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小鼠腹腔持续置管引流模型骨髓髓系造血受抑制的研究
目的：利用小鼠腹腔持续置管引流（CASP）模型探讨脓毒症对造血干细胞、髓系祖细胞的影响。方法采用腹腔持续置管引流手术制作脓毒症小鼠模型，以假手术组作为对照。术后24 h，采用流式细胞术检测骨髓中造血干细胞、髓系祖细胞比例的变化以及造血干细胞增殖的变化。结果与假手术组相比，CASP模型组以髓系细胞为主的骨髓总细胞数显著降低，骨髓造血干细胞（HSCs）扩增明显，多潜能祖细胞（MPPs）、共同髓系祖细胞（CMPs）和粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）均显著减少。结论 CASP脓毒症模型小鼠髓系细胞减少可能与骨髓造血干细胞髓系分化障碍有关。
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全反式维甲酸对脐血粒-单系祖细胞HOXB6基因表达的影响
目的 探讨脐血造血干祖细胞(HSPC)向粒-单系(CFU-GM)增殖过程中HOXB6mRNA表达及全反式维甲酸(ATRA)对HOXB6mRNA表达的影响.方法 1.采用造血祖细胞体外培养技术,以ATRA持续干扰人类造血干祖细胞,观察人脐血HSPC经人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导后,在培养过程第3天,7天和12天的CFU-GM集落生成情况.2.采用实时荧光定量PCR技术(FQ-RT-PCR)检测造血祖细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达水平.3.结果 用DNA相对拷贝数和RNA表达相对量(2-△△Ct)表示HOXB6基因相对表达量.结果 1.人类造血干祖细胞向粒单系增殖分化过程中,各组细胞HOXB6基因均表达;2.随时间延长,CFU-GM-HOXB6-mRNA在增殖分化的第7天表达强烈,第12天表达明显减弱;3.与正常对照组比较,ATRA认可上调HOXB6基因的表达.结论 1.在脐血CFU-GM祖细胞的不同增殖阶段,HOXB6基因呈现持续稳定的表达,提示HOXB6是人类造血干祖细胞向粒单系正常增殖分化过程中的调控基因之一;2.ATRA能显著上调HOXB6基因的表达.
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枸杞对小鼠辐射损伤后造血系统修复的促进作用
目的 探讨枸杞在小鼠辐射损伤后造血系统修复过程中的作用.方法 小鼠随机分为3组,正常对照组不做任何处理,喂饲正常饲料;另外2组,给予4.5 Gy照射后,喂饲正常饲料或添加枸杞的饲料,1个月后,处死小鼠,应用流式细胞仪分析外周血、脾脏、胸腺及骨髓中各种血细胞.结果 枸杞饲料组小鼠,外周血细胞总数及B细胞增多,骨髓细胞总数减少,骨髓前体B细胞及未成熟B细胞增多,造血干、祖细胞均显著减少.结论 枸杞促进辐射损伤后造血干细胞动员及分化,加速造血系统的恢复.
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二肽基肽酶-4在造血和移植中的作用
二肽基肽酶-4(DPP-4)具有剪切多肽N端第2个氨基酸为丙氨酸、脯氨酸的功能,其作用底物包括许多与造血系统调节有关的趋化因子、克隆刺激因子和白细胞介素.近期研究表明,DPP-4对集落刺激因子的剪切会改变其功能,进而影响造血干祖细胞及移植,但关于DPP-4的调节以及对大部分因子剪切后的影响仍未阐明,本文总结了DPP-4抑制的相关研究进展,提出今后的研究方向.
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氧化应激对铁过载造血干祖细胞造血功能的影响
目的 体外诱导脐血来源的造血干祖细胞铁过载,检测参与氧化应激的活性氧物质(ROS)的水平以及对造血干祖细胞造血功能的影响.方法 通过体外培养脐血单个核细胞(MNC)的过程中添加枸橼酸铁铵(FAC),建立铁过载造血干祖细胞模型.实验分组:对照组、FAC组、FAC+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、FAC+谷胱甘肽(GSH)组.检测各组细胞内ROS水平,并用抗氧化剂处理,检验这一过程中ROS、细胞内可变铁池(LIP)、凋亡水平、造血集落形成和脐血各系造血细胞数目的变化.结果(1)在培养液中加入不同浓度FAC(50、100、200、400μmol/L)培养不同时间(6、12、24 h),发现ROS水平随着FAC的浓度和培养时间变化,且在200μmol/L FAC的培养液中培养24h时ROS水平达到高.(2)用抗氧化剂(NAC、GSH)联合FAC处理细胞发现,抗氧化剂处理组细胞内总的ROS以及髓系细胞和红系细胞内的ROS明显低于FAC组(均P＜0.05).(3)在200 μmol/LFAC的浓度下,培养脐血MNC 24 h后细胞内总的LIP、髓系细胞和红系细胞内LIP水平均显著高于对照组(均P＜0.05),但抗氧化剂NAC和GSH对铁过载细胞内LIP没有明显影响.(4)对脐血造血干祖细胞造血功能的检测发现:FAC组细胞凋亡比例[(20.90±3.45)％]明显高于对照组[(9.20±1.29)％](P＜0.05)；造血集落形成单位(CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix)计数明显低于对照组(前3项两组间差异具有统计学意义,P ＜0.05)；CD34+、CD33+、GlyA+细胞比例及细胞计数均显著低于对照组(均P＜0.05)；这些损伤都可以通过NAC或GSH处理部分恢复.结论 氧化应激在铁过载造血干祖细胞的损伤中扮演着重要角色,可以通过升高细胞内ROS水平抑制其造血功能,清除细胞内多余的ROS能减轻这些损伤.研究结果可为治疗铁过载患者因氧化应激诱导的造血功能低下提供新的靶点和研究思路.
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ERT2-Cre诱导的Rosa26R-YFP报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率检测
目的 探索ERT2-Cre诱导的黄色荧光蛋白(YFP)报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率.方法 通过基因型分型的方法,从Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠杂交得到的后代中,筛选出YFP及ERT2-Cre双阳性转基因杂交小鼠;采用免疫磁珠法从双阳性转基因小鼠骨髓细胞中富集c-kit+造血干祖细胞群进行体外培养,并用不同浓度4-羟基它莫西芬(OHT)作用不同时间以诱导YFP表达;流式细胞术检测c-kit+造血干祖细胞中YFP的表达量.结果 Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠的杂交后代共9只,采用基因型分型方法筛选出双阳性转基因小鼠5只;体外培养的c-kit+细胞部分形态发生变化,提示存在细胞分化;流式细胞术检测到c-kit+细胞中YFP表达量可达13.7％.结论 YFP报告基因系统在OHT诱导的ERT2-Cre作用下,能有效标记小鼠造血干祖细胞.
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深低温冻存十六年后脐血造血干细胞活性的检测
富含造血干祖细胞,已成功地用于儿童造血重建[1-2].脐血的采集特点决定了其必须深低温保存后再寻求应用,脐血在液氮中是否能够长期有效保持干细胞活力即成为应用的关键,但有关10年以上的脐血冻存.
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脐血中造血细胞CD34+CD29+细胞含量对移植造血重建的影响
近半个世纪以来的实践证明,造血干细胞移植( HSCT)是白血病、再障、免疫缺陷病等恶性血液病治疗中的一个有效措施,而且提高造血干祖细胞( HSPC)在造血组织中的植入率是加快 HSCT后造血重建的关键之一.目前已证实,在外周血移植中, CD29+细胞与粒细胞、血小板的恢复相关 [1].我们通过对脐血 CD29+细胞的检测,试图寻找其对脐血移植造血恢复的影响,结果如下.
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AC133抗原研究进展
造血干祖细胞的高效选择对干祖细胞移植的基础和临床研究,以及基因治疗具有重要意义.过去10年,由于CD34 表面抗原普遍用于造血干祖细胞的筛选,进而产生了更精确的细胞纯化技术和新颖的临床血液治疗措施.近几年的研究表明,CD34表达只是造血干祖细胞活化状态的标志,在CD34-细胞中尚存在较CD34+细胞更为原始的造血干细胞.因而,迫切需要寻找更为早期的造血干祖细胞的新标志.AC133,1个新的早期干祖细胞表面抗原有可能担当这一角色.本文就AC133的分子结构、表达、功能及其与CD34抗原和凸素(prominin)的关系等研究进展作一综述.
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肾上腺素与rhG-CSF协同动员小鼠造血干祖细胞的研究
目的 通过比较肾上腺素和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)单独或联合应用动员小鼠外周血造血干祖细胞(HSPC)的效果,以了解肾上腺素对HSPC的动员作用,为临床制定更为优良的动员方案奠定实验方面的基础.方法 BALB/c小鼠48只,随机分成4组,每组12只.A组作为对照组,皮下注射生理盐水(NS) 100 μl·d-1;B组皮下注射rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1;C组腹腔注射肾上腺素2.5 mg·kg-1·d-1;D组皮下注射rhG-CSF 250 μg·kg-1·d-1+腹腔注射肾上腺素2.5 mg·kg-1·d-1 (rhG-CSF后3 h),各组均连续用药5天.动态观察各组小鼠外周血中白细胞数(WBC)、Lin-c-kit+ (KL)、Lin-c-kit+Sca-1+ (KSL)细胞比例的变化.结果 D组外周血WBC数及KL、KSL细胞比例明显高于B组(P<0.05)或C组及A组(P<0.01);B组外周血WBC数及KL、KSL细胞比例明显高于C组及A组(P<0.01);C组外周血WBC数明显高于A组(P<0.01),但KL、KSL细胞比例与A组比较无显著性差异(P>0.05).结论 肾上腺素可协同rhG-CSF参与HSPC的动员.
关键词： 造血干祖细胞 肾上腺素 重组人粒细胞集落刺激因子 KL细胞 KSL细胞 -
铁过载对脐带血来源的造血干祖细胞及造血支持细胞的作用观察
目的 探讨铁过载对脐带血(UCB)来源的造血干祖细胞及造血支持细胞,尤其是间充质干细胞(MSCs)的损伤作用.方法 体外培养脐带血单个核细胞(UCB-MNCs)和脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs),向培养液中添加200 μmol/L的枸橼酸铁胺(FAC) 24 h建立铁过载模型.分为MNCs-CTL组、MNCs-FAC组、MSCs-CTL组、MSCs-FAC组,每组设3个复孔,实验重复3次.检测细胞内活性氧物质(ROS)水平变化、细胞增殖、分化、凋亡以及造血支持作用.结果 对UCB-MNCs进行铁过载,MNCs-FAC组造血集落形成单位(CFU-E、CFU-GM、BFU-E、CFU-mix)计数显著低于MNCs-CTL组(P＜0.05),MNCs-FAC组造血干细胞(CD+34)、髓系造血细胞(CD+33)、红系造血细胞(GlyA+)比例及计数均显著低于MNCs-CTL组(P均＜0.05)；MNCs-FAC组的凋亡率高于MNCs-CTL组(P＜0.05).MSCs-FAC组的群体倍增时间明显长于MSCs-CTL组,且其凋亡率亦高于MSCs-CTL组(P＜0.05).结论 铁过载可抑制造血干祖细胞的增殖、分化,诱导其凋亡,也可抑制MSCs的增殖能力,诱导其凋亡,降低其造血支持能力,且此过程中ROS升高.
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脐血移植移植物抗宿主病与抗白血病研究进展
脐血含有丰富的造血干祖细胞,加之脐血具有来源广泛、采集方便、对供者无损伤等特点使得脐血移植(cord blood transplant,CBT)越来越受到各国研究人员的关注.自1989年全世界首例脐血干细胞移植成功以来[1],到2000年各国脐血移植已超过1 000例[2].干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD)与移植物抗白血病(GVL)是决定移植是否成功和降低移植后复发率、提高无病生存率的关键因素.现就脐血移植后GVHD和GVL研究进展做一综述.
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全反式维甲酸对脐血粒-单系和红系祖细胞HOXB6基因表达的调控作用
目的 探讨脐血造血干祖细胞(hematopoietic stem-progenitor cell,HSPC)向粒-单系(colony form-ing unit-granulocyte-monocyte,CFU-GM)、红系(colony forming unit-erythroid,CFU-E)增殖过程中HOXB6mRNA表达及全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对HOXB6mRNA表达的影响.方法 ①采用造血祖细胞体外培养技术,以ATRA持续干扰人类造血干祖细胞,观察人脐血HSPC经人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和促红细胞生成素(EPO)分别诱导后,在培养过程第3天,7天和12天的CFU-GM、CFU-E集落生成情况.②采用实时荧光定量PCR技术(fluorogenic quantitative reserve transcriptionpolymerize chain reaction,FQ-RT-PCR)检测造血祖细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达水平.③结果 用DNA相对拷贝数和RNA表达相对量(2-△△α>)表示HOXB6基因相对表达量.结果 ①人类造血干祖细胞向粒单系和红系祖细胞增殖分化过程中,各组细胞HOXB6基因均表达.②随时间延长,CFU-GMHOXB6-mRNA在增殖分化的第7天表达强烈,第12天表达明显减弱.而在CFU-E中,HOXB6-mRNA表达在第3天,第7天,第12天均持续表达.③与正常对照组比较,ATRA可上调HOXB6基因的表达.结论 ①在脐血CFU-GM、CFU-E祖细胞的不同增殖阶段,HOXB6基因呈现持续稳定的表达,提示HOXB6是人类造血干祖细胞向粒单系和红系祖细胞正常增殖分化过程中的调控基因之一.②ATRA能显著上调HOXB6基因的表达.
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脐血库造血干/祖细胞的分离、保存和集落培养
目的 探讨脐血库脐血分离、保存方法及造血干祖细胞的体外培养条件.方法 采用建立在密度梯度离心基础上的HES分离法对脐血进行有核细胞分离、冻存及粒巨系造血祖细胞集落(CFU-GM)培养.结果 离心管收集分离和四联袋采集分离的方法均可获得较高的单个核细胞量,但四联袋采集分离在回收率和浓缩程度上更为优越,且粒巨系造血祖细胞(CFU-GM)含量丰富,10%DMSO冻存液保存复苏后仍可获得较高活率和CFU-GM.结论 我们建立的HES分离结合密度梯度离心分离脐血造血干祖细胞以及脐血长期冻存的方法为广泛、大规模地建立脐血库提供了基础.
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造血干祖细胞移植的生物学基础
一、什么是造血干祖细胞佳的移植物造血干祖细胞移植(HSPCT)用于治疗造血干祖细胞缺陷性血液病、先天性免疫缺损、先天性贫血、各类自身免疫病等,也用于实体瘤的治疗,是一种重要的生物治疗或细胞治疗.
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前沿
既往研究显示，男性比女性更易患白血病，但一直没有明确其原因。近，一项研究提供了一个解释，雌激素调节突变的造血干祖细胞的存活、增殖和自我更新（HSPCs）（HSPCs突变引起白血病）。此外，利用白血病小鼠获得的研究结果表明他莫昔芬（其靶向雌激素受体、被批准用于乳腺癌的治疗）或可成为阻止人类白血病发展的药物。
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细胞外基质对造血干祖细胞增殖、分化的影响
细胞外基质是造血微环境的重要组成部分,它在造血干祖细胞增殖、分化过程中担负着重要角色,可以由多个途径影响造血干祖细胞的增殖、分化。
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造血功能障碍的修复与重建
正常生理状况下的造血取决于"造血种子"--造血干祖细胞(haemopoietic stem progenitor cell,HSPC)、"造血土壤"--造血微环境(hemopoietic microenvironment,HM)、"造血肥料"--造血生长因子(hemopoietic growth factor,HGF)和"虫子"--造血相关的免疫调控(immunoregulation for hematopoiesis)等诸因素量和质及其相互协调功能的正常.其中某个环节或多个环节异常均可导致造血功能障碍,从而发生各类血细胞数量、质量异常和相应的临床症状.造血功能障碍分为原发性和继发性两大类--原发于造血系统的疾病和继发于疾病治疗相关的并发症以及遭受核爆炸、核恐怖袭击和放射源意外泄漏等突发事件导致的急性放射病.
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造血干细胞工程及其应用领域
造血干细胞(hematopoietic st em cell,HSC)的实验研究起始于20世纪50年代,60年代初获突破性进展,随着现代生物学技术的不断创新和发展,不仅在HSC的生物学特性、增殖分化调控机理和H SC的检测等基础研究方面取得重大进展,而且对HSC的临床应用也积累了不少资料.H SC工程即是利用HSC的生物学特征,通过细胞工程技术,在体外模拟或部分模拟体内造血过程,对分离纯化的造血干祖细胞进行体外扩增、定向诱导、功能激活与调控、目的基因转染等,终将造血细胞治疗广泛和有效的应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域.HSC是一种原始的造血细胞,它既能自我更新,又能产生所有造血细胞子代和某些非造血细胞.目前研究证明:HSC高度表达CD34、CDw90等抗原,缺乏CD33、C D38等相关抗原;具有人类白细胞抗原CD45RA高分子.可通过磁性分选和流式细胞术富集HSC.成年机体的HSC主要存在于骨髓内,外周血中也有少量HSC.此外,脐带血中也富含HSC.也可以在体外扩增和诱导胚胎干细胞,使其转化为HSC.利用造血干祖细胞的高度扩增能力以及各种造血生长因子对造血基质细胞的调控作用,可将分离得到的CS34-、CD38-的造血干祖细胞在SCF、IL-3、GM-CSF、EP O、Flt3/FLK2、TPO等因子的不同组合条件下大量扩增造血祖细胞和各阶段的功能细胞,以进行新一代细胞治疗.外周血、骨髓和脐带血HSC移植已广泛应用于治疗血液系统疾病、先天性遗传性疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤.而以HSC作为基因治疗的靶细胞,目前已用于耐药基因(mdr-1、dhfr、mgmt)导入以减少化疗药物对骨髓的毒性、某些遗传性疾病的治疗,如腺苷酸脱氢酶(ADA)缺乏症,β-地中海贫血 ,镰形贫血,SCID,Caucher's病和血友病等.
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内皮细胞对鼠骨髓造血细胞的增殖和分化作用
探索内皮细胞对小鼠骨髓造血细胞的刺激和诱导分化作用. 人脐静脉内皮细胞取自剖腹产后12hr以内的脐带.按Jaffe法进行培养,建立内皮细胞体外培养模型,收集原代培养的内皮细胞上清液(HECS).按本室常规方法制备骨髓有核细胞.在造血细胞半固体和液体培养体系中加入不同组合的重组造血因子,分为三组 :①粒系培养组加GM-CSF(德国BM公司),终浓度为20ng/ml.②红系培养组加入IL-3(美国SIGMA公司)与EPO(德国BM公司),终浓度分别为20ng/m l和2u/ml.③实验组加入内皮细胞培养上清液,以RPMI-1640为对照组.将上述体系接种于24孔板中,每孔1ml,培养7d,收集细胞,作细胞计数,台盼蓝拒染活力检测.细胞表面标记分析:选用抗红系或粒系的单克隆抗体CD71和CD13(美国 Coulter公司)作细胞表面标记检测.培养后细胞经PBS洗涤,取细胞悬液2～5 ×105细胞),加抗体1μl,4℃孵育30min,用PBS洗去没有标记上的抗体和FITC,重新悬浮细胞,用流式细胞仪(Coulter Elite Esp,美国Coulter公司)进行分析.用T检验分析实验数据以x±SD表示.结果:HECS对小鼠骨髓细胞形成各类造血祖细胞集落具有明显的刺激作用,能够提高BF U-E,CFU-E,CFU-GM集落产率,分别为43.04±5.80,148.7 5±32.20,104.67±9.92(P＜0.05);HECS诱导细胞7d后, 细胞表面表达CD13为93.75±5.38,CD71为59.95±7.10(P＜ 0.05).实验组与阳性对照组基本一致,阴性对照组无集落形成和抗体表达.内皮细胞不但能够促进造血干祖细胞的增殖并且能够诱导其定向分析.以往对骨髓细胞的体外培养均采用琼脂或甲基纤维素半固体培养的方法,在用流式细胞仪进行分析时,由于难以去除琼脂或甲基纤维素对实验的干扰,造成对细胞表面抗原标记的困难,影响了实验的准确性.本实验将小鼠骨髓细胞进行体外液体培养,同时加入不同组合的重组造血生长因子,诱导造血干祖细胞向红系和粒系分析,为流式细胞仪分析细胞特异性抗原的表达提供了新的途径.
