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靶向Skp2基因siRNA对大肠癌细胞生物学特性的影响
目的:设计和构建Skp2特异性的siRNA真核表达载体,观察Skp2siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.方法:人工合成Skp2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo,通过测序鉴定.用脂质体介导的基因转染方法转入HCT116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系,半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达.流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:测序表明Skp2干扰序列完全正确.RTPCR结果显示2条Skp2siRNA真核表达质粒均能有效抑制核干细胞因子mRNA的转录表达( P<0.05).MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降(29.21%±1.40%,30.10%±1.50% vs49.05%±4.50%,53.03%±4.92%,均P<0.05).流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多,即表现为G1期阻滞,S期细胞的比例降低.结论:成功构建了S k p 2 干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞Skp2mRNA表达,细胞增殖能力减弱,为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据.
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Skp2基因沉默对子宫内膜癌HEC-1A细胞p27蛋白表达及细胞增殖的影响
RNA干扰(RNAi)是一项新的使基因表达阻断的技术,一种广泛使体外基因失活或沉默的方法,是在转录水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具,不仪可用于研究基因功能,同时也为基因治疗提供了一个新的重要技术.
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Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及SP1和p27蛋白表达的影响
目的 研究Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及p27和SP1蛋白表达的影响.方法 构建Skp2基因干扰慢病毒质粒,包装后感染HepG2细胞.48 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；侵袭小室试验检测细胞侵袭能力；Western blot检测Skp2基因下调后p27和SP1蛋白的表达情况.结果 与正常HepG2细胞组相比,Skp2干扰慢病毒组细胞Skp2蛋白的表达明显下调,p27蛋白表达大幅增加,细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加近两倍,G0/G1期细胞增多；SP1蛋白表达减少,浸润、迁移的细胞数减少约50％(P＜0.05).结论 Skp2蛋白表达下调抑制了HepG2细胞的增殖,促进HepG2细胞的凋亡,造成细胞侵袭能力减弱.Skp2蛋白表达下调导致p27蛋白表达上调、SP1蛋白表达下调,在上述生物学特性变化中可能发挥了重要作用,为深入探讨肝癌的病理机制奠定了基础.
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shRNA干扰对肺癌细胞内Skp2和p27水平及其生长的影响
目的:探讨干扰肺腺癌SPC-A-1细胞中Skp2 (S-phase kinase associated protein, Skp 2)基因的发夹结构RNA (small hairpin RNA, shRNA)对肺癌细胞Skp2和p27基因表达的影响及对细胞生长的影响.方法:设计、合成特异性的shRNA序列并与pGenesil-1质粒载体连接转染SPC-A-1细胞,经过稳定筛选后的肺癌细胞,通过RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞内Skp2、p27mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线.结果:在转染干扰RNA后SPC-A-1细胞内的Skp2mRNA及蛋白表达下降明显,而p27蛋白水平却明显上升,这与抑制了Skp2表达导致p27降解减少有关.生长曲线表明细胞生长受到了抑制.结论:成功构建了针对Skp2基因的shRNA真核表达载体,能有效抑制肺癌细胞生长,并使得skp2基因表达下降,p27基因的表达增多,为肺癌细胞的基因治疗提供了实验依据.
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荧光定量PCR技术检测喉鳞状细胞癌标本中Skp2基因表达
目的:探讨细胞S相激酶相关蛋白(Skp2)基因在喉鳞状细胞癌发生、发展中的作用.方法:应用荧光定量逆转录PCR(FQ-PCR)技术检测40例喉鳞状细胞癌及10例癌旁正常组织中Skp2 mRNA拷贝数,并分析其与临床相关因素的关系.结果:40例喉鳞状细胞癌Skp2 mRNA中位拷贝数为6 622.54 copy/μg RNA,10例癌旁正常组织为0 copy/μg RNA,两组差异有统计学意义(P<0.01);喉鳞状细胞癌和癌旁正常组织Skp2mRNA阳性表达率分别为50%和0,差异有统计学意义(P<0.01).喉鳞状细胞癌中颈淋巴结转移组Skp2mRNA中位拷贝数为617 138.4 copy/μg RNA,颈淋巴结无转移组为0 copy/μg RNA,两组差异有统计学意义(P<0.05);喉鳞状细胞癌中颈淋巴结转移组和颈淋巴结无转移组Skp2 mRNA阳性表达率分别为100.00%和35.48%,差异有统计学意义(P<0.01).结论:Skp2基因可能与喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移有关,FQ-PCR为一精确检测喉鳞状细胞癌Skp2 mRNA表达的方法,Skp2 mRNA表达水平可能成为预测喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移的更加灵敏的指标.
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Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响
目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.
