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法乐四联症患儿NKX2.5、TBX5、GATA4基因的表达研究
目的:探讨NKX2.5、TBX5、GATA4基因与法乐四联症的发病关系及法乐四联症形成的分子机制. 方法:10例法乐四联症患儿(法乐四联症组),为我院2005-06至2005-12心脏中心住院患儿.年龄4个月～8岁,平均3.5岁.6例非先天性心脏病(先心病)意外死亡患儿作为对照(对照组),均没有先心病病史和遗传病家族史.年龄4个月～9岁,平均年龄3.8岁.留取各病例右心室流出道心肌组织,提取心肌组织总RNA,逆转录为与RNA链互补的单链DNA(cDNA).按照引物设计原则进行引物设计,用来扩增心肌组织NKX2.5、TBX5、GATA4、GAPDH mRNA目的片段.引物长度18 bp～22 bp,扩增片段长度163 bp、206 bp、237bp、203 bp.应用双标准曲线、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法比较NKX2.5、TBX5、GATA4基因的mRNA含量在对照组和法乐四联症组之间的统计学差异. 结果:法乐四联症组的NKX2.5mRNA含量较对照组显著降低,差异有统计学意义.TBXSmRNA和GATA4mRNA含量在法乐四联症组与对照组的差异无统计学意义. 结论:人心肌组织中有心脏发育相关基因NKX2.5、TBX5和GATA4mRNA的表达;法乐四联症可能与心肌组织中NKX2.5mRNA含量降低相关.
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GATA4基因对心内膜垫发育中相关蛋白表达作用的实验研究
目的 研究GATA4基因在心内膜垫发育过程中的作用.方法 构建GATA4野生型和突变型真核表达载体,利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染Hela细胞,分为Hela组、HelaGATA4组、HelaH436Y组、HelaNull组,应用实时PCR和Western blot检测转录因子GATA4、Sox9和Scleraxis及细胞外基质Aggrecan、Tenascin的mRNA和蛋白相对表达水平变化.结果 HelaGATA4组、HelaH436Y组、HelaNull组和Hela组GATA4基因mRNA相对表达水平分别为310.83±2.39、146.35±1.74、0.94±0.32和1.00±0.28 (F =72.508,P＜0.05),且HelaGATA4组、HelaH436Y组均分别高于HelaNull组和Hela组(P均＜0.05),HelaH436Y组低于HelaGATA4组(P＜0.05);GATA4蛋白表达水平与mRNA变化一致.HelaGATA4组及Hela436Y组Sox9、Scleraxis、Aggrecan、Tenascin基因的mRNA和蛋白表达水平明显高于Hela组(P均＜0.05),但它们在HelaH436Y组的表达水平低于HelaGATA4组(P均＜0.05).结论 GATA4-H436Y突变使GATA4基因转录活性降低从而对下游基因的转录激活作用减弱,为阐明GATA4基因在心内膜垫发育成瓣膜中的作用提供了一定的理论基础.
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应用 TALEN 技术敲除 gata4基因建立斑马鱼先天性心脏病模型
目的：人工构建TALEN靶向敲除载体敲除gata4基因，建立斑马鱼先天性心脏病动物模型。方法采用单元组装法构建靶向敲除gata4基因的载体，将其体外转录成TALEN mRNAs，通过显微注射的方式注入单细胞期受精卵中，胚胎检测TALEN的敲除效率，再通过剪尾、酶切、测序筛选发生基因突变的斑马鱼及突变的类型。结果酶切、测序结果证实成功构建出正确的 gata4靶向敲除载体，注入斑马鱼受精卵中，发生基因敲除的效率为35．18％，通过剪尾、PCR、酶切检测成功地筛选出了发生基因突变的斑马鱼，测序结果显示出不同种类的gata4基因突变。结论成功构建gata4基因敲除的斑马鱼动物模型，为进一步研究人类gata4基因突变引起先天性心脏病的发病机制提供了良好的动物模型。
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先天性心脏病GATA4基因突变研究进展
GATA4基因突变在先天性心脏病患儿中较为常见.目前为止,已发现超过120个突变位点,其中在室间隔缺损、房室间隔缺损或法洛四联症患者中多见,但突变基因型与临床表型间的关系至今仍未阐明.该文总结了在人类先天性心脏病中已发表的GATA4基因突变位点,并绘制出功能性改变的基因突变图谱.
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GATA4基因与单纯性先天性心脏病的相关性研究
目的 探讨GATA4基因与单纯性先天性心脏病的相关性.方法 2001年,收集沈阳军区总医院心脏外科62个单纯性先天性心脏病(CHD)家系,选择GATA4基因编码区内4个可引起氨基酸改变的cSNP,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)分析该62个单纯性CHD核心家系206名成员的基因型;应用ETDT软件进行单位点关联分析;应用2LD软件进行配对连锁不平衡检验;应用TRANSMIT软件进行单体型分析.结果 Q19E(rs1139240)位点未检测到多态.L39V(rs1139241)、P66A(rs1139244)和G377S(rs3729856)位点存在多态.单位点关联分析显示L39V位点x2=6.178(P＜0.05),P66A位点x2=8.607(P＜0.05),G377S位点x2=9.842(P＜0.05).配对连锁不平衡检验显示L39V和P66A之间存在连锁不平衡(D'=0.999999).单体型分析共观察到4种单体型,只有2种单体型的频率大于3%,但却占单体型总数的97.7%.这两种单体型的总体统计x2=1.0345(P＞0.05).结论 Q19E在本文人群中未检测到多态;L39V、P66A和G377S 3个位点与单纯性CHD有明显的相关性(P＜0.05).
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GATA4基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响
目的:研究锌指转录因子(GATA4)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)对心肌梗死大鼠心功能的影响,为进一步探讨其机制提供依据.方法:构建GATA4-pEGFP基因质粒,体外分离培养大鼠MSCs,利用脂质体将质粒转染入MSCs.40只SD大鼠制备大鼠心肌梗死模型,于术后10 d测定心功能指标.将模型鼠随机分为MSCs组和DMEM组,每组各20只.MSCs组将GATA4-pEGFP基因修饰的MSCs植入心肌梗死后10 d大鼠心肌梗死区,DMEM组同时注射等体积无血清DMEM于心肌梗死区.移植注射后4周,检测左心室射血分数( LEVF)和左室缩短分数(FS).结果:体外分离培养的MSCs呈梭形或条形,贴壁生长.GATA4-pEGFP重组基因质粒转染MSCs 2周后,可见细胞中有绿色荧光蛋白表达.移植4周后,MSCs组大鼠LEVF(85％±7％)明显高于DMEM组(47％±4％)(P＜0.01); MSCs组大鼠FS(52％±6％)明显高于DMEM组(35％±8％)(P＜0.01).结论:GATA4基因修饰的MSCs移植能够改善心肌梗死大鼠心功能.
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多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响
目的 探讨多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响.方法 在P19细胞向心肌细胞分化的培养液中加入多氯联苯(Aroclor 1254)2.5 μmol/L,同时设立阴性对照组.显微镜下连续观察P19细胞形态的变化,并采用实时荧光定量RT-PCR技术对分化过程的第0、4、10天中GATA4及Nkx2.5基因mRNA的表达水平进行检测.结果 在分化全程(0 ～ 10天),实验组与对照组无细胞形态上的差别;而GATA4、Nkx2.5基因的表达量除在分化开始前(第0天)差异无统计学意义外,在分化中期(第4天)及末期(第10天),实验组中GATA4、Nkx2.5基因的相对表达量均显著低于对照组.结论 多氯联苯可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程.
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GATA4基因在汉族先天性房室间隔缺损患者中的突变分析
目的 通过检测GATA4基因在房室间隔缺损(AVSD)患儿中的突变情况,探讨其在房室间隔缺损发病机制中的作用.方法 收集94例汉族AVSD患儿(包括合并21三体综合征23例,散发病例71例)的血液标本,PCR方法扩增GATA4基因全部编码序列后,对扩增产物进行测序,然后与GenBank人中GATA4基因编码序列进行比对,并以100例健康汉族儿童为对照.结果 在94例患儿中检出4例错义突变(碱基变化为C106G、C259T、C504A、A1079G,氨基酸改变分别为P36A,P87S,D168E,E360G),前三者为散发的非综合征完全性AVSD患儿,第4例为完全性AVSD伴21-三体综合征患儿;6例患者发现多态性(rs56166237,碱基变化为G99T,氨基酸编码A33A).结论 GATA4基因作为心脏发育的重要转录因子,其基因突变可能导致GATA4蛋白功能的改变,从而导致AVSD的发病;GATA4基因在合并21-三体综合征抑或散发的AVSD患者中突变率均不高,提示AVSD可能是一个多基因的遗传性心脏疾病.
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GATA4基因甲基化在早期结直肠癌诊断中的作用
[目的]检测早期结直肠癌(colorectalcancer,CRC)患者粪便中GATA4基因甲基化水平,探讨其临床价值,为CRC早期无创诊断探索新的途径.[方法]60例早期(Ⅰ+Ⅱ期)CRC患者、30例正常对照者粪便中提取DNA,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)技术分析其GA TA4基因甲基化状态.同时检测60例早期(Ⅰ+Ⅱ期)CRC患者血清CEA和粪便潜血.[结果] CRC患者术前粪便标本中GATA4基因甲基化检测率显著高于正常对照组GA TA4基因甲基化检测率和CRC患者粪便潜血检测率以及CEA检测率(76.7％vs 6.7％,P=0.000;vs 48.3％,P=0.001;vs 35.0％,P=0.000),而GATA4基因甲基化检出率与患者性别、年龄和肿瘤部位无明显相关(P＞0.05).[结论] CRC早期患者粪便标本中GATA4基因甲基化检测率较高,优于粪便潜血实验和血清CEA,可作为早期无创筛查诊断结直肠癌的重要线索.
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GATA4基因沉默对多囊卵巢综合征模式大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及相关机制
目的:GATA4基因沉默对多囊卵巢综合征(PCOS)模式大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响.方法:空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和转染GATA4-siRNA沉默组(GATA4-siRNA)转染PCOS卵巢颗粒细胞48h后,Western blot检测各组细胞中GATA4、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:NC-siRNA组的GATA4、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达及细胞凋亡率与对照组差异无统计学意义(P>0.05),GATA4-siRNA组的细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组,GATA4、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组(P<0.01).结论:沉默PCOS模式大鼠卵巢颗粒细胞中GATA4表达,可促进细胞的凋亡,其机制与上调Cleaved caspase3蛋白表达及下调Wnt/β-catenin信号通路有关.
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重组大鼠GATA4-pEGFP基因在骨髓间充质干细胞的表达及意义
目的 体外获得表达重组大鼠GATA4-pEGFP基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),为进一步研究后者在心肌梗死治疗中的作用奠定基础.方法 提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR法扩增获得GATA4基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后GATA4-pEGFP质粒,采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs.将重组质粒GATA4-pEGFP以Lipo2000转染到大鼠MSCs,G418筛选2周,Western blot和荧光检测重组质粒在MSCs中的表达情况.结果 成功构建重组大鼠GATA4-pEGFP真核表达载体并转染入MSCs中,Western blot和荧光检测证实GATA4-pEGFP基因在MSCs中呈阳性表达.结论 成功建立表达大鼠GATA4-pEGFP基因的MSCs,此为利用组织工程学方法治疗心肌梗死的研究奠定了基础.
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基因突变在先天性心脏病发病中的作用研究进展
先天性心脏病是我国常见的出生缺陷,其发病机制与多种因素有关,与遗传机制密切相关.越来越多的研究证实单个或多个基因突变可导致先天性心脏病的发生,涉及的基因包括NKX2.5、GATA4、TBX5、TBX1、NOTCH1、CRELD1、TFAP2B基因,这些基因的突变导致房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症、大动脉转位、三尖瓣闭锁、三尖瓣下移畸形、右室双出口、动脉导管未闭、房室间隔缺损、单心室等先天性心脏病发生.
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抑制组蛋白乙酰化酶活性对心肌微环境中间充质干细胞向心肌细胞分化的影响
目的 通过检测移植经干扰乙酰化作用基因Gen5表达重组质粒ZJ3转染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的Wistar大鼠心肌组织内乙酰化酶活性及乙酰化作用基因Gen5、心肌发育基因GATA4的表达量,探讨体内心肌微环境下乙酰化修饰在干细胞特化心肌样细胞转录调控中的作用.方法 提取干扰组蛋白乙酰化酶Gcn5表达重组质粒ZJ3,经脂质体包载转染MSCs24h后移植至Wistar大鼠心肌组织内,2w后检测移植区域心肌组织内乙酰化酶活性及乙酰化作用基因Gcn5、心肌发育基因GATA4的表达量.结果 实验组心肌组织乙酰化酶活性较正常对照组、阴性对照组及试剂对照组均有显著性降低;实验组心肌组织内Gen5及GATA4表达量较正常对照组、阴性对照组及试剂对照组均有明显减弱.结论 相关特异性基因的检测结果显示封阻干细胞染色质组蛋白乙酰化修饰后,在体内心肌微环境诱导下亦可以抑制干细胞特化心肌细胞转录过程,这为进一步研究组蛋白末端乙酰化修饰与干细胞分化调节机制奠定了实验室基础.
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中国人散发性先天性心脏病患者GATA4基因的两个新错义突变
目的在散发的中国人先天性心脏病(congenital heart defects, CHD)患者中,鉴定GATA4基因突变. 方法应用单链构象多态性方法对31例CHD患者进行GATA4基因6个外显子所有编码序列的突变检测,对有异常条带的DNA进行直接测序.结果在31个CHD患者中,我们发现GATA4基因的两个新的错义突变,分别是位于第4外显子的V267M,和位于第6外显子的V380M,以及一个第6内含子中的核苷酸改变.结论我们在患有CHD的中国人群中,发现两个GATA4基因的新突变,提示其编码的转录因子在心脏的发育中具有重要作用.
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GATA4基因多态性与先天性心脏病相关性研究
目的 探讨GATA4基因多态性与先天性心脏病(CHD)的相关性.方法 收集甘肃省人民医院心脏外科300例无血缘关系的CHD患者的临床资料和血标本,以同期在本院体检中心体检的300名无血缘关系的健康者为对照组.应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法,对纳入的研究对象GATA4基因P66A (rs 1139244)多态性进行检测.采用Excel建立数据库,SPSS 17.0软件进行统计学分析.结果 CHD患者中检测到GATA4基因P66A (rs 1139244),该位点存在多态性,与先天性房间隔缺损、室间隔缺损发生有关.结论 GATA4基因P66A (rs 1139244)与CHD有明显的相关性.
