接作用底物.
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149位丝氨酸对cdc25b蛋白在小鼠卵母细胞中定位的影响
目的:探讨149位丝氨酸使cdc25b蛋白诱导减数分裂功能丧失的机制.方法:应用免疫荧光观察GV期、G2/M转换期卵母细胞中cdc25b蛋白的定位情况;应用显微注射将pEGFP-cdc25b-wt、pEGFP-cdc25b-s149a的融合质粒及空载体质粒显微注射到含有完整生发泡的小鼠卵母细胞中,观察不同显微注射组小鼠卵母细胞中蛋白亚细胞定位.结果:免疫组化结果显示GV期卵母细胞中cdc25b蛋白主要分布在细胞浆中,这与显微注射野生型cdc25b结果一致,G2/M转换期卵母细胞中可以观察到蛋白的核聚集,cdc25b-s149a在细胞核与细胞浆中均有分布.结论:看似静止的卵母细胞中cdc25b蛋白处于核浆穿梭的动态平衡,149位丝氨酸的磷酸化影响蛋白的核输出速率,从而使蛋白的定位发生改变.
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CyclinD1、细胞分裂周期蛋白C25B与胃癌的相关性
目的 研究细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞分裂周期蛋白(CDC)25B与胃癌的相关性.方法 收集胃癌及对应正常胃黏膜标本各42例,应用Western印迹及RT-PCR方法检测CyclinD1,CDC25B在各组的表达情况,并结合临床资料进行分析.结果 CyclinD1,CDC25B mRNA及蛋白在正常胃黏膜组织中的相对表达量均显著低于胃癌组织(P<0.05),且其表达在淋巴结转移阳性组均显著增高(P<0.05).结论 CyclinD1,CDC25B在胃癌中高表达,可能与胃癌的发生、发展及浸润转移有关.
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14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响
目的:探讨14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25 B定位的影响,为阐明14-3-3ε蛋白对小鼠卵母细胞发育的调控机制奠定基础.方法:采用超排卵方法获得3周龄昆明系雌性小白鼠生发泡(GV)期卵母细胞分为未注射组、control siRNA注射组和14-3-3εsiRNA注射组.构建pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε表达载体.间接免疫荧光技术检测14-3-3ε蛋白和Cdc25 B在小鼠卵母细胞中的定位;直接免疫荧光技术观测14-3-3ε蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsiRNA注射入GV期卵母细胞中,相差显微镜下观测卵母细胞的形态表现,计算卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)发生率;Western blotting法检测卵母细胞中14-3-3ε蛋白的表达和Cdc2-pTyr15蛋白的相对表达水平;放射自显影检测卵母细胞中成熟促进因子(MPF)的活性.结果:间接和直接免疫荧光实验,野生型Cdc25 B能与14-3-3ε蛋白共定位于细胞质;在GVBD前期,Cdc25B由胞浆穿梭进入细胞核.当Cdc25B蛋白的第321位丝氨酸突变为丙氨酸时,14-3-3ε蛋白的表达水平降低,Cdc25B的胞浆定位被取消.未注射组、control siRNA注射组卵母细胞在显微注射24 h后均未发生GVBD,GVBD发生率组间比较差异无统计学意义(P>0.05);14-3-3εsiRNA注射组在显微注射后22和24 h卵母细胞的GVBD发生率均高于未注射组和control siRNA注射组(P<0.01),显微注射后24 h卵母细胞到达第2次减数分裂中期(MII)的比例高于未注射组和control siRNA注射组(P<0.01).结论:在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中,Cdc25B的Ser321位点可能是14-3-3ε蛋白调控Cdc25B细胞内定位的具体作用位点.
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白血病抑制因子受体gp190细胞内区与HL-60细胞内Cdc25B激活的关系
目的:观察白血病抑制因子(LIF)受体gp190亚基完整的细胞内区和gp190胞内区C末端片段在人白血病细胞系HL 60中与细胞周期调控因子Cdc25B表达和激活的关系,进一步了解LIF引发白血病细胞增殖抑制和分化的机制.方法:用基因重组技术将gp130的细胞内区换成gp190的细胞内区,用PCR技术扩增合成gp190细胞内区C末端的一个多肽,构成嵌合体受体基因130/190及1 90CT片段,并分别在HL-60细胞表达.用免疫组化和Western印迹方法,分析在LIF的诱导下,细胞生长和形态与Cdc25B表达的关系.结果:转染pcDNA3.0 130/190的HL-60细胞Cdc25B的表达量降低,细胞数量减少,细胞体积增大;转染pcDNA3.0 190末端的HL-60细胞Cdc25B的表达量增高,细胞表现为增殖,细胞体积普遍减小.结论:Cdc25B表达量降低与LIF诱导引发的白血病细胞HL-60增殖抑制有关,上述效应是由gp190亚基细胞内区介导的,而gp190 C末端片段可干扰LIFα受体介导的信号转导效应.
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DNMT1在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖和迁移的影响
目的 探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响及可能机制.方法 采用实时定量PCR技术检测60例胃癌患者癌组织及癌旁组织中DNM T1的mRNA水平.利用慢病毒包装建立稳定表达DNMT1-shRNA的MKN45、SGC7901 、MKN28细胞系,同时设未处理的未转染组、加入慢病毒阴性对照的阴性对照组.CCK8法检测各组细胞的增殖情况,Western blotting检测CDC25B的表达水平,Transwell实验检测DNMT1对胃癌细胞迁移能力的影响.结果 52例(86.7％,52/60)患者的胃癌组织中DNMT1的mRNA水平较癌旁组织上调,其中17例(28.3％,17/60)上调2倍以上;有淋巴结转移、有癌旁血管浸润及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者其转录水平明显上调(P＜0 05).转染DNMT1-shRNA后3d,MKN45、SGC7901以及MKN28细胞生长明显受抑,转染组的3株细胞吸光度值均明显低于未转染组及阴性对照组(P=0.000).转染组CDC25B蛋白表达降低,迁移力下降(均P＜0.05).结论 DNMT1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织,其具有促进胃癌细胞增殖和远处转移的作用,DNMT1可能通过调控CDC25B来发挥致癌作用.
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CDC25B3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.方法 合成CDC25B3基因RNAi有效靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与双酶切后的pGCL-GFP载体(含有U6启动子和GFP基因)连接产生LV-shCDC25B3慢病毒载体,挑选阳性克隆经PCR和测序鉴定.用脂质体转染法将LV-shCDC25B3、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功地构建了CDC25B3 shRNA的慢病毒载体LV-shCDC25B3.浓缩病毒悬液的滴度为1×108TU/ml.结论 成功构建人CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.
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CDC25B在乳腺癌中的表达及其临床意义
[目的]评价细胞分裂周期蛋白25B(CDC25B)在乳腺癌中的表达及意义.[方法]2004年1月至2005年12月经病理证实的女性原发性浸润性乳腺癌111例,采用免疫组化方法检测CDC25B表达情况.[结果]CDC258高表达47例,占42.3%(47/111).CDC25B高表达组中腋淋巴结阳性26例,占55.3%(26/47);低表达组中腋淋巴结阳性23例,占35.9%(23/64),两组间淋巴结转移率差异有统计学意义(P=0.042).CDC25B高表达组与低表达组的5年生存率分别为80.9%和92.2%(Log-Rank X2=4.384,P=0.036).[结论]乳腺癌组织中CDC25B高表达可能与乳腺癌的发生、发展及转移有关.
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细胞分裂周期蛋白25B在乳腺癌中的表达及与预后的关系
目的 测定细胞分裂周期蛋白25B (CDC25B)在乳腺癌组织中的表达情况,探讨其与乳腺癌预后的关系.方法 应用免疫组织化学法测定111例乳腺癌组织中CDC25B的表达情况,结合随访资料,回顾性分析CDC25B的表达和预后间的关系.结果 CDC25B在乳腺癌组织中的高表达率为42.3％ (47/111),其高表达患者的腋淋巴结转移率显著高于低表达患者(P=0.042),且高表达患者总生存率显著低于低表达患者(P=0.036)；CDC25B的表达与肿瘤的大小、TNM分期关系不大(P＞0.05).结论 乳腺癌组织中CDC25B存在异常高表达,其可能与乳腺癌的发生、淋巴转移及预后有关,有望成为乳腺癌预后的重要参考指标.
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胃癌组织中Cyclin D1、CDC25B和p27的表达及其临床意义
目的 探讨Cyclin D1、CDC25B和p27表达与胃腺癌发生、发展及预后的关系.方法 应用免疫组化及Western blot法检测42例胃腺癌组织及相应正常胃黏膜组织中Cyclin D1、CDC25B和p27的表达,分析三者表达与临床病理学特征的关系及相关性.结果 Cyclin D1在正常胃黏膜及胃腺癌组织中表达差异无统计学意义(P＞0.05);CDC25B在胃腺癌组织中的表达明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);p27在胃腺癌组织中的表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05),Cyclin D1及CDC25B在胃癌组织的表达与淋巴结转移相关,p27在胃癌组织的表达与组织学分级、浸润深度及淋巴结转移相关,Cyclin D1、CDC25B在胃癌组织中表达呈正相关(r=0.392,P＜0.05),Cyclin D1与p27表达差异无显著相关性(r=-0.062,P＞0.05).结论 联合检测Cyclin D1、CDC25B和p27表达有望作为评估胃癌生物学行为和预后的新参考指标.
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卵巢癌组织中CDK1和CDC25B的表达
目的:探讨细胞周期调控因子CDK1和CDC25B在卵巢癌发生发展中的作用.方法:应用免疫组织化学SP法检测20例正常卵巢组织、20例卵巢良性和76例恶性肿瘤组织中CDK1和CDC25B的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系.结果:①CDK1和CDC25B在卵巢癌中的阳性表达率分别为86.8%和57.9%,高于正常卵巢和良性肿瘤组织(P<0.05).②CDK1的表达与卵巢癌的分化程度、组织学类型、临床分期、患病年龄及有无淋巴结转移无关(P>0.05);CDC25B的表达与卵巢癌的临床分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05),与卵巢癌的分化程度、组织学类型和患病年龄无关(P>0.05).③CDK1和CDC25B在卵巢癌中的联合表达阳性率为56.6%,2者成正相关(r=0.378,P<0.05).结论:CDK1和CDC25B可能与卵巢癌的发生发展及其浸润、转移有关;CDK1和CDC25B在卵巢癌的发生发展中可能具有某种协同作用.
关键词： 细胞周期蛋白依赖性激酶1 CDC25B 卵巢癌 -
CDC25 B与14-3-3相互作用的研究
有研究表明在肿瘤发生发展的过程中，癌细胞的有丝分裂失控是肿瘤发生的主要原因。因此，对细胞分裂调控机制的研究成为目前研究的热点。其中细胞分裂周期25 B （ cell division cycle 25 B， CDC25B）和14-3-3是与细胞分裂有着密切关系的调控子。目前研究已经发现PKA／CDC25B／MPF （ CDC2-cyclinB1）和PKA／CDC25B／14-3-3／MPF是调控细胞有丝分裂的两条重要信号转导途径。蛋白激酶A （ pro-tein kinase A， PKA）是一种环磷酸腺苷（ cyclic adenosine monophosphate， cAMP）依赖性蛋白激酶，可以通过磷酸化下游的靶蛋白，抑制靶蛋白正常发挥作用，从而发挥调节作用。实验研究发现， PKA可以通过磷酸化CDC25B某些位点的丝氨酸残基，使CDC25B处于磷酸化状态，不能使成熟促进因子（ maturation pro-moting factor， MPF）的催化亚基细胞分裂周期2蛋白（cell division cycle 2， CDC2）第15位酪氨酸脱磷酸，因而不能激活MPF，使细胞分裂发生阻滞，不能发生G2／M的转化。14-3-3可以通过CDC25B／14-3-3／MPF途径调节有丝分裂，14-3-3通过结合已经发生磷酸化的CDC25 B的氨基酸（丝氨酸或者苏氨酸）残基，阻止CDC25B进入细胞核，从而引起细胞分裂的阻滞畅这样也就提示可以将14-3-3作为靶位点进行靶向治疗，治疗肿瘤疾病。
