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应用SELDI-TOF-MS技术分析SEB染毒小鼠血清蛋白质组学变化
目的:把蛋白质芯片和SELDI质谱技术应用于金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalenterotoxin B,SEB)染毒小鼠血清蛋白质组研究,分析染毒小鼠血清蛋白质组的变化.方法:采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术和弱阳离子交换蛋白质芯片检测染毒小鼠血清蛋白质的变化,使用PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机读取数据,获得的结果采用Ciphergen公司的Biomarker wizard和Biomarker Patterns System软件进行分析.结果:实验组与对照组血清蛋白质谱相比有11个蛋白质有显著差异,其中8个蛋白质表达上调,3个表达下调.结论:SEB染毒小鼠血清蛋白质组发生显著变化,可能与SEB的毒理学与病理学作用有密切关系.
关键词： SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片 SEB 标志蛋白 -
不鼻息肉中金葡菌及其毒素B测定临床意义
目的 探索鼻息肉形成与金葡菌感染之间的关系.方法 选择鼻息肉病人和对照组病人各50例作为研究对象.分别于每位患者后鼻腔取分泌物做细茵培养,同时采血血清ELISA法测定金葡菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB).结果 (1)50例鼻息内标本中有21例于分泌物中培养出金葡菌菌落,50例对照组标本中有8例培养出金葡菌菌落.经χ2检验检出率不同有统计学意义.(2)以30例鼻息肉和30例肥厚性鼻炎病人进行SEB抗体(EMSA法)滴度测定,前者平均值高于后者.经两独立样本的t检验证明2组SEB抗体滴度的差异有统计学意义.结论 结果显示鼻息肉的形成与金葡菌的感染可能有一定关系.
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超抗原葡萄球菌肠毒素B诱导IgA肾病小鼠模型的建立
目的 建立IgA肾病小鼠模型,并观察模型的生化及病理指标特点.方法 12只BALB/c小鼠随机分为正常组(6只)和模型组(6只),模型组单次尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B(SEB)0.8 mg/kg,第二周开始,连续注射三周,第四周结束后检测小鼠24 h尿蛋白定量,尿微量白蛋白,肾功能BUN、Scr、UA;蛋白指标TP、ALB;肝功能ALT、AST、ALP;血脂TC、TG、LDL的情况,肾脏免疫荧光IgA的沉积,肾脏病理HE、PAS、PASM、Masson染色以及透射电镜的观察肾脏超微结构,以及肝脏与小肠HE染色、免疫荧光IgA的沉积变化.结果 与正常组比较,模型组小鼠24 h尿蛋白定量与尿微量白蛋白均升高(P<0.01);模型组小鼠肾功能指标CREA,UA均高于正常组(P<0.05),BUN差异无显著性;模型组小鼠蛋白指标TP、ALB差异无显著性;模型组小鼠肝功能指标AST水平高于正常组(P<0.05),ALT、ALP差异无显著性;模型组小鼠血脂TG水平低于正常组(P<0.05),LDL水平高于正常组(P<0.01),TC差异无显著性.肾脏免疫荧光检查可见模型组小鼠肾小球系膜区呈颗粒状、团块状的IgA沉积;模型组小鼠肾脏病理轻中度损伤,系膜区免疫复合物增多;模型组小鼠肝脏HE染色可见少量炎性细胞浸润伴有部分肝细胞坏死,小肠绒毛缺损,肠绒毛变短变细、间距明显增宽,有部分分上皮脱落,中央央乳糜管扩张显著,淋巴细胞增多,明显可见炎性细胞浸润.结论 使用超抗原SEB尾静脉注射小鼠可以成功复制IgA肾病动物模型.
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超抗原葡萄球菌肠毒素B诱导自然杀伤细胞杀伤肿瘤效应的体外实验研究
①目的探讨SEB对NK细胞杀瘤活性的影响.②方法采用补体裂解法分离富集NK细胞,分别用10-9g/ml、10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/ml浓度的SEB作用NK细胞,分别于12、24、36、48h后测定NK细胞对K562细胞的杀伤活性.③结果SEB处理NK细胞12h后杀瘤活性增强,至24h杀瘤活性佳;且在一定浓度范围内NK细胞的杀瘤活性随SEB浓度的升高而增强.④结论超抗原SEB在体外能够增强NK细胞的杀瘤活性.
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单克隆抗体亲和层析法纯化SEB及其活性鉴定
目的:采用亲和层析法获取高纯度的金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB),并对其进行活性分析.方法:采用正辛酸沉淀法纯化了一株抗SEB的单克隆抗体(1D2),与CNBr活化的Sepharose4B偶联制成亲和层析柱纯化SEB,并对其超抗原活性和抗原活性进行鉴定.结果:与离子交换纯化法和市售的标准品相比较,亲和层析法纯化的SEB纯度高,纯化的效率为60.71%.同时,纯化后的SEB具有良好的抗原性和超抗原活性.结论:单克隆抗体亲和层析法可以高效率地纯化高纯度的SEB.
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SEB诱导的正常人外周血T淋巴细胞的增殖
肠毒素B(SEB)是一种新型的蛋白质抗原分子,具有多种免疫学活性,是超抗原(superantigen,SAg)中的一种.本研究以正常人外周血T淋巴细胞为材料,用SEB刺激后,检查T淋巴细胞的增殖与活化,报道如下:
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用SELEX技术筛选葡萄球菌肠毒素B特异性适配体
目的 通过指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选能与葡萄球菌肠毒素B(SEB)特异、高素和力结合的单链DNA(ssDNA)适配体(aptamer).方法 体外构建一个长度为96个碱基的随机ssDNA文库,与靶物质SEB混合,以磁殊作为固相介质,利用热洗脱方法分离与靶标结合的核苷酸片段,通过PCR反复扩增、富集数个循环.利用荧光素标记适配体,测定筛选过程中各轮结合率;通过地高辛标记适配体,与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体进行酶促显色反应,检测适配体的特异性.结果 经过13轮筛选,ssDNA文库与SEB的结合百分率从1.1%提高到39.8%.制备的适配体针对SEB的特异性强,与葡萄球菌A蛋白(SPA)及牛血清清蛋白(BSA)无非特异性结合.结论 成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合SEB的高亲和力的ssDNA适配体,为金黄色葡萄球菌感染的诊断与治疗奠定了基础.
关键词： 指数富集的配体进化技术 SEB 适体 磁珠 -
超抗原SEB诱导人CTL细胞杀瘤条件优化
目的 通过正交设计优化CTL细胞佳杀瘤条件.方法 补体裂解法分离CTL细胞,MTT法测定CTL细胞杀瘤活性,正交设计选择CTL细胞佳杀瘤条件.结果 在SEB浓度为10-6g/ml,SEB作用CTL细胞时间为24h,CTL细胞与肿瘤细胞之比为20∶1情况下CTL细胞杀瘤活性强.结论 CTL细胞佳杀瘤条件组合为SEB10-6g/ml,作用时间24h,效靶比20∶1.
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金黄色葡萄球菌肠毒素B对皮肤组织中细胞表面分子表达的影响
目的:探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对体外培养皮肤组织中细胞表面分子ICAM-1(CD54)和B7-2(CD86)表达的影响.方法:分别将来自整形术9例胸部皮肤组织切成面积相同的小组织块,每人份等量分为实验组及对照组.实验组SEB适当浓度施于皮肤表面,对照组PBS同法处理皮肤组织,然后将皮肤组织培养24 h后快速组织切片,免疫组化(LSAB法)观察SEB刺激后皮肤组织中表皮角质形成细胞表面ICAM-1分子和郎格汉斯细胞表面B7-2分子的表达.结果:实验组表皮角质形成细胞表面分子ICAM-1和郎格汉斯细胞表面分子B7-2均表达显著高于对照组(P＜0.01,P＜0.05).结论:SEB可刺激体外培养皮肤组织的表皮细胞高表达ICAM-1分子和B7-2分子.
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超抗原SEB的免疫抑制作用及其机制的初步研究
目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素SEB作为超抗原的免疫抑制性作用及其可能机制.方法 BALB/c小鼠注射金黄色葡萄球菌B 型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B, SEB) ,分离其脾脏细胞,研究SEB刺激小鼠脾细胞产生的反应,并通过FCM检测脾细胞表面CD4和CD25分子的表达情况,探讨其内在机制.结果 FCM表明与生理盐水对照组相比,注射过SEB 后的BALB/c 小鼠的脾脏细胞中CD4和CD25双阳性细胞比例增加,提示SEB的免疫抑制作用可能和其诱导调节性T细胞有关.结论 SEB 可以在小鼠体内有效诱发具有抑制活性的调节性细胞,这可能是SEB在动物体内诱发免疫低反应的机制之一.
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细菌超抗原SEB抑制小鼠角质形成细胞糖皮质激素受体核转移的实验研究
目的 探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对小鼠角质形成细胞糖皮质激素受体GRα核转移的影响.方法 1％二硝基氯苯重复刺激Balb/c小鼠背部皮肤构建变应性接触性皮炎动物模型,分别用SEB、地塞米松、SEB+地塞米松处理该模型鼠背部局部皮肤,处理48h后HE染色计数真皮内炎性细胞数量,免疫荧光和Western blot法观察GRα在各组角质形成细胞的胞浆和核浆分布,ELISA法观察IL-2、4、13和TNF-α等炎症因子在各组的表达变化.结果 SEB处理后真皮内炎性细胞显著增加.地塞米松可显著减少炎性细胞数目,而SEB可部分拮抗地塞米松的抗炎作用;激光共聚焦显示正常角质形成细胞GRα主要存在于细胞浆,少量存在于胞核.地塞米松可显著增加GRα核/浆阳性比值,而SEB可显著减弱地塞米松诱导的GRα核/浆阳性比值;Western blot检测也显示地塞米松处理后GRα蛋白入核量显著增多,而SEB可显著抑制地塞米松诱导的GRα蛋白入核量,并增加GRα蛋白胞浆滞留;与正常组相比,皮炎组IL-2、4、13和TNF-α表达均显著升高,地塞米松可显著抑制各炎症因子增多,而SEB可显著拮抗地塞米松对炎性因子的抑制作用.结论 SEB在局部皮炎诱导的激素减敏与其抑制角质形成细胞GRα核转移障碍有关.
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超抗原SEB对角质形成细胞糖皮质激素受体的作用研究
目的 探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)糖皮质激素受体表达及核转移的影响.方法 采用不同浓度SEB作用于体外培养的HaCaT细胞,RT-PCR、Western blot分别检测HaCaT细胞糖皮质激素受体α、β(GRα、GRβ) mRNA、蛋白的表达;随后用SEB预处理HaCaT细胞,地塞米松再作用HaCaT细胞8h后,免疫荧光法检测HaCaT细胞GRα细胞内分布情况.结果 SEB作用HaCaT细胞后,其GRα mRNA、蛋白表达无明显变化,GRβ mRNA、蛋白表达随SEB的浓度增高呈上升趋势,且在SEB质量浓度为100 ng/ml时达到高值.10-6mol/L地塞米松作用8h后能够诱导HaCaT细胞GRα由胞浆向胞核转移,该效应能够维持到24 h.与地塞米松组HaCaT细胞内GRα分布出现向核内转移现象不同,地塞米松+SEB组部分细胞GRα分布仍局限于胞质,并未出现核转移现象.结论 SEB可能通过诱导角质形成细胞GRβ表达上调及抑制地塞米松诱导的GRα由胞浆向胞核转移参与炎症性皮肤病外用糖皮质激素抵抗.
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细菌超抗原SEB对皮炎局部糖皮质激素受体β表达的影响
目的 探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对于皮炎局部糖皮质激素受体β(GRβ)的影响.方法 1％ DNCB重复刺激Balb/c小鼠背部皮肤构建特应性皮炎动物模型,以未经处理的模型小鼠为对照组,并分别用SEB、SEB+地塞米松、地塞米松处理该动物模型.通过H&E染色观察组织病理变化,计数真皮内炎性细胞数量来反映不同处理组皮炎的变化情况,采用 qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法检测糖皮质激素受体β(GRβ)的mRNA和蛋白表达.结果 在利用DNCB构建的Balb/c小鼠特应性皮炎动物模型中,真皮内炎性细胞数量明显增加;与未经处理的皮炎组相比,SEB处理后炎性细胞显著增加,地塞米松处理后炎性细胞显著减少,但SEB可部分拮抗地塞米松的抗炎作用;此外,在SEB处理的皮炎组以及SEB+地塞米松处理的皮炎组,GRβmRNA和蛋白的表达均显著上调,但SEB单独处理的皮炎组GRβ mRNA和蛋白的表达上调情况更为显著.结论 细菌超抗原(SEB)在皮炎局部诱导了GRβ的表达升高,在外用糖皮质激素快速减敏过程中起到了重要的作用.
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耐受调节性CD8+NKT细胞体外稳定性的研究
目的:探讨超抗原SEB活化并扩增的CD8+NKT细胞耐受调节功能的稳定性.方法:超抗原SEB活化并体外扩增的10 d、20d、30 d和冻存效应细胞被用于本研究.以正常C57BL/J鼠脾细胞为对照,将各个效应细胞与刺激剂刀豆蛋白(ConA)或脂多糖(LPS)共同培养72 h,测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力.在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加各效应细胞,72 h后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激剂的应答反应能力.体外扩增和冻存的效应细胞与异源鼠脾细胞做混合淋巴细胞培养,MTT法测定细胞的增殖情况.效应细胞用荧光抗体染色,用流式细胞术(FCM)解析NKT细胞亚群.结果:与正常淋巴细胞对刺激剂的应答反应能力相比,体外扩增10 d、20 d、30 d和冻存效应细胞对ConA或LPS的应答反应能力明显降低,细胞增殖的A值分别由正常值0.67和0.61分别下降至0.30和0.31,0.28和0.20,0.26和0.24,以及0.22和0.23(P＜0.05,n=3).效应细胞抑制正常淋巴细胞对上述刺激剂ConA或LPS的应答反应,分别由正常值0.67和0.61下降至0.33和0.39,0.30和0.43,0.36和0.43,以及0.26和0.29(P＜0.05,n=3).效应细胞与异源鼠脾细胞反应与对照组相比明显的降低,分别由正常值0.70下降至20d的0.42,30 d的0.42以及冻存效应细胞的0.54(P＜0.05,n=3).在这群效应细胞中,主要是CD8+NKT细胞,由原始的0.36%增加到41.59%(P＜0.05,n=3).结论:耐受调节性CD8+NKT细胞可以在体外进行传代培养,并且这些传代培养细胞的耐受调节功能依然存在.
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超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究
目的:探讨超抗原SEB活化的效应细胞参与免疫耐受的NKT细胞亚群及分化特征.方法:采用C57BL/J小鼠脾细胞经SEB诱导, 收集体外扩增10 d的淋巴细胞为效应细胞, 与刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和白介素-2(IL-2)共同培养3 d, 测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力.在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加效应细胞, 3 d后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激原的应答反应能力.用MTT染色方法记录细胞增殖的A值.以ConA活化的淋巴细胞做参照, 用流式细胞术(FCM)解析了耐受性效应细胞中NKT细胞亚群并显示分化来源与功能的相关性.结果:与正常淋巴细胞对抗原应答反应能力相比, SEB活化的效应细胞对ConA、LPS和IL-2的应答反应能力明显降低, 细胞生长的A值从正常组的0.80±0.04、0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.60±0.05、0.30±0.05及0.27±0.04 (P＜0.01, n=3).效应细胞抑制正常淋巴细胞对上述抗原的应答反应, 尤其抑制ConA 活化的T淋巴细胞的应答反应;A值分别由正常值降低到0.26±0.002、0.48±0.04及0.34±0.02(P＜0.01, n=3).效应细胞中CD4+NK1.1+、CD8+NK1.1+、TcRVβ8+/NK1.1+NKT细胞亚群显著增加(P＜0.05和P＜0.01, n=4).ConA活化的淋巴细胞是T淋巴细胞并包括CD4-CD8-/CD3+ NK1.1+ NKT细胞.结论:超抗原SEB活化的耐受功能与CD4+NK1.1+、CD8+NK1.1+、TcRVβ8+NK1.1+NKT细胞亚群有关, 它们由T细胞分化而来. CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞没有参与耐受性调节.
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抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达
目的 从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达.方法 从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因；通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv).将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达.通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性.结果 测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白.间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性.结论 制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础.
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金黄色葡萄球菌肠毒素B研究进展
金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)是一种典型的T细胞性超抗原,可引起T细胞多克隆活化.本文综述了金黄色葡萄球菌SEB的结构功能,生物学效应,诊断及治疗方面的研究进展,并重点介绍了金黄色葡萄球菌SEB的临床应用.
