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Nkx2.5在肺血减少型先天性心脏病右室流出道心肌中突变及表达的意义
目的 观察Nkx2.5基因在肺血减少型先天性心脏病(CHD)患者中的突变及表达变化,探讨Nkx2.5基因在右室流出道梗阻发生中的分子调控机制.方法 选取2012年5月-2013年5月蚌埠医学院第一附属医院与安徽省立儿童医院心脏外科收治的56例肺血减少型CHD患者为实验组,同期收治的63例室间隔缺损患者为对照组.收集所有患者术前外周静脉血5 ml,采用PCR结合DNA测序技术对Nkx2.5基因的外显子进行序列检测,观察有无Nkx2.5基因突变;留取术中右室流出道肥厚心肌组织0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm,提取心肌组织RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测心肌中Nkx2.5基因mRNA的表达情况,分析Nkx2.5基因与肺血减少型CHD的关系.结果 实验组与对照组外周静脉血中均未检测出基因突变,实验组心肌组织Nkx2.5基因mRNA表达水平较对照组显著降低,差异有统计学意义(P＜0.叭).结论 Nkx2.5基因突变可能与多因素有关;肺血减少型CHD的发生可能与心肌组织中Nkx2.5基因表达下降有关.
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法乐四联症患儿NKX2.5、TBX5、GATA4基因的表达研究
目的:探讨NKX2.5、TBX5、GATA4基因与法乐四联症的发病关系及法乐四联症形成的分子机制. 方法:10例法乐四联症患儿(法乐四联症组),为我院2005-06至2005-12心脏中心住院患儿.年龄4个月～8岁,平均3.5岁.6例非先天性心脏病(先心病)意外死亡患儿作为对照(对照组),均没有先心病病史和遗传病家族史.年龄4个月～9岁,平均年龄3.8岁.留取各病例右心室流出道心肌组织,提取心肌组织总RNA,逆转录为与RNA链互补的单链DNA(cDNA).按照引物设计原则进行引物设计,用来扩增心肌组织NKX2.5、TBX5、GATA4、GAPDH mRNA目的片段.引物长度18 bp～22 bp,扩增片段长度163 bp、206 bp、237bp、203 bp.应用双标准曲线、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法比较NKX2.5、TBX5、GATA4基因的mRNA含量在对照组和法乐四联症组之间的统计学差异. 结果:法乐四联症组的NKX2.5mRNA含量较对照组显著降低,差异有统计学意义.TBXSmRNA和GATA4mRNA含量在法乐四联症组与对照组的差异无统计学意义. 结论:人心肌组织中有心脏发育相关基因NKX2.5、TBX5和GATA4mRNA的表达;法乐四联症可能与心肌组织中NKX2.5mRNA含量降低相关.
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先天性心脏病的基因遗传学及环境的影响
先天性心脏病是一组复杂的心脏解剖学畸形,是新生儿常见的先天性缺陷类型之一,在全世界范围内,先天性心脏病的发病率及病死率均较高,给社会及家庭带来沉重的负担.先天性心脏病的发生多是由环境因素和遗传因素共同作用的结果,目前已知染色体异常、单基因、多基因遗传缺陷,环境因素等都可以导致先天性心脏病的发生.因此,深入探究先天性心脏病的基因遗传学及环境的影响可对疾病的早期诊断及早期治疗提供新思路,为分子诊断学的发展开辟新道路.
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NKX2.5基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响
目的:以NKX2.5融合绿色荧光蛋白基因(NKX2.5-pEGFP)质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),将基因修饰后MSCs移植入大鼠心肌梗死模型中,评价其对心功能的影响.方法:体外分离培养大鼠MSCs,构建NKX2.5-pEGFP基因质粒,以lipo2000将质粒转染入MSCs.将基因修饰后MSCs植入心肌梗死后10 d的大鼠心肌梗死区(MSCs组,n=20),同时将注射等体积无血清改良依格尔(DMEM)培养液于心肌梗死区的大鼠作为DMEM组(n=20).移植注射后4周,通过检测左心室射血分数(LEVF)、左室缩短分数(FS)等研究其对心功能的影响.结果:移植4周后,MSCs组大鼠LEVF[(79±4)%]较DMEM组[(47±3)%]显著提高(P<0.01),MSCs组大鼠FS[(48±9)%]较DMEM组[(25±6)%]显著提高(P<0.01).结论:移植NKX2.5基因修饰后的MSCs能够改善心肌梗死大鼠心功能.
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表达大鼠融合蛋白NKX2.5-pEGFP的骨髓间充质干细胞的建立
目的:构建大鼠NKX2.5融合绿色荧光蛋白真核表达质粒NKX2.5-pEGFP,并筛选表达大鼠融合蛋白NKX2.5—pEGFP的骨髓间充质干细胞(MSCs),为后续性细胞和基因治疗心肌梗死提供理论基础.方法:提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR扩增获得大鼠NKX2.5基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后NKX2.5-pEGFP质粒.采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs.将重组质粒NKX2.5-pEGFP以Lip02000转染到大鼠MSCs,G418筛选2周.蛋白免疫印记和荧光检测重组后质粒在骨髓间充质干细胞中的表达情况.结果:电泳检测证实经RT-PCR获得NKX2.5基因大小为981 bp,与理论值相符.NKX2.5- pEGFP重组质粒经BamH Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切,PCR鉴定得到2条大小约为981和4 700 bp的酶切片段,鉴定结果与预期结果完全一致.蛋白免疫印记检测到转染重组质粒的MSCs中有相对分子质量为65 000的蛋白表达,与理论值相符.荧光检测NKX2.5-pEGFP重组质粒转染的MSCs中可见绿色荧光,证实表达阳性.结论:成功建立表达大鼠NKX2.5-pEGFP基因的MSCs.
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NKX2.5基因突变在先天性心脏病发病机制中的研究进展
NKX2.5/CSX基因的突变造成多种形态的先天性心脏病(congenital heart disease,CHD),是目前研究多的与心脏发育密切相关的转录因子基因之一.NKX2.5基因的生殖细胞突变,目前已经发现29种,分别为无义突变、错义突变、缺失等,导致NKX2.5蛋白与DNA结合功能下降或失活,在先心病发病中占据重要位置.近研究发现,在复杂型先心病中存在多种NKX2.5基因的体细胞突变,多个体细胞突变可能在先心病发病中起叠加效应.
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多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响
目的 探讨多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响.方法 在P19细胞向心肌细胞分化的培养液中加入多氯联苯(Aroclor 1254)2.5 μmol/L,同时设立阴性对照组.显微镜下连续观察P19细胞形态的变化,并采用实时荧光定量RT-PCR技术对分化过程的第0、4、10天中GATA4及Nkx2.5基因mRNA的表达水平进行检测.结果 在分化全程(0 ～ 10天),实验组与对照组无细胞形态上的差别;而GATA4、Nkx2.5基因的表达量除在分化开始前(第0天)差异无统计学意义外,在分化中期(第4天)及末期(第10天),实验组中GATA4、Nkx2.5基因的相对表达量均显著低于对照组.结论 多氯联苯可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程.
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基因突变在先天性心脏病发病中的作用研究进展
先天性心脏病是我国常见的出生缺陷,其发病机制与多种因素有关,与遗传机制密切相关.越来越多的研究证实单个或多个基因突变可导致先天性心脏病的发生,涉及的基因包括NKX2.5、GATA4、TBX5、TBX1、NOTCH1、CRELD1、TFAP2B基因,这些基因的突变导致房间隔缺损、室间隔缺损、法洛四联症、大动脉转位、三尖瓣闭锁、三尖瓣下移畸形、右室双出口、动脉导管未闭、房室间隔缺损、单心室等先天性心脏病发生.
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叶酸缺乏对孕鼠子代心脏中NKx2.5基因表达的影响
目的探讨叶酸缺乏孕鼠子代心脏发育过程中NKx2.5基因和蛋白表达改变.方法成熟雌性36只SD大鼠随机分为实验组和对照组各18只,分别喂以缺乏叶酸和添加叶酸的纯合饲料.2周后与成熟SD雄性大鼠交配,分别取孕13.5 d、孕17.5 d胚胎鼠及新生鼠心脏.用RT-PCR检测NKx2.5基因mRNA表达.Western-blotting测GATA-4蛋白表达水平.结果NKx2.5基因mRNA及其蛋白在孕13.5 d、孕17.5 d胚胎心脏及新生鼠心脏中的表达量,实验组均显著低于对照组(P均＜0 05).结论叶酸缺乏影响NKx2.5基因和蛋白表达水平,可能导致心脏发生发育中形态改变,从而造成心脏功能缺陷.
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先天性室间隔缺损与NKX2.5基因突变的关系
目的 探讨NKX2.5同源蛋白(NKX2.5)基因突变与广西壮族人群先天性心脏病室间隔缺损的关系.方法 采用聚合酶链反应(PCR)与DNA检测技术,进行30例室间隔缺损患者(VSD)与30例对照组患者的NKX2.5基因全部外显子和侧翼序列的基因突变对比检测,对单核酸多态位性(SNP)位点进行基因分型,分析单个位点的基因型与等位基因频率与VSD的关系.结果 所有VSD患者NKX2.5基因均未见突变,在NKX2.5基因第二外显子区域发现1个SNP位点,位于上游碱基第606位c.606G＞C,属于同义突变,CHD组与对照组之间差异无统计学意义(基因型频率比较,x2=0.640,P＞0.05;等位基因频率比较,x22=0.034,P＞0.05).结论 NKX2.5基因突变与广西壮族人群VSD无明显相关性.
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先天性心脏病与同源蛋白NKX2.5基因突变的关系
目的 探讨同源蛋白NKX2.5(NKX2.5)基因突变和广西壮族人群先天性心脏病(CHD)的关系.方法 应用聚合酶链反应以及DNA测序技术,对30例广西壮族CHD患者(包括房间隔缺损组8例,室间隔缺损组10例,法洛四联征5例,右室双出口2例,大动脉转位l例,肺动脉狭窄l例)以及30正常非CHD对照者(正常对照组)的NKX2.5基因的全部外显子和侧翼序列进行突变检测,并对单核苷酸多态性(SNP)位点进行基因分型,分析单个位点的基因性和等位基因频率与CHD是否有关.结果 所有CHD患者基因编码均未发现突变,而在NKX2.5基因外显子1区域发现1个SNP位点,这个位点位于上游63位碱基63A ＞G,导致第21位密码子由GAA转变成GAG,碱基替换后仍然编码谷氨酸(Glu),属于同义突变.基因型频率和等位基因频率的分布,在CHD组和正常对照组之间差异无统计学意义(两组基因型频率比较,x2=1.725,P=0.422;等位基因频率比较,x2=1.714,P=0.190).结论 NKX2.5基因突变与我国广西地区壮族CHD之间兀明显相关,该基因上的63A＞G的SNP与先天性心脏病之间无明显相关.
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NKX2.5基因和TBX5基因在先天性心脏病试管婴儿中的突变检测
目的 探讨患先天性心脏病的试管婴儿与自然受孕儿间是否存在NKX2.5基因和TBX5基因突变差异.方法 应用聚合酶链反应结合DNA测序技术,对68例试管婴儿先天性心脏病患儿和98例自然受孕先天性心脏病患儿的NKX2.5基因编码区1、2和TBX5基因编码区4、5、8进行突变检测.结果 在患先天性心脏病的试管婴儿与自然受孕儿中,均发现NKX2.5基因编码区1中第63位碱基发生突变(c.63A>G),该位点基因型及等位基因频率的分布在两组间差异无统计学意义.NKX2.5基因编码区2和TBX5基因编码区4、5、8未检测到突变.结论 先天性心脏病的试管婴儿与自然受孕儿间NKX2.5基因和TBX5基因突变无差异,推测辅助生殖技术并未引起NKX2.5基因和TBX5基因突变.
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低压脉动电刺激对体外心肌诱导分化过程中GATA-4和NKx2.5基因表达的影响
目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,低压脉动电刺激对心肌转录因子GATA-4和NEx2.5基因表达的影响,探讨电刺激对骨髓间充质干细胞向心肌分化过程的影响及其分子生物学机理.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代MSCs,对照组以10μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)诱导,电场组诱导后施加1.5V/cm电场刺激.分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和western blot技术检测troponin I(TnI)表达,RT-PCK法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达.结果 诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,TnI蛋白在诱导后第2周开始表达,第3、4周明显增强.GATA-4和Nkx2.5基因第1周开始表达,第2周增强,第3周达到高峰,持续到第4周.电场刺激组细胞排列更加紧密,诱导后各时间点GATA-4和Nkx2.5基因表达比对照组明显增强.结论 脉动电场刺激促进MSCs向心肌细胞的分化过程,GATA-4和Nkx2.5基因可能调节该促进过程.
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NKX2.5基因的表观遗传学改变与先天性心脏病的关系
先天性心脏病(简称先心病)是小儿先天畸形中常见的疾病,虽然现在有先进的医疗技术来诊断和治疗先天性心脏病.但其患病率和致死率仍然很高.先天性心脏病的病因大多数为遗传-环境相互作用的结果,且多为心血管畸形而不伴有其他畸形,包括了全部先心病病例的90%以上.
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NKX2.5基因突变与广西壮族人群先天性房间隔缺损的关系研究
目的 探讨NKX 2.5基因突变与广西壮族人群先天性心脏病(CHD)房间隔缺损的关系.方法 应用聚合酶链反应(PCR)及DNA测序技术,对30例广西壮族CHD房间隔缺损患者(CHD组)以及30例非CHD患者(对照组)的NKX 2.5基因的全部外显子和侧翼序列进行突变检测,并对单核苷酸多态性位点进行基因分型,分析单个位点的基因型、等位基因频率与CHD房间隔缺损的关系.结果 所有CHD房间隔缺损患者NKX 2.5基因均未发现突变,而在基因第二外显子区域发现1个SNP位点,位于上游606位碱基c.606G ＞C,属于同义突变.两组基因型频率、等位基因频率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 NKX 2.5基因突变与广西壮族CHD房间隔缺损患者之间无明显相关性,该基因上的606G＞C的SNP与先天性心脏病房间隔缺损之间无明显相关性.
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骨髓间充质干细胞向心肌诱导过程中GATA-4和Nkx2.5基因的表达
目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,心肌转录因子GATA.4和Nkx2.5基因表达的变化规律,探讨其分子生物学机理.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代以10 pmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)诱导.分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和Western blot法检测肌钙蛋白I(troponinI,TnI)表达·RT-PCR法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达.结果 诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,第1周开始即有GATA-4和Nkx2.5基因表达,逐渐增强,第3周达到高峰,持续到第4周.结论 GATA·4和Nkx2.5基因表达在骨髓同充质干细胞向心肌样细胞诱导过程中逐渐增强,可能参与调控心肌细胞的分化过程.
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NKX2.5基因多态性与成人心血管疾病的相关性
目的 研究NKX2.5 基因(同源盒转录因子)多位点单核苷酸多态性与成人心血管疾病发病风险的相关性.方法 实验采用病例对照研究,纳入心血管疾病患者108例,对照组105例(同期体检的健康人).采用聚合酶链反应(PCR)结合DNA测序技术对NKX2.5 基因rs3729753、rs2277923的多态性位点进行序列扩增、检测和基因分型分布.采用卡方检验对两个多态性位点与成人心血管疾病的风险进行关联分析.结果 rs3729753位点,纯合突变型(CC),突变杂合子(GC)与野生型纯合子(GG)在两组中分布差异无统计学意义(P=0.200).突变型等位基因C和野生型等位基因G在两组中的分布差异无统计学意义(P=0.213).rs2277923位点,携带突变等位基因A个体的患病风险是携带野生型等位基因G个体的2.36倍(95%CI 1.50~3.70,P=0.000).与野生型纯合子(GG)比较,杂合子(GA)个体患病的风险显著增高(OR=2.18,95%CI 1.24~3.85,P=0.007);纯合子(AA)个体患病的风险显著增高(OR=16.62,95%CI 2.07~133.25,P=0.001).rs2277923位点亚组分析中,冠心病组携带突变等位基因A相对于野生型等位基因G个体的患病风险显著增加(χ2=8.523,P=0.004).与野生型纯合子(GG)比较,突变纯合子(AA)个体患病风险显著增高(χ2=11.396,P=0.001).原发性高血压组并未发现rs2277923位点突变与疾病存在相关性.冠心病合并原高组携带突变等位基因A相对于携带野生型等位基因G个体的患病风险显著增加(χ2=13.23,P=0.000).与野生型纯合子(GG)比较,杂合子(GA)个体患病风险显著增加(χ2=6.957,P=0.008);纯合子(AA)个体患病风险显著增加(χ2=13.679,P=0.000).结论 NKX2.5 基因rs2277923位点突变是成人心血管疾病的风险因素.
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Nkx2.5基因与先天性心脏病的关系
先天性心脏病(以下称先心病)是一类严重危害婴幼儿健康的先天畸形.心脏发育过程中控制发育的基因突变是先心病的常见原因.大量研究表明Nkx2.5作为与发育相关的同源盒基因的一种,在心脏发育过程中起重要的作用,该基因的突变或多态性将影响心脏发育导致先心病.本文系统地阐述了Nkx2.5基因的结构、功能及其与先心病的关系,进而在分子水平上对心脏的发生和先心病发病有更深入的了解.
