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HCV NS5A反式激活基因 NS5ATP13在毕氏酵母中的表达研究
目的 探讨NS5AATP13能否在毕氏酵母中成功表达.方法 用Bst X I将pPICZαANS5ATP13线性化后,电转化毕氏酵母菌株KM71H,用Zeocin筛选高拷贝数的酵母菌落,在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达,以甲醇诱导,30℃培养4 d,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 分析.结果 预期分子量大小的NS5ATP13蛋白分泌至培养液.结论 NS5ATP13在毕氏酵母中成功表达.
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人重组白细胞介素-13在毕氏酵母中的表达及其体外诱导DC分化作用的研究
目的:在毕氏酵母中表达重组人IL-13并探讨其对DC的诱导作用.方法:用基因工程的方法人工合成IL-13的全长片段,并转化至毕氏酵母菌株GS115中,筛选后获得表达量相对较高且分泌稳定的rhIL-13基因工程菌株,用rhIL-13来替代IL-4体外诱导DC.结果:得到表达量达25 mg/L且分泌稳定的rhIL-13基因工程菌株;rhIL-13具有rhIL-4同样的体外诱导外周血单核细胞向DC增殖分化的作用,MHCII、CD1α、CD80、CD83、CD86等DC表型分析和混合淋巴细胞反应刺激T细胞增殖的作用与IL-4诱导得到的成熟DC并无显著差别,其所诱导的未成熟DC具有很强的摄取抗原能力.结论:获得表达量相对较高且分泌稳定的rhIL-13基因工程菌株,rhIL-13在体外可有效地诱导外周血单核细胞向DC分化.
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重组人抗乙型肝炎表面抗体表达的研究
目的 应用毕赤酵母表达体系,表达、制备人抗乙型肝炎表面抗原全分子抗体.方法 以抗-HBs抗体阳性个体为对象构建抗体表达文库,筛选抗-HBs抗体轻链和重链可变区序列,并将其重组至同一表达载体pPICZαIgG,转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选鉴定及免疫印迹分析.结果 Western印迹检测在分子量约140 kD处出现特异性染色条带,ELISA结果表明所获得抗体分子具有良好的乙型肝炎表面抗原结合活性.结论 在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具抗原结合活性的完整分泌型抗-HBs抗体.
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人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性
目的 在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189 (vascular endothelial growth factor 189,VEGF 189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性.方法 以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF 189.将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用Sac Ⅰ酶线性化,电转至毕赤酵母GSll5中,经4mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆.采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化.血管通透性试验检测其生物活性.结果 经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确.VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95％以上,浓度为0.2911 mg/ml,可增加血管的通透性.结论 本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础.
关键词： 人血管内皮生长因子189 毕氏酵母 纯化 血管通透性试验 生物学活性 -
表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺
目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5 L发酵罐中的发酵表达工艺参数.方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征.结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量高达到120 mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征.结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为:无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A60o=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 发酵 毕氏酵母 -
人可溶性4-1BBL在毕氏酵母中的表达及其协同刺激效应的研究
目的: 通过甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统,表达出具有生物活性的人可溶性4-1BBL重组蛋白.方法: PCR方法从XG-4-1BBL转基因细胞中获得4-1BBL的胞外段基因;利用酵母表达载体pPICZαA构建重组质粒pPICZαA-s4-1BBL,经线性化后电转化导入毕氏酵母GS115中,甲醇诱导表达;SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot分析发酵上清中hs4-1BBL蛋白表达水平及其特异性;体外T细胞增殖试验(3H-TdR掺入法)观察rhs4-1BBL 蛋白的生物学活性.结果: (1)成功地扩增到4-1BBL的胞外段基因,酶切鉴定及测序结果与已知的基因序列一致;(2)SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot结果显示所获重组蛋白的分子量与预期分子量(21 kD)相同,并可被4-1BBL特异性抗体识别;(3)重组蛋白在体外具有协同促进T细胞增殖的效应.结论: 成功地在毕氏酵母表达系统中表达出具有生物学活性的人可溶性4-1BBL重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了物质基础.
关键词： 人可溶性4-1BBL 毕氏酵母 表达 协同效应 -
修饰后日本血吸虫Sjc-97基因的真核表达及其免疫原性
目的:研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因第3区域片段(Sjc-97f3)毕氏酵母表达产物的免疫原性.方法:根据毕氏酵母密码子使用频率重新设计Sjc-97核苷酸序列,依据不对称PCR原理人工合成Sjc-97f3,并在毕氏酵母中表达.表达产物通过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析方法纯化,再分别与ISA720和Al(OH)3佐剂乳化后,免疫C57BL/6和昆明小鼠,通过尾蚴膜反应和ELISA反应检测特异性抗体.结果:Sjc-97f3基因在毕氏酵母中获得了高水平分泌表达,其表达产物能与日本血吸虫免疫血清进行特异性免疫反应.经与佐剂乳化后,该蛋白具有良好的免疫原性.ELISA结果显示重组蛋白在小鼠体内可激发明显的抗体反应,但2种佐剂所诱导的抗体水平以ISA720佐剂为高; 该抗原在不同品系小鼠中的抗体水平存在显著差异(P<0.01),昆明鼠的抗血清滴度远高于C57BL/6小鼠.小鼠免疫血清能识别日本血吸虫表面抗原,产生特异的尾蚴膜反应. 结论:密码子优化的Sjc-97f3在毕氏酵母中获得高效表达,其产物具有良好的免疫原性.
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含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测
目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体,并在真核生物毕氏酵母细胞中表达.方法:用EcoR I和Not I将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后,克隆到毕氏酵母载体PICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA-LMP2A.pICZαA-LMP2A经Sac I酶切线性化,采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GSI15,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株,用PCR鉴定阳性酵母转化子,并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳和western-blotting分析.结果:重组质粒pPICZαA-LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性.SDS-PAGE电泳和western-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54 Kda,与预计值相同.结论:构建了LMP2A毕氏酵母表达载体,并在酵母细胞中成功表达.
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毕氏酵母KM71和GS115发酵工艺的比较
目的探讨毕氏酵母菌KM71和GS115表达人可溶性FLt3配体、CD40L、IL-13、IL-11及TNFα等外源蛋白的发酵工艺.方法挑取KM71或GS115单个菌落在BMGY培养基中初步培养,在其A600值达2～6时,转入发酵罐中行高密度发酵.结果 KM71诱导表达时,对甲醇的需求较低,故添加甲醇速度应较慢,并应提高菌的接种浓度;而GS115菌株生长速度较快,代谢甲醇的能力较强,表达量相对较高.结论 KM71和GS115可用于不同性质外源蛋白的表达,表达量较高,是一种理想的表达系统.
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白色念珠菌ERG11突变基因在毕氏酵母中的表达
目的 将含有点突变的白色念珠菌编码基因ERG11克隆至毕氏酵母中进行表达,判断其在白色念珠菌对氟康唑敏感性中的作用.方法 将含有点突变的白色念珠菌编码基因ERG11与pPIC3.5K载体重组,构建pPIC3.5K/Ca1.6k重组体,经Top10F'鉴定和筛选,电转入毕氏酵母GS115中,经过诱导表达出现目的 蛋白后,进行药物敏感性试验,确定点突变与耐药的关系.结果 含Y132H突变转化菌株和含Q474K突变的转化菌株对氟康唑的MIC分别上升16倍和8倍,证实其突变与耐药有关.结论 氟康唑耐药可发生于白色念珠菌编码基因ERG11的Y132H与Q474K点突变中.
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恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 EGF2结构域的表达及免疫反应特点
目的 制备恶性疟原虫红内期抗原MSP1C-末端EGF2区域,用于分析该区域在自然感染条件下的免疫应答特点.方法 制备恶性疟原虫裂殖体表面蛋白1(MSP1)C-末端的EGF2片段,并将其与谷胱甘肽转移酶(GST)片段融合,通过电转化整合入毕氏酵母的基因组,进行诱导表达,纯化表达产物,并对其免疫特性进行初步分析.结果 初始对单个EGF2片段表达未成功,与GST片段融合后检测到表达,经过Ni柱浓缩纯化的诱导表达上清, 经SDS-PAGE分析在33kDa处出现表达的蛋白条带,经Western blot检测表明该蛋白为所需的目的蛋白;ELISA结果表明GST-EGF2重组蛋白能够与免疫兔血清反应,且平均抗体滴度可达5981.结论 利用毕氏酵母表达系统表达了EGF2结构域,并证明该蛋白能与特异抗体反应,可用于EGF2相关的疟疾保护性免疫的研究.
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pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体的构建及体外表达
目的 构建毕氏酵母表达载体pPIC9K/Ang-1,并进行体外表达研究.方法 从PGEM-T/Ang-1载体中切取目的 片段Ang-1,利用定向克隆到毕氏酵母表达载体pPIC9K中,测序正确后, pPIC9K/Ang-1载体经SalⅠ酶切线形化,以电转化法导入GS115毕氏酵母菌株中,经YPD平板G418抗性筛选后获得Ang-1表达阳性菌株;用SDS-PAGE测定其分子量,用Western Blotting检测发酵上清中Ang-1的抗原性和表达量.结果 成功切取1.5 kb的Ang-1片段,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致.酶切线性化的质粒成功转入GS115毕氏酵母中,诱导表达后SDS-PAGE显示重组人Ang-1分子量约66 kD,Western Blotting证实为人Ang-1.结论 成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,成功获得稳定分泌Ang-1重组蛋白的基因工程菌株.
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恶性疟疾多价疫苗的构建及表达
目的 构建恶性疟原虫多表位融合抗原基因(PfCP2E9),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法 选取本实验室前期构建的融合蛋白PfCP-2.9与疟原虫红内期疫苗候选抗原EBA175IIF2,按一定的次序拼接成该融合基因,并克隆至酵母表达载体,用电转化方法将拼接基因导入毕氏酵母中进行分泌表达.结果 拼接的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达.结论 构建的恶性疟原虫多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.
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可溶性CD14在酵母细胞中的分泌表达与LPS结合活性分析
目的:在酵母系统中实现可溶性CD14基因的分泌表达,并进行LPS结合活性分析.方法:将可溶性CD14基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacⅠ将重组质粒线形化,电转化Pichia pastoris GS115细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达.结果:经过诱导表达条件的优化,sCD14在pH 6.5培养基BMMY中实现了分泌表达.免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体.经流式细胞仪检测,重组产物具有结合细菌内毒素(LPS)的生物学活性.结论:具有良好LPS结合活性的重组可溶性CD14分子可以用于进一步的结构与功能研究.
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恶性疟原虫MSP1-19毕氏酵母真核表达克隆的构建
目的构建恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量1.9万片段(MSP1-19)毕氏酵母真核表达克隆.方法利用PCR技术扩增出MSP1-19,插入pPIC9载体中,鉴定正确的MSP1-19基因,插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9k中,DNA测序鉴定序列的正确性,转化酵母细胞.结果筛选出的阳性克隆为MSP1-19表达克隆.结论用分子生物学方法重组构建的MSP1-19毕氏酵母真核表达克隆,为高效表达MSP119及其活性鉴定奠定了基础.
