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YC-1改善乏氧增强人肺腺癌A549细胞放射敏感性的体外研究
目的 探讨3-(5'-羟甲基-2’-呋喃基)-1-苯甲基吲唑(YC-1)对乏氧入肺腺癌A549细胞的放射增敏作用.方法 用噻唑蓝比色法检测YC-1对细胞增殖活性的影响,以及YC-1对细胞作用24h的20％药物抑制浓度(IC20).细胞克隆形成实验计算细胞存活分数,多靶单击模型拟合细胞存活曲线并计算放射增敏比(SER).流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期.结果 YC-1对A549细胞有增殖抑制作用,在一定剂量范围内呈时间一剂量依赖性.在常氧和乏氧培养24h下aIC20分别为16.7 μmol/L和39.2 μmol/L.乏氧加YC-1组的SERD0=1.11,SERDq=1.26.在乏氧培养下,YC-1联合单次2 Gy放射能明显促进A549细胞凋亡和G2 +M期阻滞[(30.17±1.21)％∶(15.44±0.96)％,P=0.000和(21.56±0.47)％∶(6.16±0.16)％,P=0.000].结论 YC-1对乏氧的A549细胞有放射增敏作用.
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内皮抑素对NSCLC细胞系中VEGF受体2表达的影响及其放射增敏效应机制研究
目的：研究内皮抑素对NSCLC细胞（人肺腺癌A549细胞、人肺鳞癌Calu?1细胞）中VEGF受体2（ VEGFR2）表达影响，并探索其放射增敏效应的可能机制。方法 CCK8法检测内皮抑素对细胞增殖抑制作用，计算24 h的20％药物抑制浓度（ IC20）；采用RT?PCR及蛋白印迹法检测各组VEGFR2、相关信号通路及HIF?1α mRNA与蛋白表达变化；克隆形成实验检测各组细胞放射敏感性，流式细胞术检测凋亡及周期分布。多样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用两样本均数t检验。结果经内皮抑素处理后，Calu?1细胞增殖活力明显下降（F＝50?36，P＜0?01），IC20＝296?5μg／ml；VEGFR2和HIF?1αmRNA与蛋白表达水平均受抑制（F＝25?43、10?44，P 值均＜0?05）；同时Akt、ERK 1／2和p38的蛋白磷酸化水平均减低（ F＝2?89、0?24、1?09，P值均＜0?05）；其放射增敏比为1?38；凋亡率、G2＋M期阻滞增加（ F＝44?15、104?24，P值均＜0?01）。此外，与Calu?1细胞相比，内皮抑素对A549细胞放射增敏比为1?09。结论内皮抑素能促进VEGFR2高表达Calu?1细胞凋亡并能增强放射敏感性，对低表达的A549细胞效果有限。
关键词： 内皮抑素 A549细胞系 Calu-1细胞系 血管内皮生长因子受体2 放射敏感性 -
Livin影响水疱口炎病毒诱导肺癌A549细胞凋亡效应的实验观察
目的 探讨Livin表达影响水疱口炎病毒(VSV)对肺癌A549细胞的促凋亡效应.方法 利用RNA干扰技术下调Livin在肿瘤细胞中的表达,通过Tunel染色观察VSV对肺癌A549细胞的凋亡效应,Western blot法检测Livin蛋白的表达,荧光定量法检测Caspase-3的活性.结果 VSV(感染复数=0.1 pfu/细胞)对A549细胞有促凋亡作用；抑制Livin的表达增强了VSV对A549细胞的促凋亡作用,增强了Caspase-3的活性.结论 Livin表达沉默后可能通过影响Caspase-3活性而增强了VSV对A549细胞的促凋亡效应.
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辐射对肿瘤微环境中Treg细胞及其相关因子的影响
目的 检测照射后与肺腺癌A549细胞共培养的淋巴细胞中调节性T细胞(Treg细胞)及其相关细胞因子和共刺激分子表达的变化,探讨辐射对肿瘤微环境中免疫耐受机制的影响.方法 分离人外周血淋巴细胞单独培养或与肺腺癌A549细胞进行共培养一段时间后,以6GyX射线进行照射,继续共培养一段时间后,以流式细胞术检测淋巴细胞中CD4+ CD25+、CD4+ CD25+FoxP3+、CD4+ CD25+ NrP1+不同亚组的百分数、共刺激分子ICOS和CTLA-4的表达情况;ELISA法检测培养体系上清中IL-10、TGF-β、IL-17的分泌量.结果 与照射前后单独培养组相比,相应条件下共培养组中CD4+ CD25+、CD4+ CD25+ FoxP3+、CD4+ CD25+ NrP1+、ICOS、CTLA-4、IL-10和TGF-β比例均增加(t=2.78 ～40.61,P＜0.05).而与照射前相比,照射后单独培养组和共培养组的CD4+ CD25+和CTLA-4比例增加(t=2.96、2.94、4.47、2.77,P＜0.05).细胞因子IL-17的表达量在肺腺癌A549细胞和X射线分别作用下无明显变化,但共同作用后会明显增加(t=4.00、4.71,P ＜0.05).结论 辐射刺激肺癌细胞肿瘤微环境中的CD4+ CD25+Treg细胞亚组及其相关CTLA-4和IL-17的表达,诱导肿瘤微环境中的免疫耐受作用.
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rsTRAIL诱导人肺癌细胞系A549的细胞凋亡表达谱变化研究
目的研究一定量的重组可溶性TRAIL作用于人肺癌系A549细胞培养物后,细胞凋亡基因表达谱变化.方法用50μg·L-1的rsTRAIL处理人肺癌系A549细胞培养物,以未经药物处理的A549细胞培养物为对照,应用基因表达谱芯片技术进行细胞凋亡相关基因mRNA表达差异分析.结果经TRAIL处理后,所检测的96个细胞凋亡相关基因中,21个基因表达上调,17个基因表达水平下调.结论经TRAIL处理后,通过细胞凋亡相关的功能基因组群基因表达的正负调控,对人肺癌系A549细胞凋亡信号传导途径进行调控.药物处理不影响p53基因的表达变化.
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重组TRAIL诱导肺腺癌细胞系细胞凋亡的实验研究
目的 研究重组可溶性TRAIL作用于人肺癌系A549细胞培养物后,细胞凋亡的形态变化和凋亡率测定.方法 MTT比色法测定重组TRAIL对肺腺癌A549细胞的生长抑制率.TRAIL处理前后细胞核、质的形态学变化.经不同浓度重组TRAIL处理后A549细胞的双色荧光变化.定量重组TRAIL与亚毒性浓度的CDDP联合使用,对肺腺癌A549细胞生长抑制率和凋亡率的影响.结果 重组TRAIL对A549细胞生长有明显的抑制作用,TRAIL 100 μg·L-1作用24 h后,抑制率达到41.6%.细胞形态学观察显示,A549肺腺癌细胞经50 μg·L-1TRAIL处理24 h后,可观察到典型的细胞凋亡特点.3.3 mg·L-1的CDDP与50 μg·L-1重组TRAIL合用,A549细胞凋亡率高达75.2%.结论 重组TRAIL具有明显的诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡的作用;化疗药物CDDP能加强重组TRAIL的抗肿瘤活性.
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斑蝥酸钠维生素B6注射液对人肺癌细胞系A549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影响
目的 探讨斑蝥酸钠(SC)维生素B6注射液对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡及核因子κB(NF-κB)、凋亡分子Caspase3/7的影响.方法 用不同浓度(0、1.0、2.5、5.0 mg/L)的SC维生素B6注射液处理A549细胞,观察光镜及Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡形态;用噻唑蓝(MTT)比色法检测SC维生素B6注射液对细胞增殖的抑制作用;罗丹明123检测线粒体膜电位;Caspase3/7活性检测试剂盒检测Caspase3/7活性;蛋白印迹检测NF-κB P65、I-κB 蛋白表达.结果 SC维生素B6注射液对A549细胞的体外增殖有明显抑制作用,细胞形态出现明显凋亡改变,5.0 mg/L组作用A549细胞72 h后,细胞增殖抑制率大达到67.37%.细胞线粒体膜电位检测结果显示,随着SC维生素B6注射液浓度的增加及时间的延长,线粒体膜电位逐渐减弱,同时Caspase3/7蛋白活性增强;SC维生素B6注射液作用A549细胞后NF-κB P65蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),而I-κB蛋白表达水平则无显著变化.结论 SC维生素B6注射液可能通过抑制NF-κB P65表达,激活Caspase-3/7活性,从而抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡.
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Testin在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响
目的:探讨Testin基因(TES)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞株中的表达及其对人肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响.方法:收集2015年1月至2015年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院手术切除的27例NSCLC患者的癌组织及癌旁组织标本,用Western blotting法检测癌组织和癌旁组织,以及正常人胚肺成纤维细胞株MRC5和肺癌细胞株A427、A549、H1299、LK2、PC9和SW900中TES蛋白的表达水平.应用短发卡RNA(shRNA)瞬时转染肺癌细胞株A549干扰TES基因的表达,并进一步检测TES低表达对A549细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响,同时检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cas-pase-3的表达.结果:在NSCLC组织和细胞株中TES蛋白的表达明显下降(均P＜0.05).shTES干扰A549细胞后,TES mRNA和蛋白表达水平均显著下降(均P＜0.05).抑制TES表达显著增强A549细胞的增殖[(2.75±0.04) vs (1.79±0.06),P＜0.05]、迁移[(52.3±2.6)％s(19.7±1.4)%,P＜0.05]和侵袭能力[(31.2±3.9)％vs(14.5±4.1)％,P＜0.05],同时降低了细胞凋亡率[(8.2±1.1)％s(23.1±1.7)％,P＜0.05].TES低表达使A549细胞Bax和Caspase-3蛋白表达明显下降(P＜0.05)、Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05).结论:TES在NSCLC组织中呈低表达,TES表达下调具有促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡等生物学效应,其有可能成为肺癌治疗一个新靶点.
关键词： 非小细胞肺癌 A549细胞系 Testin(TES)基因 RNA干扰 -
唑来膦酸对肺腺癌细胞的生长及化疗敏感性研究
目的:本研究主要探讨第三代双磷酸盐类药物唑来膦酸在体外对人肺腺癌细胞株A549生长的影响,进一步研究唑来膦酸与顺铂(DDP)对A549细胞的生长抑制是否具有协同作用.方法:采用MTr法检测不同剂量的唑来膦酸对人肺癌细胞株A549的生长作用,检测唑来膦酸单药及联合DDP对人肺腺癌细胞A549的增殖抑制,采用流式细胞术分析唑来膦酸联合DDP对细胞周期及凋亡的影响.结果:唑来膦酸对A549细胞的抑制效应与药物剂量及作用时间均成正比.单用唑来膦酸(1、10μmol/L)对A549细胞的生长抑制率分别为(20.69±2.69)%、(44.05±4.03)%,单用DDP(0.5 mg/L)组的抑制率为(13.58±3.13)%.唑来膦酸(1、10μmol/L)联合DDP(0.5 mg/L)作用A549细胞72 h时,对A549细胞的生长抑制率分别为(44.23±3.77)%、(60.9±3.03)%,联合用药组与单药组相比差异有显著性(P＜0.01).唑来膦酸作用A549细胞72 h的IC50值为25 μmol/L.流式细胞术分析显示,单用唑来膦酸(1、10 μmol/L)的细胞凋亡率分别为(16.94±1.95)%、(24.03±0.44)%,单用DDP(0.5 mg/L)组的细胞凋亡率为(9.08±1.31)%.唑来膦酸(1、10 μmol/L)联合DDP(0.5 mg/L)时,引起的细胞凋亡率分别为(32.22±1.68)%、(39.22±7.00)%,联合用药组的凋亡率明显高于单药组(P＜0.01).唑来膦酸单药或者联合DDP均表现将A549细胞明显阻滞于S期(DNA合成期).结论:唑来膦酸对肺癌细胞株有生长抑制作用,呈时间、剂量依赖性效应,其IC50值为25 μmol/L.唑来膦酸可以干扰DNA合成,与DDP有协同作用.
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树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体内外抗肺癌的实验效应研究
目的 探讨树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在体内外对肺癌的影响.方法 正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM-CSF,IL-4及TNF-a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN-g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物,作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养(DC+CIK,负载抗原的DC+CIK),以CIK细胞单独培养作为对照.用流式细胞仪分析细胞表型,自体混合淋巴细胞反应和异体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的的增殖活性.Cytotoxicity TOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性,同时用A549细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肺癌活性.结果 在培养的第15d,与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[(23.4±2.3)倍vs(16.7±2.7)倍,P<0.05],CD3+CD56+细胞表达水平也明显提高,[(64.3±3.6)%vs(43.9±2.1)%,P<0.05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强,体内实验显示,与单独培养的CIK细胞相比,与负载抗原的DC共同培养的CIK,可明显抑制接种瘤细胞的裸鼠成瘤率,DC+CIK与负载抗原的DC+CIK在抗六效应上没有明显差异.结论 DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK体内抗肺癌的活性.将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略.
关键词： 树突状细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 A549细胞系 肺癌 -
树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体外抗肺癌的实验研究
目的 探讨树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在体内外能否有效的抗肺癌.方法 正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM-CSF,IL-4及TNF-a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN-g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物,作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养(DC+CIK,负载抗原的DC+CIK),以CIK细胞单独培养作为对照.Cytotoxi-city TOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性.结果 在培养的第15d,与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[(23.4±2.3)倍vs(16.7±2.7)倍,P<0.05],CD3++CD56+细胞表达水平也明显提高,[(64.3±3.6)%vs(43.9±2.1)%,P<0.05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强.结论 DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK抗肺癌的活性,将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略.
关键词： 树突状细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 A549细胞系 肺癌 -
脱氢抗坏血酸在重铬酸钾对A549细胞毒性效应中的作用
铬在自然界中分布广泛,六价铬[Cr(Ⅵ)]已被证实具有致癌性,其所致的肺癌是8种职业性肿瘤之一.有研究[1-3]表明,活体细胞内90%的抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)参与Cr(Ⅵ)的还原代谢,且是Cr(Ⅵ)的主要还原剂.机体肺细胞内Asc的平均水平为1.3 mmol/L[4],但在体外细胞培养中含量却非常低[5-6],脱氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid,DHA)孵育可以使细胞内氧化形成Asc,使其达到或接近机体正常生理浓度[7].Reynolds等[8]发现DHA孵育H460和IMR90细胞90 min后,再用Cr(Ⅵ)染毒细胞,细胞的急性毒性增强.作者用DHA孵育A549细胞后,观察重铬酸钾(K2Cr2O7)对A549细胞的增殖及毒性作用,探讨DHA在K2Cr2O7致A549细胞损伤中的作用.
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咳尔康颗粒对肺腺癌细胞A549的体外抗肿瘤作用
目的 制备咳尔康颗粒并观察其对人肺腺癌细胞A549的体外抗肿瘤作用.方法 将处方药材经水提取,减压浓缩,用淀粉和糊精为辅料制备咳尔康颗粒.以黄芩苷为指认成分,采用高效液相色谱(HPLC)法建立咳尔康颗粒质量控制标准.以不同浓度的咳尔康颗粒溶液作用于肿瘤细胞A549,光学显微镜观察细胞形态,4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色后荧光显微镜观察细胞核固缩的凋亡过程,噻唑蓝(MTT)实验测定细胞增殖,实时定量聚合酶链反应(PCR)测定c-myc、c-fos、bax/bcl-2和caspase-9基因mRNA表达.结果 制得咳尔康颗粒并建立HPLC质量控制标准,线性回归系数(r)为0.9929,平均加样回收率为98.03％,RSD为2.571％,指认成分黄芩苷含量为0.3498‰.咳尔康颗粒作用于肿瘤细胞A549后,细胞形态出现体积缩小,与周围的细胞脱离,核质浓缩,核膜破碎,终形成凋亡小体;细胞增殖受到剂量依赖性抑制,半数抑制浓度(IC50)为74.07 g?L-1;原癌基因c-myc和c-fos的mRNA表达量降低,凋亡基因bax/bcl-2和caspase-9的mRNA表达量增加.结论 咳尔康颗粒具有体外抗肿瘤作用.
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RBM5基因表达载体构建、稳定转染A549细胞系的建立及功能的初步研究
目的:通过构建表达载体、建立稳定转染RN结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系,初步研究RBM5基因过表达对A549细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表达的影响.方法:应用分段克隆法构建pcDNA3.1 (+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别检测经pcDNA3.1 (+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1 (+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1 (+)/RBM5-A549和pcDNA3.1 (+)-A549细胞中剪接相关因子DHX15的表达情况.结果:成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过表达阳性细胞株;pcDNA3.1 (+)/RBM5-A549较pcDNA3.1 (+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均P＜0.01);cDNA3.1 (+)/RBM5-A549较pcDNA3.1 (+)-A549细胞的DHX15表达上调(P＜0.01).结论:成功构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细胞周期,并使DHX15表达上调.
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慢性阻塞性肺疾病急性加重患者中副流感嗜血杆菌基因型分布及对气道上皮细胞的影响
目的 研究慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)患者中不同基因型副流感嗜血杆菌(HPI)的分布及其对气道上皮细胞株A549的影响.方法 以2010年至2011年间中山大学附属第三医院住院的AECOPD患者为研究对象,采集痰标本培养HPI,所得菌株采用随机引物聚合酶链反应(RAPD)进行基因分型,并与气道上皮细胞株A549共同培养,作用不同时间后取细胞培养上清行白细胞介素6(IL-6)、IL-8的检测,并通过显微镜观察细胞形态变化.结果 入组80例AECOPD患者,按症状分为3型,共培养HPI 15株,培养阳性率18.8％.1型与3型两组间细菌阳性率比较有显著差异.所得菌株与A549上皮细胞共培养后IL-8、IL-6分泌水平均较对照组明显升高,且与时间呈正相关.所得菌株采用RAPD法可分为4种基因型,RAPDⅢ型与A549上皮细胞共培养后,12 h和24 h的IL-8分泌水平均高出其他组.各组经显微镜观察均未见明显细胞形态学变化,且HPI未进入细胞.结论 不同临床类型AECOPD患者痰HPI培养阳性率不同.HPI无法进入气道上皮细胞胞内,可能是胞外感染菌,但能够引起气道上皮细胞炎症因子表达持续升高,而且不同基因型毒力不同.HPI可能是COPD急性加重的致病菌之一.
关键词： 慢性阻塞性肺疾病急性加重 副流感嗜血杆菌 A549细胞系 基因型 炎症 -
苦参素对人肺癌A549细胞增殖及caspase3/7蛋白活性的影响
目的 研究不同浓度的苦参素对人肺癌A549细胞增殖及凋亡执行分子caspase3/7蛋白活性的影响.方法 体外复苏与培养人肺癌A549细胞,用不同浓度(0、0.5、1、2 g/L)的苦参素处理A549细胞24、48、72 h,用噻唑蓝(MTT)比色法检测苦参素对A549细胞增殖的抑制作用,比色法检测培养液中caspase3/7活性.结果 苦参素对A549细胞的增殖抑制率呈时间、剂量依赖性；随苦参素浓度的增高及时间的延长,caspase3/7蛋白活性增强(P＜0.05).结论 苦参素对人肺癌A549细胞的增殖有明显抑制作用,可能与激活caspase3/7活性,促进细胞凋亡有关.
关键词： 苦参素 A549细胞系 Caspase3/7 -
TTF-1基因过表达慢病毒重组载体的构建及TTF-1过表达A549细胞系的建立
目的 构建甲状腺转录因子-1(TTF-1)基因过表达慢病毒重组载体并感染人肺腺癌A549细胞株,建立TTF-1基因过表达的A549细胞系,为进一步研究TTF-1在肺腺癌中的作用机制奠定基础.方法 采用PCR拼接TTF-1的cDNA寡核苷酸序列,连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro,转化至感受态细胞DH-5α,测序鉴定;将携带TTF-1基因的慢病毒过表达载体转染至293T细胞,经包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并感染A549细胞,构建稳定表达TTF-1基因的肺腺癌A549细胞系.结果 测序结果显示,TTF-1基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-TTF1-EF1-CopGFP-T2A-puro构建成功,测序结果正确;经包装所得病毒上清液滴度为6×107 TU/mL,稳定转染的细胞系在荧光显微镜下可见GFP表达;PCR结果显示,A549细胞转染组中TTF-1基因表达量比未转染组提高了381倍.结论 成功克隆、扩增TTF-1基因,并建立其慢病毒表达系统,构建了稳定过表达TTF-1基因的人肺腺癌A549细胞系.
