首页 > 文献资料
-
粒细胞集落刺激因子保护急性损伤人胎肝细胞的实验研究
目的 建立D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)对人胎肝细胞急性损伤的模型,观察粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)对人胎肝细胞损伤的保护作用.方法分别用梯度浓度的D-GalN和不同的作用时间孵育人胎肝细胞,用四唑盐比色法(MTT法)检测细胞活性,以确定佳的人胎肝细胞急性损伤造模条件.将胎肝细胞分为4组进行不同处理:第1组为空白对照组,第2组(G组)用G-CSF处理正常细胞,第3组(ND组)和第4组(GD组)都用D-GalN进行损伤造模,但GD组加入G-CSF作为治疗,第3组加入等量的0.9%氯化钠溶液作为实验对照.后用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测各组细胞活性.结果当D-GalN浓度为10 mg/ml,作用时间为12 h时,可以杀伤90%以上的人胎肝细胞,并且可以保证有足够的药物反应时间.空白对照组和G组的细胞活性差异无统计学差异,但GD组细胞活性明显高于ND组(P<0.05).结论D-GalN对人胎肝细胞急性损伤的造模条件为D-GalN 10 mg/ml作用12 h.G-CSF对D-GalN造成的人胎肝细胞急性损伤具有保护作用.
-
纤维结合素对HBV感染原代培养人胎肝细胞的影响
目的研究纤维结合素对HBV体外感染原代培养人胎肝细胞的影响.方法用纤维结合素包被培养皿,利用从HBV阳性血清纯化的HBV病毒颗粒感染体外培养的人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中HBcAg,荧光定量PCR法检测细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中 cccDNA,并和未包被的胎肝细胞进行对照.结果未包被时上清中HBsAg和HBeAg于第5日出现阳性,包被后自第1日起出现阳性;未包被时胎肝细胞核中HBcAg于感染后第2日起出现阳性,阳性率为10%～15%,包被后自第1日起出现阳性,阳性率达90%以上;未包被时细胞中HBV DNA定量自第4日起检出,包被后自第1日起检出;未包被时细胞中HBV cccDNA自第8日出现阳性,包被后自第2日起出现阳性.结论纤维结合素包被可以促进HBV体外感染原代培养人胎肝细胞,使HBV感染胎肝细胞的时间提前,感染细胞的数量增加.
-
威佳-促肝细胞生长素注射液治疗重型病毒性肝炎的临床观察
重型肝炎来势凶险,病情复杂,病死率极高,近10 a来国内从人胎肝细胞输注疗法进一步发展起来的促肝细胞生长因子疗法已广泛应用于临床综合治疗重型肝炎并取得了一定疗效,总结自2000年以来应用山东威海赛洛金药业有限公司生产的威佳-促肝细胞生长素治疗重型肝炎的临床观察,总结如下:
-
人胎肝细胞治疗慢性活动性肝炎的疗效初步观察
经活检证实的慢性活动性肝炎(CAH)26例,等分成两组,甲组静脉输注胎肝细胞(FLC)悬液治疗共25次,每例1～4次,每次输入有核细胞数为1.1～5.4×l09个;乙组用转移因子(TF)4mg肌注或局部淋巴结旁注射,每周2次,疗程为3～18周.结果表明,两组ALT复常时间分别平均为62.3天及113.4天(P<0.05);抗-HBs转阳率为7/13及2/13例P<0.05);3个月的近期治愈率为86.4%与38.5%(P<0.025),平均住院日为74.2及115天(P<0.05).初步表明FLC输注疗效明显优于转移因子.
-
人胎肝细胞输注治疗慢性活动性肝炎疗效初步观察
本文应用人胎肝细胞输注治疗8例慢性活动性肝炎(慢活肝),对临床疗效与病理变化进行了观察,现报告如下.
-
HCV体内感染裸鼠模型的建立
目的:探讨利用裸鼠建立感染丙型肝炎病毒(HCV)体内动物模型的可能性.方法:将体外感染了HCV的人胎肝细胞(HFH)移植到裸鼠脾脏.移植术后3个月,取脾作病理学检查,以评估感染了HCV的HFH是否还存活.并且通过透射电镜检查,以评估移植入裸鼠脾脏的HFH胞浆中是否仍有HCV.同时,取裸鼠的外周血液作液相RT-PCR检查,以明确外周血液中HCVRNA是否为阳性.结果:移植术后3个月,移植入裸鼠脾脏内的HFH依然存活,经检查移植入裸鼠脾脏中的HFH胞浆内仍然存在HCV样颗粒.然而,体内有HCV感染的裸鼠外周血液仅70%HCV RNA为阳性.结论:裸鼠可作为"活试管",支持体外感染了HCV的HFH在其脾脏内较长期生存.但仅使用外周血液HCV RNA检查这一个指标来判断裸鼠体内是否有HCV感染是不够的.
-
人胎肝细胞体外感染HCV的定性研究
目的:通过定性研究探讨人胎肝细胞在体外与丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清共培养24h是否能感染HCV.方法:人胎肝细胞在体外与HCV阳性血清共培养24h后,采用原位RT-PCR技术对其进行HCV定性检测.结果:通过原位RT-PCR技术检测,发现人胎肝细胞内HCV正、负链RNA均为阳性.此外,将人胎肝细胞在体外与HCV阳性血清共培养24h并经多次洗涤后继续培养的上清液加入到新鲜分离的正常人胎肝细胞培养基中培养,可以得到上述相同的结果.结论:人胎肝细胞在体外培养情况下可以感染HCV,并支持HCV在其内复制,产生具有传染性的HCV颗粒分泌到培养液中.
关键词： 人胎肝细胞 体外培养 丙型肝炎病毒 原位逆转录聚合酶链反应 -
氟对人胎肝细胞细胞周期、凋亡及p53表达的影响
目的研究氟对人胎肝细胞(L-02细胞)细胞周期、凋亡及p53表达的影响.方法体外培养的人胎肝细胞接触40、80、160 μg/ml氟化钠24 h后,MTT法检测L-02细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率和周期构成比,Western blot检测P53蛋白的表达水平.结果高剂量氟染毒组细胞存活率显著低于对照组(P＜0.01);各染氟组S期细胞数与对照组相比均明显增多(P＜0.01),中、高剂量氟染毒组细胞凋亡率和p53蛋白表达量均显著高于对照组(P＜0.01).结论氟可使L-02细胞S期细胞数增多,诱导人胎肝细胞凋亡和p53表达,并呈剂量-效应关系.
-
人胎肝细胞体外感染丙型肝炎病毒的定位研究
为了证实人胎肝细胞在体外与丙型肝炎病毒（HCV）阳性血清共培养24 h是否能感染HCV病毒而作定位研究。采用透射电镜、免疫电镜的手段对于HCV阳性血清共培养的人胎肝细胞中病毒样颗粒进行定位研究，以测定细胞内是否有HCV。结果发现在透视电镜下人胎肝细胞胞浆中有很多病毒样颗粒，直径约45 nm。通过免疫电镜进一步证实在人胎肝细胞中这些病毒样颗粒含有HCV基因表达产物NS3及NS5。此外，人胎肝细胞在体外与HCV阳性血清共培养24 h并经多次洗涤后的培养上清加入到新鲜分离的正常人胎肝细胞培养基中继续培养，可以得出上述相同的结果。这些结果表明人胎肝细胞在体外培养情况下可以感染HCV，并且感染了HCV的人胎肝细胞可以产生具有传染性的HCV颗粒分泌到培养液中。
-
人端粒酶逆转录酶转染人胎肝细胞生物学特性
目的 探讨端粒酶逆转录酶基因转染人胎肝细胞以获得永生化肝细胞的可行性.方法 四步灌流法分离人胎肝细胞,携端粒酶逆转录酶基因载体转染人胎肝细胞,光学显微镜观察转染细胞形态变化及增殖能力.免疫组织化学和流式细胞技术检测转染细胞白蛋白表达情况,同时鉴定转染细胞是否具有糖原合成、尿素氮合成等肝细胞功能.结果 端粒酶逆转录酶基因转染人胎肝细胞可以重建人胎肝细胞的端粒活性.转染细胞培养5 d时呈集落样生长,12 d时增殖融合成片状,且具有表达肝脏特异性蛋白、白蛋白和具备糖原合成、尿素氮合成等肝细胞功能.结论 采用端粒酶逆转录酶基因转染人胎肝细胞技术有望获得永生化肝细胞.这可能为细胞移植和生物人工肝治疗各种难治性肝病提供新的细胞来源.
-
苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究
目的 观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响.方法 改良肝细胞获取方法分离人胎肝细胞,经过1 h预培养后.将5种不同浓度(1×107,2.5×107,5×107,7.5×107,10×107·mL-1)的胎肝细胞以6 mg/L苦参碱+5%DMSO为冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月.1个月后复苏,进行活率、形态学及功能检测.结果 5种不同浓度的细胞冻存1个月后,细胞浓度为2.5×107·mL-1组复苏后存活率与其余四组相比差异有显著性(P<0.05),且明显高于其余四组.复苏后细胞存活率和24 h贴壁率分别为73%,69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复.结论 (1)苦参碱对低温冻存的人胎肝细胞有保护作用,与二甲基亚砜联用可降低DMSO的浓度;(2)以5%DMSO+6 mg/L苦参碱作为冻存保护刑,细胞浓度在2.5×107·mL-1冻存效果佳.该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求.
-
苦参碱对于人肝细胞冻存保护效应的实验性研究
目的:了解苦参碱对人肝细胞液氮冻存复苏后功能的影响,探索一种改善人肝细胞冻存的新方法.方法:将胎肝细胞及常规培养的L-02人肝细胞系分别以5种不同冻存保护体系[10%二甲亚砜(DMSO)、5%DMSO+0.2 mg/L苦参碱、5%DMSO+2 mg/L苦参碱、5%DMSO+6 mg/L苦参碱、5%DMSO+10mg/L苦参碱]在液氮中冷冻保存1个月.1个月后快速复苏,进行存活率、形态学及功能检测.结果:不同冻存保护体系保存的人肝细胞存活率、形态学及功能表现均有所不同.其中5%DMSO+6 mg/L苦参碱组效果好,复苏后细胞存活率、24h贴壁率及细胞功能检测优于其他冻存液组.结论:(1)苦参碱对人肝细胞液氮冻存有保护作用,6 mg/L苦参碱是好的浓度;(2)苦参碱与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用.
-
人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究
目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同，探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后，用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的第2～3天，即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66 d，HCV在人胎肝细胞中的复制持续25 d）；HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达，感染细胞内存在HCV负链 RNA杂交信号，且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感，尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制，可用于HCV体外长期培养的靶细胞。
-
HDV/HBV体外感染原代培养人胎肝细胞的实验研究
目的:建立HDV/HBV感染人胎肝细胞体外培养系统.方法:利用HDV/HBV阳性血清同时感染体外培养的人胎肝细胞;应用ELISA、免疫组化法、原位杂交法和斑点法检测上清液和细胞中HBsAg、HDAg、HBV DNA和HDV cDNA.结果:上清液和细胞中HBsAg、HDAg、HBV DNA和HDV cDNA在感染后第2天至第16天均可测出,其中上清液中HBsAg、HDAg以感染后第4天至第12天达高峰.结论:HDV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达12 d.
-
HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究
目的通过HBV体外感染22周龄原代培养人胎肝细胞,比较常用检测指标的敏感性和特异性.方法利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中cccDNA.结果胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2天出现阳性,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第4天起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6天出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9天出现阳性.结论HBV在原代培养人22周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达,各种检测指标的灵敏性和特异性不一,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好,特异性可.
-
硫代反义寡核苷酸体外对HDV的抑制作用
目的观察硫代反义寡核苷酸(S-ASODN)体外对HDV的抑制作用.方法在HDV/HBV感染人胎肝细胞中加入不同浓度的针对HDV Stem Ⅰ区684～698位核苷酸的15聚S-ASODN,分别采用ELISA和斑点杂交法检测上清液中HDAg和细胞中HDV RNA.结果HBsAg、HDAg在感染后第2d至第16d均可测出,以第4d至第12d达高峰.加入S-ASODN(2、4、6μmol/L)后2d,肝细胞中HDV复制受到抑制,培养上清中HDAg分泌量也减少,其抑制率呈剂量依赖关系;在同等剂量时(4μmol/L),S-ASODN作用2d、4d、6d,对HDV抑制率大至相同.结论HDV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达12d;S-ASODN能有效抑制HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDV复制与表达.本研究为进一步在动物体内研究S-A-SODN抗HDV作用和向临床过渡提供了有益的实验依据.
