肿瘤血管生长抑制因子与肝细胞癌关系研究进展

血管生成抑制因子对于调控肿瘤的生物学行为和肿瘤的治疗方面具有重要的作用.血管生成受正、负调控因子的双重作用,目前发现的与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)有关的血管生成抑制因子有血管生成抑制素(AS)、内皮抑素(ES)、干扰素(IFN)、血小板反应素(TSP)、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、转化生长因子β1(TGFβ1)、白细胞介素12(IL 12)、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板因子4(PE4)及纤溶酶原抑制因子(PAI)等.其作用机制为:抑制内皮细胞的分裂和迁移,降低内皮细胞的活性,促进内皮细胞的凋亡或直接杀伤内皮细胞,干扰基底膜与内皮细胞的相互作用,抑制蛋白水解反应和内皮细胞的黏附运动,下调各种促血管生成因子的表达等.这些因子具有抗HCC血管生成治疗药物的潜在意义.

重组血管抑制剂CHM-Ⅰ对骨肉瘤的治疗作用

目的:观察重组人软骨调节素(chondromodulin,CHM)蛋白对骨肿瘤的治疗作用.方法:利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-Ⅰ基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中诱导表达和纯化重组人软骨调节素蛋白,将重组蛋白与人脐静脉上皮细胞或MG-63骨肉瘤细胞共培养,观察其对内皮细胞形成管样结构和MG-63骨肉瘤细胞生长的影响;将重组蛋白局部注射裸鼠皮下肿瘤,观察其对肿瘤形成的影响.结果:获得纯化的重组人软骨调节素蛋白,该蛋白在体外可以抑制血管内皮细胞管样结构的形成而对肿瘤细胞的生长无影响;重组蛋白瘤内注射可以抑制肿瘤在裸鼠体内的生长.结论:重组人软骨调节素蛋白通过抑制血管形成而抑制肿瘤生长,具有良好的临床应用价值.

抗原肽冲击Angiostatin修饰淋巴细胞对Siha细胞的体内外作用

血管生长抑制因子Kringle 5的发酵条件研究

确定了适合重组工程菌生长和血管生长抑制因子Kringle 5表达的培养基,并采用正交试验优化了重组工程菌的发酵条件.20L发酵罐中Kringle 5蛋白的终表达量为0.59g/L.

重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

目的:在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性.方法:采用PCR方法对编码人VEGI全基因进行修饰,获得编码成熟蛋白第29～174位氨基酸的C端胞外区基因片段,将PCR产物亚克隆到 pMD-18T中,经DNA测序证实后亚克隆入高表达载体pLOU-1,转化大肠杆菌BL21,获得高表达菌株.经IPTG诱导获得高表达,纯化表达产物并检测其对内皮细胞ECV304增殖的抑制活性 .结果:重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,约占细菌总蛋白的40%;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性.结论: 重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用,为研究其抗肿瘤作用打下了基础.

PEDF和VEGF在翼状胬肉组织中的不平衡表达

目的检测翼状胬肉组织中血管生长因子VEGF、FGF-2和抑制因子PEDF的表达,以研究PEDF在翼状胬肉发展中所起作用.方法用免疫荧光组化法及免疫印迹法对9例原发性翼状胬肉组织进行PEDF、VEGF及FGF-2的检测、分析,并与8例正常人结膜、角膜组织进行对照研究.结果PEDF在正常人结膜、角膜上皮中高表达,而在翼状胬肉组织中没有或弱表达.VEGF和FGF-2在翼状胬肉组织中高表达,而在正常人结膜、角膜组织中表达较弱.结论在翼状胬肉组织中血管生长抑制因子PEDF没有或弱表达,而血管生长因子VEGF和FGF-2高表达,提示两者不平衡表达引起纤维血管增生.

血管生长抑制因子与血小板内皮黏附分子34在肝细胞癌组织的表达及其临床意义

目的 观察血管生长抑制因子(AS)和血小板内皮黏附分子34(CD34)在肝细胞癌组织中的表达,探讨AS和CD34与肝细胞癌发生、发展及预后的相关性.方法 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测肝细胞癌组织中AS和微血管密度(MVD)的表达,并分析其与肝细胞癌临床病理特征之间的关系.结果 (1)正常肝组织AS阳性表达率为16.7％(2/12),肝细胞癌组织中其阳性表达率为58.0％ (29/50)(x2=6.150,P=0.002).结果表明,肝癌组织中AS呈过表达状态.(2)在12例正常肝组织组织、50例肝癌组织中,其相应的MVD分别为25.70±5.20和33.72±4.35,两者相比较差异有统计学意义(P=0.000).(3)肝细胞癌组织中AS的表达与患者的年龄(P=0.080)、性别(P=0.100)无明显相关性;而与肝癌组织的分化程度(P=0.000)、分期(P =0.002)、肿瘤直径(P =0.006)、门静脉是否受侵犯(P=0.000)以及AFP的表达水平显著相关(P=0.000);MVD与肿瘤组织分化程度(P=0.000)、分期(P =0.001)、肿瘤直径(P=0.002)、门静脉是否受侵犯(P=0.000),AFP的表达水平(P=0.000)明显相关.结论 AS在肝细胞癌中存在高表达,并且其和肝癌的分化程度、分期、肿瘤直径、门静脉是否受侵犯以及AFP的表达水平显著相关,进一步可产生抑制肝癌血管生成效应.

含凝血酶切点的 hTNFα -hPgnK5的原核表达及活性鉴定

目的在原核细胞中表达融合蛋白 hTNFα -hPgnK5并鉴定其活性。方法构建 hTNFα -hPgnK5基因的表达载体，并在大肠杆菌 DH5α中进行表达。以 MTT法测定该融合蛋白体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性。结果成功地构建了 hTNFα -hPgnK5表达载体并获得表达。免疫印迹分析表明，该融合蛋白具有 hPgnK5的免疫活性。体外实验表明 ,该融合蛋白具有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性。结论 hPgnK5蛋白可与 hTNFα可共同表达，表达产物可抑制肿瘤细胞和血管内皮细增殖。

软骨细胞培养液对鸡胚绒毛尿囊膜血管抑制效应的研究

目的检测软骨细胞培养液中是否存在抑制血管生长的因子。方法用酶消化、分离鸡胚关节软骨细胞，体外单层培养，收集细胞培养液。采用鸡胚绒毛尿囊膜实验检测该培养液对血管的抑制效应。结果加软骨细胞培养液的实验组血管数为2.75±0.99且血管较细、分支少；不加样的对照组血管数为4.5±1.08且血管较粗、分支多。两组有显著差异(P＜0.05)结论软骨细胞培养液具有抑制血管生长的作用。

pLXSN-HPVL2-Angiostatin的构建及转染T细胞淋巴瘤细胞系的体外杀伤活性研究

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)感染相关疾病既具靶向性又能阻断局部血管生长的基因治疗新途径.方法将血管生长抑制因子(angiostatin)及HPV抗原基因同时克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,用PA317细胞包装、筛选,建立高滴度的感染性重组病毒产生细胞系,以重组病毒转染T细胞淋巴瘤Hut-78细胞系,在体外观察其对HPV感染阳性宫颈癌细胞的杀伤活性.结果PCR及RT-PCR检测显示获得了pLXSN-HPVL2-Angiostatin,并成功转染Hut-78细胞系,镜下观察及MTT检测,显示了其对HPV阳性宫颈癌细胞的特异趋向及高杀伤活性.结论pLXSN-HPVL2-An-giostatin及其成功转染的Hut-78细胞系为进一步研究HPV感染相关疾病的基因治疗提供了新途径.

翼状胬肉组织PEDF和VEGF的不平衡表达

目的检测翼状胬肉组织中血管生长因子VEGF、FGF-2和抑制因子PEDF的表达,以研究PEDF在翼状胬肉发展中所起作用.方法用免疫荧光组化法对9例原发性翼状胬肉组织进行PEDF、VEGF及FGF-2的检测,并与8例正常人结膜组织进行对照研究.结果 PEDF在正常人结膜、角膜上皮中高表达,而在翼状胬肉组织中没有表达.VEGF和FGF-2在翼状胬肉组织中高表达,而在正常人结膜、角膜组织中表达较弱.结论在翼状胬肉组织中血管生长抑制因子PEDF没有表达,而血管生长因子VEGF和FGF-2高表达,提示两者不平衡引起纤维血管增殖.

血管生长抑制因子基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的:获得具有高活性的Angiostatin表达,为进一步研究及应用奠定物质基础.方法:用PCR法从人纤维蛋白酶原plasminogen基因中,获得Angiostatin(kringle1-4)基因,测序验证后,将正确的Angiostatin(K1-4)序列,插入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞sf9,表达Angiostatin.结果:获得了正确序列Angiostatin cDNA,并在Bac-to-Bac杆状病毒系统表达.结论:获得有抑制活性的Angiostatin表达.

人纤溶酶原饼环区5基因的化学合成与原核载体的构建

0 引言抑制肿瘤新生血管生长可以抑制肿瘤生长,这是目前肿瘤治疗中新发展的治疗途径. 血管生长抑制因子是由纤溶酶原中的前四个饼环区构成的,具有抑制肿瘤新生血管进而达到抑制肿瘤的作用[1]. 研究表明,纤溶酶原饼环区5(简称K5,下同),具有比血管生长抑制因子更佳的抑制肿瘤新生血管生长的作用[2]. 我们将人工合成的人纤溶酶原K5基因的8段核酸片段组成为一个完整的K5基因,并连入原核载体中获得成功.