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5-氮-2'-脱氧胞苷逆转人非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性
目的 探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dc)逆转耐顺铂(DDP)的A549/DDP细胞对DDP的耐药性及其可能的机制.方法 以耐DDP的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549/DDP为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测5-Aza-de对A549/DDP细胞的毒性作用和对A549/DDP细胞的耐药逆转指数(RI);采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测5-Aza-de干预前后的A549/DDP细胞hMLH1基因启动子甲基化状态和基因表达情况.结果 20 μmol/L 5-Aza-dc(无毒剂量组)和40 μmol/L5-Aza-dc(低毒剂量组)干预A549/DDP细胞48 h后,其R1分别为1.82和4.42.MSP结果显示,A549/DDP细胞中,hMLH1基因启动子区呈部分甲基化状态;经无毒和低毒剂量5-Aza-dc处理A549/DDP细胞48 h后,hMLH1基因启动子区发生DNA去甲基化.无毒剂量组和低毒剂量组的hMLH1 mRNA相对表达量分别为2.05±0.08和2.00±0.03,hMLHl蛋白相对表达鼍分别为1.74±0.14和1.65±0.11.结论 5-Aza-dc能部分逆转A549/DDP细胞的DDP耐药,其机制可能与去除hMLH1基因启动子甲基化、上调其基因表达有关.
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5-Aza-dC在肺癌细胞系中去甲基化作用机制
目的：研究5-Aza-dC对肺癌细胞系中的去甲基化的作用。方法对正常肺细胞以及5-Aza-dC分组处理的A 549、NCI-H 520甲基化特异性PCR和RT-PCR定量检测。结果未处理的A 549和NCI-H 520细胞中TFPI-2表现出完全甲基化特异性。而经过5-Aza-dC处理过的肺癌细胞系细胞则表现出不完全甲基化状态，并呈现出量效关系。A 549和NCI-H 520细胞在经5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA表达均明显高于未处理组，差异具有统计学意义（P<0.05）；并呈现出量效关系。结论5-Aza-dC对肺癌细胞中的TFPI-2基因具有去甲基化作用，并具有量效关系。
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正常上皮细胞特异性-1基因在胃癌细胞株中的表达及甲基化调控
目的:研究正常上皮细胞特异性-1(NES1)基因表达及其CpG岛甲基化状况与胃癌的关系.方法:分别培养胃癌细胞MKN-28(高分化)、SGC-7901、AGS(均中分化)、MKN-45(低分化)、HGC-27(未分化)和原代正常胃上皮细胞.提取细胞RNA,经RT-PCR检测NES1在各细胞株中的表达.以不同浓度DNA去甲基化抑制剂5-aza-dc处理胃癌细胞,RT-PCR检测其NES1 mRNA表达.提取细胞基因组DNA,甲基化修饰后MSP分析其CpG岛甲基化状态.结果:各肿瘤细胞株中NES1 mRNA表达较胃正常上皮细胞有不同程度降低.甲基化检测显示NES1表达减少的胃癌细胞株均存在不同程度的NES1基因外显子3 CpG岛甲基化.NES1表达降低的胃癌细胞株经5-aza-d处理后NES1表达上调.结论:NES1胃癌细胞株中低表达,表达下调与该基因外显子3周围CpG岛甲基化有关.5-aza-dc可使NES1表达降低的胃癌细胞株重新表达NES1 mRNA.提示NES1基因CpG岛甲基化可能是NES1在胃癌细胞系中表达缺失的分子机制.
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癌相关基因在结肠癌中的表达及其甲基化调控
目的探讨癌相关基因APC、p16INK4A、p21WAF1和c-myc等在结肠癌中的表达及其受甲基化的调控.方法培养结肠癌细胞SW1116、Colo-320、HT29,分别用不同浓度的5-aza-dC干预细胞.提取细胞的RNA,用RT-PCR的方法检测p16INK4A、p21WAF1、APC和c-myc等多种基因的表达情况;同时以流式细胞仪分析SW1116和Colo-320的细胞周期.结果(1)三种细胞在干预前有较弱的p16INK4A和APC的表达,而在用5-aza-dC干预后表达增强,且在不同的结肠癌细胞株5-aza-dC作用发挥佳的时间与浓度不同.(2)p21WAF1在干预前后均不表达,c-myc在干预前后表达无明显变化.结论三株人结肠癌细胞中,5-aza-dC均可诱导p16INK4A和APC的表达,但对p21WAF1和c-myc无明显影响.
关键词： 结肠癌细胞系 5-Aza-dc DNA甲基化 p16INK4A基因 APC基因 -
5-氮脱氧胞苷及曲古抑菌素A影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性及浓度依赖性
目的:探讨甲基转移酶抑制剂--5-氮脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)和组蛋白去乙酰基酶抑制剂--曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)影响供核细胞H19基因表达的时间依赖性和浓度依赖性.方法:用不同浓度5-aza-dC及TSA按不同作用时间处理供核细胞(鼠尾尖成纤维样细胞),利用实时定量PCR法检测处理后H19基因的表达.结果:不同浓度的5-aza-dC处理组之间H19的表达无明显差异,但延长作用时间可使H19表达增强;TSA使H19的表达下降,但无时间依赖性.结论:长时间低浓度的5-aza-dC能增强供核细胞中H19基因的表达,而TSA则使H19的表达减弱,为体细胞克隆中表观遗传修饰抑制剂的选择及后续基因印迹研究提供了依据.
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曲古菌素A联合5-氮基-2-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞生长及其TESTIN基因表达的影响
目的 探讨曲古菌素A(TSA)联合5-氮基-2-脱氧胞苷(5-aza-dC)对人胃癌细胞(SGC-7901)生长及其TESTIN(TES)基因表达的影响.方法 将实验分为空白对照组(不加任何药物处理)、TSA(150 ng/ml)、5-aza-dC(5μmol/L)、TSA(150 ng/ml)+5-aza-dC(5μmol/L)共4组,用MTT法测定各组药物作用对SGC-7901细胞生长的影响,用流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V/PI检测细胞凋亡,RT-PCR分析SGC-7901细胞TESmRNA表达.结果 曲古菌素A和(或)5-aza-dC分别作用24 h、48 h、72 h后均能抑制细胞生长,联合组较单药组抑制率显著增强,且随着药物作用时间的延长,抑制率增强更明显;流式细胞仪分析及AnnexinV/PI凋亡检测发现干预胃癌细胞48 h后,联合组G0/G1期比率为(85.23±2.17)%,较单药组显著增多(P<0.05);同时诱导细胞凋亡,联合组细胞凋亡率达到(32±3.25)%.比单药组明显增加(P<0.05);TSA和(或)5-aza-dC干预胃癌细胞48 h后,联合组较单药组显著增强TESmRNA的表达(P<0.05).结论 曲古菌素A联合5-aza-dC干预可抑制SGC-7901细胞生长,阻止细胞周期于G0/G1期并促进细胞凋亡,抑癌基因TESmRNA表达增多均较单药组明显.
关键词： 曲古菌素A 5-Aza-dc SGC-7901细胞 Testin基因 -
5-Aza-dC和TSA对肝细胞癌细胞株中3-OST-2甲基化和基因表达的影响
目的 探讨5-Aza-dC和TSA对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中3-OST-2甲基化水平、基因表达以及对核转录因子UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1,也称为ICBP90/NP95)表达的影响.方法 采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法检测药物作用前后HCC细胞株中3-OST-2甲基化的状态改变;采用实时荧光定量RT-PCR法检测3-OST-2和UHRF1 mRNA的表达变化;采用细胞爬片免疫组化法检测UHRF1蛋白表达.结果 3-OST-2在HCC细胞株中呈完全甲基化状态,5-Aza-dC或TSA均能部分逆转3-OST-2甲基化,其mRNA表达分别增加2.7倍和4.9倍,两种药物联合处理后,3-OST-2甲基化被完全逆转,其mRNA表达增加9.1倍.5-Aza-dC或TSA均能降低UHRF1 mRNA和蛋白的表达,TSA比5-Aza-dC疗效更好(P<0.01),两种药物联用具有协同作用(P<0.01).结论 启动子甲基化和组蛋白修饰共同导致3-OST-2基因表达降低.5-Aza-dC和TSA单独作用均能部分逆转3-OST-2甲基化,增加其mRNA表达,抑制核蛋白UHRF1表达可能是其中机制之一.
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5-Aza-dC在肺癌细胞系中作用机制研究
目的：研究5-Aza-dC对肺癌细胞的作用机制。方法对正常肺细胞以及5-Aza-dC分组处理的A549细胞进行MTT检测，并检测TFPI-2基因甲基因以及蛋白表达水平。结果与未经5-Aza-dC处理的A549细胞相比，经5-Aza-dC处理后的A549细胞的凋亡率明显增高，并呈量效关系，RT-PCR检测发现，经5-Aza-dC处理的A549细胞其TFPI-2基因及蛋白表达与对照组相比，有明显的增高，并也呈现出量效关系。结论5-Aza-dC可通过促进TFPI-2在细胞中的表达对肺癌细胞的生长进行抑制。
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甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控
目的 探讨FHIT在子宫颈癌发生中的作用及FHIT基因失活的机制.方法 培养宫颈癌细胞C-33A、HeLa、CasKi、SiHa 及人脐静脉血管内皮细胞ECV-304,进行5-aza-dC干预前后FHIT基因在5株细胞中的甲基化分析,并通过逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光化学染色方法检测5-aza-dC干预前后FHIT基因在5株细胞中的表达.结果 4种宫颈癌细胞均存在FHIT基因的甲基化,正常对照细胞ECV-304在5-aza-dC干预前后均未见明显FHIT基因扩增产物.4株宫颈癌细胞在5-aza-dC化学干预前均未见明显FHIT的荧光着色,而干预后的细胞胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强,尤其在10-6M及2×10-6M干预浓度下的表达强(P＜0.05);干预48 h、72 h后FHIT 的表达与干预24 h的类似.ECV-304细胞在5-aza-dC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达,其表达强度之间无明显差异(P＞0.05).结论 FHIT基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件,甲基化可能是FHIT 基因沉默及宫颈癌发生的重要机制.
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肺癌细胞株APC基因启动子甲基化对其转录的影响
背景与目的:抑癌基因家族性腺瘤样结肠息肉病易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)启动子区的高甲基化在很多肿瘤中被发现,与这些肿瘤的发生发展相关.本实验室在肺癌患者肿瘤组织中检测到APC甲基化率达47%,为了研究其在肺癌细胞株中的甲基化情况,并进一步了解甲基化对其转录的影响,本研究检测了3株肺癌细胞的抑癌基因APC启动子甲基化状态及其对该基因转录水平的影响.方法:提取3株肺癌细胞株(肺腺癌细胞株SPC-A1、小细胞肺癌细胞株NCI-H446、大细胞肺癌细胞株NCI-H460)的DNA,以经转甲基处理和未做处理的脐带血DNA为阳性、阴性对照,亚硫酸氢盐化学修饰后,用甲基化特异性基因扩增(methylation specific-polymerase chain reaction,MSP)和甲基化基因芯片对APC基因启动子1A CpG岛甲基化进行研究,并用实时荧光定量PCR(real time-polymerase chain reaction)技术,以Sybr-GreenⅠ为荧光染料,β-actin基因为内参照,检测mRNA转录;对甲基化阳性的NCI-H460细胞,分别用1、5、10、15 μmol/L的5'-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(5-aza-2-deoxycytidine,5-aza-dC)试剂进行脱甲基化,提取RNA,荧光定量检测其转录变化.结果:SPC-A1和NCI-H446细胞APC甲基化阴性,NCI-H460细胞APC甲基化阳性;甲基化芯片检测NCI-H460细胞在APC启动子1A 5个CpG位点均存在甲基化(687、707、714、719、726),SPC-A1和NCI-H446甲基化阴性,荧光定量结果NCI-H460的APC转录较SPC-A1和NCI-H446有明显的下降,仅为二者平均的30.04%;经5-aza-dC脱甲基化作用后,NCI-H460细胞的APC表达增加了约5～10倍,其中10 μmol/L浓度作用下,APC表达增加多.结论:肺癌细胞株NCI-H460中存在APC基因高甲基化,5-aza-dC脱甲基化试剂可以激活其转录.
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5－氮杂－2＇－脱氧胞苷对宫颈癌细胞的基因表达调控
目的：探讨5－氮杂－2＇－脱氧胞苷（5－Aza－dC）对宫颈癌细胞p16和MGMT基因表达的调控作用。方法：用5－Aza－dC 处理4种宫颈癌细胞（HeLa、SiHa、C33A 和 CaSki）后，MSP 检测抑癌基因 P16和 MGMT的甲基化变化，并用荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 P16和 MGMT 的表达情况，同时用 MTT 和 Annexin V－FITC／PI双染检测细胞增殖和凋亡。结果：P16和MGMT在4种宫颈癌细胞中均存在甲基化。用5－Aza－dC处理细胞后，甲基化程度均被逆转。5－Aza－dC抑制P16和MGMT在宫颈癌细胞中的表达。5－Aza－dC抑制宫颈癌细胞的增殖并促进其凋亡。结论：P16和MGMT虽在宫颈癌细胞中存在甲基化，但其表达程度仍然较高，推测P16和MGMT的表达调控可能还受其他因素的影响。5－Aza－dC能抑制宫颈癌细胞的生长。5－Aza－dC虽然可以使宫颈癌细胞中P16和MGMT的甲基化程度得到逆转，但对P16和MGMT的表达却是抑制的，尚需更多实验验证并发掘其原因及机制。
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紫杉醇联合5-Aza-dC对非小细胞肺癌细胞NCI-H446生长抑制作用的研究
目的：探讨紫杉醇(PAC)联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对非小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖迁徙及侵袭能力的影响。方法将人小细胞肺癌细胞NCI-H446给予紫杉醇及5-Aza-dC干预处理，根据药物干预方式的不同分为对照组、紫杉醇组及联合用药组；应用CCK-8法检测各组NCI-H446细胞增殖能力的差异；划痕实验和Transwell实验检测各组NCI-H446细胞迁移和侵袭能力的差异。结果 CCK-8结果显示PAC及5-Aza-dC均可抑制NCI-H446细胞的增殖活性，且呈时间依赖性。48 h后紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的增殖能力较对照组明显减弱(P<0.01)；划痕实验结果显示划痕形成24 h后，对照组划痕愈合率为(69.15±0.837)%。而在紫杉醇组划痕处愈合率为(47.30±0.783)%；联合用药组划痕愈合率为(43.45±0.862)%。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞在迁移能力方面较对照组差异有统计学意义(P<0.01)；Transwell实验结果显示对照组NCI-H446细胞转染穿过基质胶的细胞数量为(151.4±6.88)个，紫杉醇组为(66.8±5.17)个，联合用药组为(40.2±4.55)个。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的侵袭能力较对照组差异有统计学意义(P<0.01)。结论5-Aza-dC作为化疗增敏剂可增加非小细胞肺癌细胞NCI-H446对紫杉醇的敏感性，从而提高紫杉醇对非小细胞肺癌的化疗效果。
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宫颈癌细胞系中RASSF2A基因启动子区甲基化状态的研究
目的：拟通过检测4株不同宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、SiHa和C33A中RASSF2A基因启动子区甲基化水平，以及分析去甲基化前后RASSF2A基因mRNA和蛋白表达水平、甲基化状态及细胞生物活性的变化，探讨宫颈癌发生的可能机制及治疗对策。方法采用实时定量聚合酶链反应方法检测去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-dC）作用前后RASSF2A基因的表达；甲基化特异性PCR（MSP）法检测4株宫颈癌细胞系中RASSF2A启动子区甲基化状态；免疫细胞化学方法检测RASSF2A基因表达变化，并用MTT法和流式细胞术观察细胞生物活性的变化。结果宫颈癌细胞系HeLa和SiHa表现为完全甲基化状态，细胞系CaSki和C33A表现为部分甲基化状态。5-aza-dC可使宫颈癌细胞系部分去甲基化，并使RASSF2A基因在宫颈癌细胞中mRNA和蛋白水平表达均显著升高。通过对宫颈癌细胞系HeLa的生物学行为检测发现，通过5-aza-dC的诱导作用，其增殖能力和抗凋亡能力明显下降。结论甲基化是导致宫颈癌细胞中RASSF2A基因表达缺失或降低的重要原因之一。去甲基化药物5-aza-dC能够逆转宫颈癌细胞系RASSF2A基因启动子异常甲基化水平，提高RASSF2A基因的mRNA和蛋白表达水平，提示RASSF2A基因的甲基化水平可以作为评估去甲基化干预是否有效的分子学标志物，为宫颈癌的临床治疗提供新的分子靶点。
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5-Aza-dC及TSA对人小细胞肺癌细胞系中ILMLH-1基因表达的影响
目的:探讨5-Aza-dC及TSA对人小细胞肺癌细胞系中抑癌基因基因表达的影响.方法:5-Aza-dC及TSA处理体外培养的人小细胞肺癌细胞系NCI-H446,应用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测人小细胞肺癌细胞系NCI-H446药物干预前后抑癌基因hMH-1表达情况的变化.结果:NCI-H446细胞系经TSA,5-Aza-dC及联合作用后使原来不表达的抑癌基因hMLH-1重新表达或表达增强.结论:hMLH-1基因的异常甲基化是肺癌发生、发展过程中的频繁事件.肺癌细胞系中抑癌基因hMLH-1启动子甲基化可能是导致其基因失活的主要原因,5-Aza-dC单独作用和15-Aza-dC及TSA联合应用效果相似,均能显著增强甲基化的肿瘤抑制基因的重新表达.
